Het huidige protocol combineert ex vivo stimulatie en flowcytometrie om polyfunctionele T-cel (TPF) profielen te analyseren in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) binnen Japanse encefalitisvirus (JEV) -gevaccineerde kinderen. De detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF’s werden getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
T-cel-gemedieerde immuniteit speelt een belangrijke rol bij het beheersen van flavivirusinfectie, hetzij na vaccinatie of na natuurlijke infectie. De “kwaliteit” van een T-cel moet worden beoordeeld op functie en een hogere functie wordt geassocieerd met een krachtigere immuunbescherming. T-cellen die tegelijkertijd twee of meer cytokines of chemokines op eencellig niveau kunnen produceren, worden polyfunctionele T-cellen (TPFs) genoemd, die immuunresponsen bemiddelen via een verscheidenheid aan moleculaire mechanismen om degranulatiemarkers (CD107a) tot expressie te brengen en interferon (IFN) -γ, tumornecrosefactor (TNF) -α, interleukine (IL) -2 of macrofaag ontstekingseiwit (MIP) -1α uit te scheiden. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat TPF’snauw samenhangen met het behoud van het langetermijnimmuungeheugen en de bescherming en dat hun verhoogde aandeel een belangrijke marker is van beschermende immuniteit en belangrijk is voor de effectieve bestrijding van virale infecties en reactivering. Deze evaluatie is niet alleen van toepassing op specifieke immuunresponsen, maar ook op de beoordeling van kruisreactieve immuunresponsen. Hier, met het Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, werden de detectiemethode en het flowcytometriekleurenschema van JEV-specifieke TPF’sgeproduceerd door perifere mononucleaire bloedcellen van kinderen die waren gevaccineerd tegen Japanse encefalitis getest om een referentie te bieden voor vergelijkbare studies.
Japans encefalitisvirus (JEV) is een belangrijk door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus binnen de Flaviviridae-familie1. Veel landen in Azië en de Stille Oceaan worden al lang geconfronteerd met enorme uitdagingen op het gebied van de volksgezondheid als gevolg van de enorme ziektelast veroorzaakt door Japanse encefalitis (JE), maar dit is dramatisch verbeterd met de toenemende beschikbaarheid van verschillende soorten vaccinaties2. Adaptieve beschermende immuunresponsen die worden opgeroepen door natuurlijke infectie of vaccinatie dragen bij aan de preventie en antivirale regulatie. Humorale immuniteit en celgemedieerde immuniteit worden geclassificeerd als adaptieve immuniteit, en de inductie van de eerste is altijd beschouwd als een belangrijke strategie bij het ontwerpen van vaccins, zij het met relatief beperkt begrip in het verleden3. De rol van T-cel-gemedieerde immuniteit bij het beperken van flavivirusverspreiding en virusklaring is echter steeds meer gericht op en uitgebreid bestudeerd4. Bovendien is T-celimmuniteit niet alleen onmisbaar bij JEV-specifieke antivirale reacties, maar speelt het ook een prominente rol bij kruisbescherming tegen secundaire infectie met heterologe flavivirussen, wat in eerdere studies is aangetoond5. Er wordt gespeculeerd dat dit effect potentiële antilichaam-gemedieerde versterkingseffecten bij infectie5 kan omzeilen. Van belang is dat een dergelijke kruisreactieve T-celimmuniteit belangrijk is, vooral bij afwezigheid van vaccins en antivirale geneesmiddelen tegen flavivirussen. Hoewel er veel studies zijn uitgevoerd om de bijdrage van T-cellen aan JEV-infectie te bepalen met betrekking tot CD4+ en CD8+ T-cellen 6,7, blijven de respectieve afstammingslijnen die cytokines afscheiden en hun functionele diversificatie onbepaald, wat betekent dat de opheldering van de exacte functies van helper- en killer T-cellen wordt belemmerd.
De schaal van hun antivirale afweer bepaalt de kwaliteit van T-celresponsen. CD4+ of CD8+ T-cellen die compatibel twee of meer functies kunnen verlenen, waaronder cytokinesecretie en degranulatie, worden gekarakteriseerd als polyfunctionele T-cellen (TPFs) bij specifieke stimulatie op eencellig niveau8. CD4 + T-cellen die enkele of meerdere cytokines produceren, kunnen verschillende effecten en immuungeheugens hebben. IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen hebben bijvoorbeeld meer kans om een effectieve beschermende respons op lange termijn te vormen dan IL-2+ CD4+ T-cellen9, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke parameter bij het evalueren van het vaccinatie-effect. De frequentie van IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-cellen is verhoogd bij patiënten met langdurige niet-progressie van verworven immuundeficiëntiesyndroom (AIDS), terwijl CD4+ T-cellen bij patiënten met AIDS-progressie meer geneigd zijn om alleen IFN-γ te produceren vanwege het bevorderende effect van IL-2 op T-celproliferatie10. Bovendien bleek een subset van IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langdurig in vivo te overleven en synergetisch de dodingsfunctiete bevorderen 11. Hoewel CD8+ T-cellen meer kans hebben om cytotoxische activiteit te vertonen, zijn sommige CD4+ T-cellen ook uitgerust met cytotoxische activiteit als een indirect gedetecteerde expressie van oppervlakte-CD107a-moleculen12. Bovendien drukken bepaalde T-celsubsets de chemokine MIP-1α uit, die vaak wordt uitgescheiden door monocyten om deel te nemen aan T-cel-gemedieerde neutrofiele rekrutering13. Op dezelfde manier kunnen CD8 + TPF’sook worden gebruikt om de veelzijdigheid van de bovenstaande markers te karakteriseren. Studies hebben aangetoond dat de prime-boost-strategie effectief een langdurige periode van TPF-beschermende effecten kan induceren13, wat de bescherming die door vaccinatie wordt opgewekt, kan verbeteren. Een centraal kenmerk bij het onderzoeken van het immuunsysteem is het vermogen van geheugen-T-cellen om sterkere, snellere en effectievere reacties op secundaire virale uitdagingen mogelijk te maken dan naïeve T-cellen. Effectorgeheugen T-cellen (TEM) en T-cellen met centraal geheugen (TCM) zijn belangrijke T-celsubsets die vaak worden gedifferentieerd door de samengestelde expressie van CD27/CD45RO of CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ of CCR7+ CD45RA–) heeft de neiging om te lokaliseren in secundaire lymfoïde weefsels, terwijl TEM (CD27– CD45RO+ of CCR7– CD45RA–) lokaliseert in lymfoïde en perifere weefsels15,16. TEM biedt onmiddellijke maar niet aanhoudende verdediging, terwijl TCM de respons ondersteunt door zich te vermenigvuldigen in de secundaire lymfoïde organen en nieuwe effectoren te genereren17. Aangezien geheugencellen specifieke en efficiënte terugroepreacties op virussen kunnen bemiddelen, rijzen er dus vragen over de bijdrage van deze subset van polyfuncties.
Met de ontwikkeling van flowcytometrietechnologie is het gebruikelijk geworden om tegelijkertijd markers van meer dan 10 clusters, fenotypen en differentiatieantigenen te detecteren, wat gunstig is om de functionele immunologische kenmerken op individuele T-cellen overvloediger te annoteren om misinterpretatie en moeilijkheden bij het begrijpen van T-celfenotypen te verminderen. Deze studie gebruikte ex vivo stimulatie en flowcytometrie om TPF-profielen in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) bij JEV-gevaccineerde kinderen te analyseren. Door deze aanpak toe te passen, zal het begrip van korte- en langetermijn JEV-specifieke en zelfs cross-reactieve T-celimmuniteit geïnduceerd door vaccinatie worden uitgebreid.
Dit protocol vertegenwoordigt een haalbare op flowcytometrie gebaseerde detectiemethode voor TPF-profielen in de PBMC’s van kinderen die zijn gevaccineerd met het JEV-vaccin SA14-14-2. Deze studie gebruikte de veneuze bloed PBMC’s van zowel gevaccineerde als niet-gevaccineerde kinderen als onderzoeksmateriaal. Met de stimulatie van PBMC’s met het JEV-antigeen kunnen die versterkte antigeenspecifieke TPF’sworden gekenmerkt door multicolor flowcytometrie-antilichaamkleuring. In vergelijking met de con…
The authors have nothing to disclose.
R.W. werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), beijing natural science foundation of China (7222059). ZD.X. werd ondersteund door het CAMS Innovatiefonds voor Medische Wetenschappen (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |