Den nuværende protokol kombinerer ex vivo-stimulering og flowcytometri til analyse af polyfunktionelle T-celleprofiler (TPF) i mononukleære celler (PBMC’er) i perifert blod mononukleære celler (PBMC’er) hos japanske encephalitisvirus (JEV)-vaccinerede børn. Detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF’er blev testet for at give en reference til lignende undersøgelser.
T-cellemedieret immunitet spiller en vigtig rolle i bekæmpelsen af flavivirusinfektion, enten efter vaccination eller efter naturlig infektion. “Kvaliteten” af en T-celle skal vurderes efter funktion, og højere funktion er forbundet med mere kraftfuld immunbeskyttelse. T-celler, der samtidig kan producere to eller flere cytokiner eller kemokiner på enkeltcelleniveau, kaldes polyfunktionelle T-celler (TPF’er), som medierer immunresponser gennem en række molekylære mekanismer til at udtrykke degranulationsmarkører (CD107a) og udskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2 eller makrofaginflammatorisk protein (MIP)-1α. Der er stigende tegn på, at TPFer tæt forbundet med opretholdelsen af langvarig immunhukommelse og beskyttelse, og at deres øgede andel er en vigtig markør for beskyttende immunitet og er vigtig for effektiv kontrol af virusinfektion og reaktivering. Denne evaluering gælder ikke kun for specifikke immunresponser, men også for vurderingen af krydsreaktive immunresponser. Her, idet man tog den japanske encephalitisvirus (JEV) som et eksempel, blev detektionsmetoden og flowcytometrifarveskemaet for JEV-specifikke TPF’erproduceret af mononukleære celler i perifert blod af børn vaccineret mod japansk encephalitis testet for at give en reference til lignende undersøgelser.
Japansk encephalitisvirus (JEV) er en vigtig myggebåren virus, der tilhører slægten Flavivirus inden for Flaviviridae-familien 1. Mange lande i Asien og Stillehavsområdet har længe stået over for enorme folkesundhedsudfordringer på grund af den enorme sygdomsbyrde forårsaget af japansk encephalitis (JE), men dette er forbedret dramatisk med den stigende tilgængelighed af forskellige typer vaccinationer2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkaldt af naturlig infektion eller vaccination bidrager til forebyggelse og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemedieret immunitet klassificeres som adaptiv immunitet, og induktion af førstnævnte har altid været betragtet som en nøglestrategi inden for vaccinedesign, omend med relativt begrænset forståelse i de sidste3. T-cellemedieret immunitets rolle med hensyn til at begrænse flavivirusspredning og virusclearance er imidlertid i stigende grad blevet fokuseret på og grundigt undersøgt4. Desuden er T-celleimmunitet ikke kun uundværlig i JEV-specifikke antivirale reaktioner, men spiller også en fremtrædende rolle i krydsbeskyttelse mod sekundær infektion med heterologe flavivirus, hvilket er blevet påvist i tidligere undersøgelser5. Det spekuleres i, at denne effekt kan omgå potentielle antistofmedierede forbedringseffekter i infektion5. Bemærk, at en sådan krydsreaktiv T-celleimmunitet er vigtig, især i mangel af vacciner og antivirale lægemidler mod flavivirus. Selvom mange undersøgelser er blevet udført for at bestemme T-cellernes bidrag i JEV-infektion med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forbliver de respektive afstamninger, der udskiller cytokiner og deres funktionelle diversificering, ubestemte, hvilket betyder, at belysningen af de nøjagtige funktioner af hjælper- og dræber-T-celler hindres.
Omfanget af deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten af T-celleresponser. CD4 + eller CD8 + T-celler, der kompatibelt kan give to eller flere funktioner, herunder cytokinsekretion og degranulering, karakteriseres som polyfunktionelle T-celler (TPF’er) ved specifik stimulering på enkeltcelleniveau8. CD4 + T-celler, der producerer enkelte eller flere cytokiner, kan have forskellige virkninger og immunhukommelser. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mere tilbøjelige til at danne et langsigtet effektivt beskyttelsesrespons end IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan bruges som en vigtig parameter til evaluering af vaccinationseffekten. Hyppigheden af IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler øges hos patienter med langvarig ikke-progression af erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos patienter med AIDS-progression er mere tilbøjelige til at producere IFN-γ alene på grund af den fremmende virkning af IL-2 på T-celleproliferation10. Desuden viste det sig, at en delmængde af IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ overlevede langsigtet in vivo og synergistisk fremmede drabsfunktionen11. Selvom CD8 + T-celler er mere tilbøjelige til at udvise cytotoksisk aktivitet, er nogle CD4 + T-celler også udstyret med cytotoksisk aktivitet som et indirekte detekteret udtryk for overflade CD107a molekyler12. Derudover udtrykker visse T-celleundergrupper kemokin-MIP-1α, som ofte udskilles af monocytter for at deltage i T-cellemedieret neutrofil rekruttering13. På samme måde kan CD8+ TPFs også bruges til at karakterisere alsidigheden af ovenstående markører. Undersøgelser har vist, at prime-boost-strategien effektivt kan fremkalde en længere periode med TPF-beskyttende virkninger13, hvilket kan forbedre beskyttelsen fremkaldt af vaccination. Et centralt træk ved at undersøge immunsystemet er hukommelses-T-cellernes evne til at lette stærkere, hurtigere og mere effektive reaktioner på sekundære virale udfordringer end naive T-celler. Effektorhukommelses-T-celler (TEM) og centrale hukommelses-T-celler (TCM) er vigtige T-celleundergrupper, der ofte differentieres ved den sammensatte ekspression af CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA–) har tendens til at lokalisere i sekundært lymfoidt væv, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7– CD45RA–) lokaliserer i lymfoid og perifert væv 15,16. TEM giver øjeblikkeligt, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opretholder responsen ved at proliferere i de sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. I betragtning af at hukommelsesceller kan formidle specifikke og effektive tilbagekaldelsesresponser på vira, opstår der spørgsmål om bidraget fra denne delmængde af polyfunktioner.
Med udviklingen af flowcytometriteknologi er det blevet almindeligt samtidig at detektere markører for mere end 10 klynger, fænotyper og differentieringsantigener, hvilket er gavnligt for mere rigeligt at kommentere de funktionelle immunologiske træk på individuelle T-celler for at reducere fejlfortolkning og vanskeligheder med at forstå T-cellefænotyper. Denne undersøgelse brugte ex vivo-stimulering og flowcytometri til at analysere TPF-profiler i mononukleære celler (PBMC’er i perifert blod) hos JEV-vaccinerede børn. Ved anvendelse af denne tilgang vil forståelsen af kort- og langsigtet JEV-specifik og endda krydsreaktiv T-celleimmunitet induceret af vaccination blive udvidet.
Denne protokol repræsenterer en gennemførlig flowcytometribaseret detektionsmetode for TPF-profiler i PBMC’erne hos børn, der er vaccineret med JEV-vaccinen SA14-14-2. Denne undersøgelse brugte venøst blod PBMC’er fra både vaccinerede og uvaccinerede børn som forskningsmaterialer. Med stimulering af PBMC’er med JEV-antigenet kan de forstærkede antigenspecifikke TPF’erkarakteriseres ved flerfarvet flowcytometriantistoffarvning. Sammenlignet med den konventionelle enzymbundne immunospot-assaym…
The authors have nothing to disclose.
R.W. blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. blev støttet af CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |