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Immunology and Infection

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64671
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 1,2, 1,2
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, National Center for Children’s Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of Pediatric Rehabilitation, Beijing Boai Hospital, School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, China Rehabilitation Research Center, 4Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd
* These authors contributed equally

Summary

본 프로토콜은 생체 외 자극과 유세포 분석을 결합하여 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 예방 접종을받은 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 다기능성 T 세포 (TPF) 프로파일을 분석합니다. JEV 특이적 TPF의 검출 방법 및 유세포분석 색 구성표를 테스트하여 유사한 연구에 대한 참조를 제공했습니다.

Abstract

T 세포 매개 면역은 백신 접종 후 또는 자연 감염 후 플라 비 바이러스 감염을 조절하는 데 중요한 역할을합니다. T 세포의 "품질"은 기능에 의해 평가되어야 하며, 더 높은 기능은 더 강력한 면역 보호와 관련이 있습니다. 단일 세포 수준에서 2개 이상의 사이토카인 또는 케모카인을 동시에 생산할 수 있는 T 세포를 다기능성 T 세포(TPFs)라고 하며, 이는 탈과립 마커(CD107a)를 발현하고 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-2 또는 대식세포 염증 단백질(MIP)-1α를 분비하는 다양한 분자 메커니즘을 통해 면역 반응을 매개합니다. TPF가 장기 면역 기억 및 보호의 유지와 밀접한 관련이 있으며, 이들의 증가 된 비율이 보호 면역의 중요한 마커이며 바이러스 감염 및 재 활성화의 효과적인 제어에 중요하다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 평가는 특정 면역 반응뿐만 아니라 교차 반응 면역 반응의 평가에도 적용됩니다. 여기서, 일본뇌염 바이러스(JEV)를 예로 들면, 일본뇌염 백신접종을 받은 소아의 말초혈액단핵세포에서 생성되는 JEV 특이적TFs의 검출방법 및 유세포분석 색도를 시험하여 유사한 연구에 대한 참고자료를 제공하였다.

Introduction

일본 뇌염 바이러스 (JEV)는 Flaviviridae 가족1 내의 Flavivirus 속에 속하는 중요한 모기 매개 바이러스입니다. 많은 아시아 태평양 국가들은 일본뇌염(JE)으로 인한 막대한 질병 부담으로 인해 오랫동안 엄청난 공중 보건 문제에 직면해 왔지만 다양한 유형의 예방 접종의 가용성이 증가함에 따라 극적으로 개선되었습니다2. 자연 감염 또는 백신 접종에 의해 유발되는 적응 형 보호 면역 반응은 예방 및 항 바이러스 조절에 기여합니다. 체액 성 면역과 세포 매개 면역은 적응 면역으로 분류되며, 전자의 유도는 과거3에서 상대적으로 제한된 이해에도 불구하고 항상 백신 설계의 핵심 전략으로 간주되어 왔습니다. 그러나, 플라비바이러스 전파 및 바이러스 제거를 제한하는 T 세포 매개 면역의 역할은 점점 더 집중되고광범위하게 연구되고 있다4. 또한, T 세포 면역은 JEV 특이적 항바이러스 반응에 필수적일 뿐만 아니라이전 연구에서 입증된 이종 플라비바이러스의 2차 감염으로부터 교차 보호에 중요한 역할을 합니다5. 이 효과는 감염5에서 잠재적인 항체 매개 향상 효과를 우회할 수 있다고 추측됩니다. 참고로, 이러한 교차 반응성 T 세포 면역은 특히 플라비바이러스에 대한 백신 및 항바이러스 약물의 부재 하에서 중요하다. CD4+ 및 CD8+ T 세포6,7에 대한 JEV 감염에서 T 세포의 기여도를 결정하기 위해 많은 연구가 수행되었지만, 사이토카인을 분비하는 각각의 계통과 그 기능적 다양화는 아직 결정되지 않아 도우미 및 킬러 T 세포의 정확한 기능에 대한 해명이 방해를 받습니다.

항 바이러스 방어의 규모는 T 세포 반응의 질을 결정합니다. 사이토카인 분비 및 탈과립을 포함하는, 둘 이상의 기능을 양립가능하게 부여할 수 있는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포는 단일-세포 수준8에서 특이적 자극시 다기능성 T 세포(TPFs)로서 특성화된다. 단일 또는 다중 사이토카인을 생성하는 CD4+ T 세포는 다양한 효과와 면역 기억을 가질 수 있습니다. 예를 들어, IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포는 백신접종 효과를 평가하는데 중요한 파라미터로서 사용될 수 있는 IL-2+ CD4+ T 세포9보다 장기간 효과적인 보호 반응을 형성할 가능성이 더 높다. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T 세포의 빈도는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 장기간 비진행 환자에서 증가하는 반면, AIDS 진행 환자의 CD4+ T 세포는 T 세포 증식에 대한 IL-2의 촉진 효과로 인해 IFN-γ 단독으로 생성하는 경향이 더 큽니다10. 또한, IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+의 서브세트는 생체내에서 장기간 생존하고 상승적으로 살상 기능을 촉진하는 것으로 나타났다11. CD8+ T 세포가 세포독성 활성을 나타낼 가능성이 더 높지만, 일부 CD4+ T 세포는 또한 표면 CD107a 분자(12)의 간접적으로 검출된 발현으로서 세포독성 활성을 갖는다. 또한, 특정 T 세포 하위세트는 케모카인 MIP-1α를 발현하며, 이는 종종 T 세포-매개 호중구 모집에 참여하기 위해 단핵구에 의해 분비된다13. 유사하게, CD8+ TPFs는 또한 상기 마커의 다기능성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 연구에 따르면 프라임 부스트 전략은 장기간 TPF 보호 효과13를 효과적으로 유도 할 수 있으며, 이는 백신 접종에 의해 유도 된 보호를 향상시킬 수 있습니다. 면역 체계를 검사하는 핵심 기능은 순진한 T 세포보다 2차 바이러스 문제에 대해 더 강력하고 빠르며 효과적인 반응을 촉진하는 기억 T 세포의 능력입니다. 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 및 중앙 기억 T 세포 (TCM)는 CD27/CD45RO 또는 CCR7/CD45RA14의 복합 발현에 의해 종종 분화되는 중요한 T 세포 하위세트이다. TCM (CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-)은 2차 림프성 조직에 국한되는 경향이 있는 반면, TM (CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA-)은 림프성 및 말초 조직에 국한된다15,16. TEM은 즉각적이지만 지속적이지 않은 방어를 제공하는 반면,TCM은 2차 림프성 기관에서 증식하고 새로운 이펙터(17)를 생성함으로써 반응을 지속한다. 따라서, 기억 세포가 바이러스에 대한 구체적이고 효율적인 회상 반응을 매개할 수 있다는 것을 감안할 때, 이러한 다기능의 서브세트의 기여에 대한 질문이 제기된다.

유세포 분석 기술의 발달로 10 개 이상의 클러스터, 표현형 및 분화 항원의 마커를 동시에 검출하는 것이 보편화되었으며, 이는 개별 T 세포의 기능적 면역 학적 특징을보다 풍부하게 주석으로 달아 T 세포 표현형에 대한 오해와 이해의 어려움을 줄이는 데 도움이됩니다. 이 연구는 생체 외 자극 및 유세포 분석을 사용하여 JEV 백신 접종 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 TPF 프로파일을 분석했습니다. 이 접근법을 적용하면 백신 접종에 의해 유도 된 단기 및 장기 JEV 특이 적 및 심지어 교차 반응성 T 세포 면역에 대한 이해가 확대 될 것입니다.

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Protocol

본 연구에 대한 윤리적 승인은 수도의과대학 베이징아동병원 윤리위원회(승인번호: 2020-k-85)에서 획득했다. 자원 봉사자는 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 모집되었습니다. 말초 정맥 혈액 샘플은 이전에 약독 화 된 JE SA14-14-2 백신으로 반년 미만 동안 프라임 및 부스트 예방 접종을받은 건강한 어린이 (2 세)로부터 얻었습니다 (JE 예방 접종을받은 어린이, n = 5) 및 예방 접종을받지 않은 어린이 (6 개월, n = 5). 인간 피험자의 정보에 입각 한 동의는 임상 적으로 테스트 된 후 잔류 샘플 만이이 연구에서 사용되었으므로 포기되었습니다. 자원 봉사자의 개인 정보를 보호하기 위해 모든 데이터는 완전히 익명화되고 익명화되었습니다.

1. 말초 정맥혈에서 PBMC의 분리

  1. 표준 정맥 천자 기술18에 따라 EDTA-K2- 항 응고 튜브 (재료 표 참조)에서 JE 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이로부터 말초 정맥혈 샘플 (2mL)을 수집합니다.
  2. 인산염 완충 식염수(1x PBS) 2mL를 추가하여 말초 혈액을 희석합니다.
    참고: 이 프로세스는 최대 생존성을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 처리됩니다.
  3. 4mL의 밀도 구배 배지( 재료 표 참조)를 15mL 원심분리 튜브에 추가하고 희석된 혈액을 분리 배지의 상층으로 천천히 옮깁니다.
    알림: 혈액을 분리 매체와 혼합하거나 두 액체로 형성된 접촉면을 파괴하지 마십시오. 그렇지 않으면 분리 효과가 달성되지 않습니다.
  4. 실온에서 20 분 동안 800 ×g에서 원심 분리합니다. 원심분리 후 유의층을 관찰한다.
  5. PBMC (중간 층)를 다른 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 PBMC를 10% 소 태아 혈청(FBS, 재료 표 참조)을 함유하는 RPMI-1640 배지 10mL로 세척합니다.
  6. 실온에서 10 분 동안 800×g으로 원심분리하고 피펫으로 상층액을 조심스럽게 버린다.
  7. 10% FBS를 함유한 RPMI-1640 배지 1mL로 PBMC를 재현탁하고 트리판 블루 기반 자동 카운터로 세포를 계수합니다( 재료 표 참조).

2. 사이토카인 발현을 유도하기 위해 비활성화된 JEV 입자에 의한 PBMC의 자극

  1. JEV 자극의 두 하위군과 JE 백신접종된 대조군 및 백신접종되지 않은 샘플에서 각각 설정한다.
  2. PBMC의 수를 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지로 2 × 10 6 세포/mL로 조정하고, PBMC를 24-웰 플레이트에 시드한다(웰당 2 × 106 세포/1 mL 배지); 각 그룹에 대해 3 개의 웰을 접종하십시오.
  3. 단클론 항체 CD28(1μg/mL, 1:1,000) 및 CD49d(1μg/mL), 골지플러그(1μg/mL, 1:1,000) 및 모넨신(1μg/mL, 1:1,000)의 존재하에 37°C에서 16시간 동안 농축된 비활성화된 JEV 입자 5(2 × 105 PFU)로 JEV 자극 그룹의 PBMC를 자극합니다. 표면 염색을 위해 BV605-anti-CD107a(1μg/mL, 1:1,000)를 사용하십시오(재료 표 참조).
    참고: JEV는 앞서 설명한 대로 UV 조사에 의해 비활성화되었습니다19.
  4. 단일 클론 항체 CD28 (1 μg/mL, 1:1,000) 및 CD49d (1 μg/mL, 1:1,000), GolgiPlug (1 μg/mL, 1:1,000) 및 모넨신 (1 μg/mL, 1:1,000)의 존재하에 37 °C에 16 h 동안 농축된 바이러스 입자 없이 대조군의 PBMCs를 자극하십시오. BV605-항-CD107a(1μg/mL, 1:1,000)로 표면을 염색합니다.

3. 생체 외 세포 내 염색

  1. 각 그룹으로부터 세포 현탁액을 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 모으고, 실온에서 5분 동안 500 × g 으로 원심분리하고, 피펫으로 상청액을 제거한다.
  2. 세포를 1mL의 1x PBS에 재현탁하고 고정 가능한 생존 염료(1μL/mL, 1:1,000, 재료 표 참조)를 세포 현탁액에 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 500 × g (실온에서)에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
  3. 세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 500 × g (실온에서)에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
  4. 세포 표면 마커 염색을 수행합니다.
    1. 세포를 100μL의 1x PBS에 재현탁시키고, 각 표면 마커 항체 (BV650-항-CD3, BUV395-항-CD4, BV421-항-CD8, BUV737-항-CD27, 및 BV480-항-CD45RO, 희석 인자: 1:50, 재료 표 참조)의 2μL를 각 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다.
      참고: 컬러 형광 항체 염색 프로토콜은 표 1에 나와 있습니다.
    2. 튜브를 실온에서 30 분 동안 배양 (3.4.1 단계)하고 빛으로부터 보호하십시오. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다.
      참고: BUV737-항-CD27 및 BV480-항-CD45RO의 항체는 기억 T 세포의 주석으로서 BUV737-항-CCR7 및 BV480-항-CD45RA로 대체될 수 있다.
  5. 세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5 분 동안 500 ×g에서 원심 분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
  6. 고정 및 멤브레인 파괴를 수행하십시오.
    1. 500μL의 막 파괴 고정 용액( 재료 표 참조)으로 세포를 재현탁하고 실온의 어두운 곳에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
  7. 세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거한다.
  8. 세포 내 사이토 카인 염색을 수행하십시오.
    1. 세포를 100 μL의 1x PBS에 재현탁시키고, 2 μL의 각 사이토카인 항체 (FITC-항-IFN-γ, PE-항-TNF-α, BV785-항-IL-2, 및 APC-항-MIP-1α, 희석 계수: 1:50, 재료 표 참조)를 각 튜브의 세포 현탁액에 첨가한다.
      참고: 형광단 접합 항체에 대한 부피 및 정보는 표 1에 나와 있습니다.
    2. 튜브를 (단계 3.8.1) 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 500 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한다.
  9. 세포를 1 mL의 1x PBS에 재현탁시킨다. 실온에서 5분 동안 500× g 으로 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거한다. 500μL의 1x PBS를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.

4. 유세포분석 설정

  1. PBMC 샘플을 단독으로 대조군 샘플로서 단계 1에 기재된 절차에 따라 단리한다. 아래에 언급된 대로 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브(100μL/튜브)에서 12등분으로 나눕니다.
    1. 염색되지 않은, APC-Cy7-살아있는/죽은 고정 염색, BV650-항-CD3 단일 염색, BUV395-항-CD4 단일 염색, BV421-항-CD8 단일 염색, BUV737-항-CD27 단일 염색, BV480-항-CD45RO 염색, BV605-항-CD107a, FITC-항-IFN-γ 염색, PE-항-TNF-α 단일 염색, BV785-항-IL-2 단일 염색 및 APC-항-MIP-1α 단일 염색 샘플을 설정합니다.
  2. 세포 표면 마커를 추가하고 세포내 사이토카인 염색을 단계 3에 기재된 바와 같이 한다. 각각의 단일 염색 샘플에 대해, 염색 단계의 형광단 중 하나만 첨가한다. 500μL의 1x PBS를 추가하여 세포를 재현탁시키고 저속으로 와동시킵니다.
  3. 염색되지 않은 샘플을 사용하여 전방 산란(FSC), 측면 산란(SSC) 및 다른 형광 염료 전압을 조정합니다.
    참고 : 본 연구에서는 다음 전압이 설정되었습니다. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V 및 BV785: 725 V.
  4. 단일-염색 샘플을 사용하여, 상이한 형광단 사이의 오염 신호를 제거하기 위해 유동 세포분석 보상을 조정한다.
    알림: 보정 매개변수는 표 2에 나와 있습니다.

5. 게이팅 전략 및 데이터 분석

참고: 본 연구에서, 본 분석을 위해, CD27+ CD45RO+ 또는 CCR7+ CD45RA-로서 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 중앙 기억 T 세포 (TCM 및 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 이펙터 기억 T 세포 (TEM)를 CD27-CD45RO+ 또는 CCR7-CD45RA-로 각각 정의하였다16.

  1. FSC 영역(FSC-A)/SSC-영역(SSC-A) 점도표를 통해 다각형 게이트를 그려 파편을 제외하고 손상되지 않은 림프구 집단을 선택합니다(그림 1A).
  2. FSC-A/FSC-너비(FSC-W) 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 단일 셀을 선택합니다(그림 1B).
  3. 살아있는/죽은 자/SSC-A 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 살아있는 세포를 선택합니다(그림 1C).
  4. CD3/SSC-A 점도표를 통해 직사각형 게이트를 그려 CD3+ T 세포를 식별합니다(그림 1D).
  5. CD4 / CD8 점도표를 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4 + 또는 CD8 + T 세포를 식별합니다 (그림 1E).
  6. CD45RO/CD27 점도표를 통해 쿼드 게이트를 그려 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를T CM(CD27+ CD45RO+) 및TEM(CD27- CD45RO+)으로 세분화합니다(그림 1F-I).
  7. CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 TCM 또는TEM으로부터 CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1α의 게이트를 각각 그려 상이한 반응 패턴의 빈도를 결정한다.
  8. 샘플을 세포분석에 순차적으로 로드합니다. 정지 게이트 20을 사용하여 1 ×10 6 림프구를 획득하십시오.
    참고: 개별 사용자는 1개이상의 × 10개 6개의 셀을 수집할 수 있습니다. 이 숫자는 소요 시간과 의미있는 결과를 제공하기에 충분한 세포 수집 사이의 절충안이었습니다.

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Representative Results

그림 1은 JE 백신 접종 아동의 대표적인 JEV 자극 그룹에서 CD8+ 또는 CD4+ T세포의 T CM 또는 TEM을 분할하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. FSC-A/SSC-A 점도표는 림프구를 식별하는 데 사용되며 FSC-A/FSC-W 점도표는 단일 세포를 식별하는 데 사용됩니다. 생존 가능한 세포는 살아있는/죽은 / SSC-A 점도표에서 선택됩니다. CD3/SSC-A 점도표는 CD3+ T 세포를 식별하는 데 사용됩니다. CD4/CD8 점도표는 각각 CD3+ CD4+ 및 CD3+ CD8+ T 세포를 식별하는 데 사용됩니다. CD8+ 또는 CD4+ T 세포의T CM (CD27+ CD45RO+) 및TEM (CD27- CD45RO+)은 CD45RO/CD27 점도표에서 별도로 선택됩니다. CD8+ TCM(그림 1F), CD8+ TEM(그림 1G), CD4+TCM(그림 1H) 및 CD4+ TEM(그림 1I)으로부터 CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ 및 MIP-1α+의 표현형을 갖는 세포는 상응하는 직사각형 게이트를 그리는 것에 의해 별도로 선택된다.

JE 백신 접종 및 백신 미접종 소아에서 JEV에 대한 중추 및 이펙터 기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응(탈과립, 사이토카인 및 케모카인 포함)의 다기능적 특성은 표 3에 나와 있습니다. 이러한 결과는 백신을 접종하지 않은 어린이의 CD107a, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 수치가 예방 접종을 받지 않은 어린이의 CD8+ TCM 세포에서 감지되었음을 나타냅니다. MIP-1α의 수준은 두 그룹 간에 차이가 없었다. TEM 세포는 JEV로 재자극할 때 직접 항바이러스 효과를 발휘하는 것으로 생각됩니다. 백신을 접종하지 않은 그룹에 비해 JEV 자극하에 백신 접종 그룹의 CD8+ TEM 세포에서 더 높은 수준의 CD107a 및 IFN-γ이 검출되었습니다. 그러나, TNF-α, IL-2 및 MIP-1α는 이들 양성 세포에서 유의하게 상승하지 않았다.

JEV 항원은 백신을 접종하지 않은 그룹에 비해 백신을 접종한 그룹의 CD107+ TCM 세포에서 더 높은 수준의 CD4a, IFN-γ, TNF-α 및 MIP-1α를 성공적으로 유도했습니다. 그러나, IL-2+ 세포의 비율은 JEV 자극 하에서 두 그룹 간에 차이가 없었다. 백신접종군에서 CD4+ TEM 세포의 CD107a+, IFN-γ+ 및 TNF-α+ 서브세트의 비율은 백신을 접종하지 않은 그룹에서보다 JEV가 존재할 때 더 높았다.

Figure 1
그림 1: CD8+ 또는 CD4+ T 세포 및 그 하위 집합의 TCM 또는TEM을 식별하기 위한 게이팅 전략의 그림. (A) 림프구는 FSC-A/SSC-A 점도표를 사용하여 식별하였다. (B) 단일 세포는 FSC-A/FSC-W 도트 플롯을 사용하여 식별되었습니다. (C) 살아있는 세포는 살아있는 / 죽은 / SSC-A 점도표를 사용하여 식별되었습니다. (D) CD3 / SSC-A 점도표를 사용하여 CD3 + T 세포를 확인했다. (E) CD4/CD8 점도표를 사용하여 CD3+ CD4+ T 및 CD3+ CD8+ T 세포를 식별하였다. (F) CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ 및 MIP-1α+의 표현형을 갖는 CD8+ TCM을 별도로 세분하였다. (g) 5개의 표현형을 갖는 CD8+ TEM을 별도로 세분하였다. (h) 5개의 표현형을 갖는 CD4+ TCM을 별도로 세분하였다. (i) 5개의 표현형을 갖는 CD4+ TEM을 별도로 세분하였다. 각 패널의 숫자는 게이트에 있는 셀의 백분율을 나타냅니다. 색상 코딩은 세포의 발생 빈도를 나타내며 빨간색이 가장 높은 빈도이고 파란색이 가장 낮습니다. 약어 : SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-A = 전방 산란 영역; FSC-W = 순방향 산란 폭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항체 표적 공액 형광단 복용량 클론 아이소타입 여기 레이저 라인 전 최대 (nm) 엠맥스 (nm)
CD3 BV650 2 μL SK7 마우스 IgG1, κ 보라색 407 650
CD4 BUV395 2 μL SK3 마우스 IgG1, κ 자외선 348 39
CD8 BV421 2 μL SK1 마우스 IgG1, κ 보라색 407 421
CD27 BUV737 2 μL L128 마우스 IgG1, κ 자외선 350 737
CD45RO BV480 2 μL 우클1 마우스 IgG2a, κ 보라색 436 478
CCR7 BUV737 2 μL 3D12 쥐 IgG2a, κ 자외선 350 737
CD45RA BV480 2 μL 하이100 마우스 IgG2b, κ 보라색 436 478
CD107a BV605 2 μL H4A3 마우스 IgG1, κ 보라색 407 602
IL-2 BV785 2 μL MQ1-17H12 쥐 IgG2a, κ 보라색 407 786
IFN-γ 증권 시세 표시기 2 μL 4초. 나3 마우스 IgG1, κ 파랑 494 520
TNF-α 체육 2 μL MAb11 마우스 IgG1, κ 옐로우 그린 496, 564 578
밉-1α 증권 시세 표시기 2 μL 11ᄀ3 마우스 IgG2a, κ 빨강 650 660
좀비 NIR APC-Cy7 1 μL - - 빨강 650 779

표 1: 유세포 분석을 위한 컬러 형광 항체 염색 프로토콜. 약어 : BV = 화려한 보라색; BUV = 브릴리언트 자외선; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌.

유세포분석의 보상기준(%)
증권 시세 표시기 증권 시세 표시기 APC-Cy7 BV421 BV480 BV605 BV560 BV785 BUV395 BUV737 체육
증권 시세 표시기 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
증권 시세 표시기 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APC-Cy7 0 0 100 0 0 0 0 65 0 44 0
BV421 0 0.6 0 100 10.5 3 15 3 0.4 0 0
BV480 3 0 0 46 100 19 0 6.1 0 0 0
BV605 0 0 0 3.6 0 100 94 10 0 9 14
BV560 0 5.5001 0 2 1 7.1 100 9 0 10 0
BV785 0 0 0 0 0 0 0 100 0 30 0
BUV395 0 0 0 1.7 0 0 0 0 100 0 0
BUV737 0 0 2 0 0 0 0 3.7001 3 100 0
체육 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100

표 2: 유세포 분석 분석에 대한 보상 파라미터. 약어 : BV = 화려한 보라색; BUV = 브릴리언트 자외선; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌.

TPF의 그룹  다기능 특성화(%)
자극 CD107a IFN-γ TNF-α IL-2 밉-1α
CD8+ T 세포 티씨엠 예방 접종 제브 1.50±0.48 1.60±0.69 0.66±0.32 0.54±0.27 0.16±0.11
Ctrl 0.51±0.38 0.31±0.13 0.28±0.13 0.37±0.20 0.02±0.05
예방 접종을받지 않은 제브 0.38±0.19 0.20±0.03 0.19±0.09 0.16±0.04 0.19±0.09
Ctrl 0.50±0.28 0.27±0.09 0.19±0.05 0.23±0.14 0.08±0.11
P 값* - 0.00 0.00 0.02 0.01 0.70
티엠 예방 접종 제브 1.47±0.58 1.21±0.22 0.49±0.36 0.33±0.31 0.24±0.17
Ctrl 0.82±0.48 0.39±0.15 0.16±0.18 0.23±0.256 0.09±0.21
예방 접종을받지 않은 제브 0.41±0.25 0.14±0.09 0.15±0.11 0.20±0.07 0.15±0.13
Ctrl 0.34±0.13 0.21±0.15 0.17±0.10 0.19±0.19 0.01±0.02
P 값* - 0.01 0.00 0.08 0.13 0.36
CD4+ T 세포 티씨엠 예방 접종 제브 1.55±0.43 1.16±0.24 0.57±0.25 0.29±0.18 0.19±0.07
Ctrl 0.44±0.27 0.26±0.20 0.15±0.06 0.12±0.06 0.04±0.07
예방 접종을받지 않은 제브 0.28±0.08 0.21±0.08 0.17±0.03 0.21±0.16 0.10±0.03
Ctrl 0.31±0.13 0.26±0.06 0.14±0.04 0.25±0.13 0.04±0.04
P 값* - 0.00 0.00 0.01 0.47 0.04
티엠 예방 접종 제브 1.54±0.58 1.33±0.15 0.89±0.25 0.37±0.22 0.21±0.05
Ctrl 0.46±0.49 0.35±0.30 0.13±0.08 0.14±0.09 0.05±0.11
예방 접종을받지 않은 제브 0.27±0.09 0.23±0.10 0.30±0.15 0.23±0.03 0.14±0.06
Ctrl 0.35±0.21 0.24±0.14 0.19±0.20 0.25±0.08 0.05±0.07
P 값* - 0.00 0.00 0.00 0.19 0.08
* 만-휘트니 U-테스트, JEV에 의해 자극된 백신 접종자의 PBMC 대 JEV에 의해 자극된 백신을 접종하지 않은 개인의 PBMC만이 나타났다.

표 3: JEV에 대한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 반응의 TCM 및TEM의 다기능 특성화. 백신 접종, n = 5; 예방 접종을받지 않음, n = 5. 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. P < 0.05는 유의한 차이를 나타내었다. * JEV에 의해 자극된 백신을 접종한 개인의 PBMC와 JEV에 의해 자극된 백신을 접종하지 않은 개인의 PBMC가 표시됩니다. 약어: TPFs= 다관능성 T 세포; IFN-γ = 인터페론 γ; TNF-α = 종양 괴사 인자-α; IL-2 = 인터루킨 -2; MIP-1α = 대식세포 염증성 단백질-1α; TCM = 중앙 메모리 T 셀; TEM = 이펙터 메모리 T 세포.

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Discussion

이 프로토콜은 JEV 백신 SA14-14-2로 백신을 접종한 어린이의 PBMC에서 TPF 프로파일에 대한 실현 가능한 유세포분석 기반 검출 방법을 나타냅니다. 이 연구는 예방 접종을받은 어린이와 예방 접종을받지 않은 어린이의 정맥혈 PBMC를 연구 자료로 사용했습니다. JEV 항원을 갖는 PBMCs의 자극과 함께, 이들 증폭된 항원-특이적 TPFs는 다색 유동 세포분석 항체 염색에 의해 특성화될 수 있다. 종래의 효소 결합 면역반점 분석법과 비교해, 유동 세포측정법의 현저한 이점은 단 하나 세포 수준에 PBMCs의 기능적인 특징을 가능한 한 다양하게 제시하는 것입니다, 검출을 위해 요구된 PBMCs의 수를 감소시키는 것입니다, 특히 아이들을 위해 적당합니다.

명확한 백신 접종 이력, 세포 생존력 유지, 자극기의 T 세포 면역원성 및 호환 가능한 색상 일치 전략은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 중국은 2008년부터 JEV SA14-14-2의 예방 접종을 국가 확대 예방 접종 프로그램에 통합했으며 예방 접종 기록을 통합 관리에 포함시켜백신 기록의 접근성을 위해 사용할 수 있게 되었습니다3. 이 프로토콜에서 조사된 PBMC는 최대 세포 생존율을 유지하기 위해 실험적으로 얼음 위에 보관되었습니다. 특정 자극의 사용은 이전에 효과적인 것으로 널리 입증되었습니다 4,5,21,22. 색상 일치 전략은 이 방법의 주요 제약 조건이며 이 전략의 유용성은 지속적인 사전 테스트 개선 및 기기 매개변수 일치에 제시되었습니다. 또한, 이 프로토콜은 메모리 T 셀에 주석을 달기 위한 두 가지 옵션을 제공했습니다. 실험 파라미터의 상기 구성 및 최적화를 통해, 유세포분석에 의한 백신 접종에 대한 TPF 반응의 규모 및 빈도를 평가함으로써 특이적 및 심지어 교차 반응성 면역을 측정하는 것이 달성될 수 있다. 그러나,TPFs를 특성화하는 5개의 대표적인 지표는 본 연구의 한계이다; 현재 공통된 기능성 분자 (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2, 및 MIP-1α)는 제시된 프로토콜에 기초하여TPFs의 다용성을 보다 완전하게 특성화하기 위해 스펙트럼을 검출하도록 확장될 수 있다.

JEV 감염은특히 항체 반응이 시간이 지남에 따라 약해짐에 따라 백신 접종으로 유발된 기억 T 세포 반응이 오래 지속되는 면역 보호를 유지하는 데 중요할 수 있는 예방 접종으로 예방할 수 있는 질병으로 간주됩니다4. 기억 T 세포의 주요 전능성 보호 성분으로서,T PFs는 백신 효능 평가를 위한 일상적인 테스트 항목으로 제안되어야 하며, 반대로 표적 T 세포 백신의 설계 및 개발을 안내해야 한다. 사실, 플라 비 바이러스 감염 통제에서 T 세포 면역의 역할은 점점 더 높이 평가되고 있으며, 더 좋든 나쁘 든 항체의 역할을 우회 할 수도 있습니다5. TPF 프로파일의 명확화는 의심할 여지 없이 항원 에피토프의 레퍼토리를 더욱 좁힐 것이며, 이는 표적화를 개선함으로써 백신 비용을 감소시킬 수밖에 없다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 시너지 효과는 서로를 보완하며 의심할 여지 없이 TPF에서 더 두드러집니다. 따라서, TPFs에 대한 연구는 (1) 장기 및단기 TP s의 프로파일 차이에 초점을 맞출 것을 제안한다; (2) HLA-제한된 TP 에피토프의 동정; (3) 더 많은 다 기능성 하위 집단의 탐사 및 연구.

바이러스 감염의 면역 대조군에서 TPF 세포의 동정은23,24,25로 보고되었다. 그러나,TPFs의 완전한 검출 전략 및 공정에 대한 설명은 잘 조직되어 있지 않다. 또한 이 방법의 색 구성표는 여러 유세포분석기 모델에 적용됩니다. 마커는 또한 이러한 컬러 매칭에 기초하여 다른 기능적 서브그룹을 검출하도록 조정될 수 있다.

이 연구는 JEV 백신 접종자의 PBMC에서 T PF 하위 세트 프로파일을 분석하기 위해 생체 외 특이적 자극과 유세포분석을 결합하여 TPF 검출 전략을 제공했습니다. 단리된 PBMC를 먼저 JEV 항원으로 자극한 다음, 상응하는 형광 표지된 항체로 염색하고, JEV-특이적 CD4+ 및 CD8+ 기억 TPFs를 유동 세포측정법에 의해 특성화하였다. 이러한 결과에 기초하여, 이중, 삼중, 사중 및 오중함수 함수의TPF 주파수를 추가로 계산하여TPF를 보다 상세하고 포괄적으로 설명할 수 있다. 소아의 일상적인 정맥혈(2mL)은 TPF 연구에 충분한 것으로 나타났습니다. 따라서, 바이러스 특이적TPFs에 대한 검출 방법은 백신 접종 또는 감염과 관련된 T 세포-매개 적응 면역의 척도를 탐색하는데 사용될 것으로 예상된다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

R.W.는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 중국 베이징 자연 과학 재단 (7222059)의 지원을 받았습니다. ZD.X.는 CAMS 의료 과학 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human CD28 Biolegend 302934 Antibody
anti-human CD49d Biolegend 304339 Antibody
APC anti-human MIP-1α BD 551533 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSymphony A5 BD A5 flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4 BD 563550 Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7 BD 741786 Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27 BD 612829 Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8 Biolegend 344748 Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RA BD 566114 Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RO BD 566143 Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107a Biolegend 328634 Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3 BD 563999 Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2 Biolegend 500348 Fluorescent antibody 
Centrifuge Tube BD Falcon BD-35209715 15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714 Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ Biolegend 502506 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 22400089 cell culture medium
High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α Biolegend 502909 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) BD 555029 blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD 554724 blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube BD Falcon 352235 5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye Biolegend 423106 Dead cell stain

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References

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면역학 및 감염 187호 다기능성 T세포 일본뇌염 예방접종 유세포분석
유세포 분석 기술을 <em>통한</em> 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출
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Zhang, L., Zhang, M., Liu, M., Ai,… More

Zhang, L., Zhang, M., Liu, M., Ai, J., Tian, J., Ge, H., Wang, R., Xie, Z. Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique. J. Vis. Exp. (187), e64671, doi:10.3791/64671 (2022).

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