Il presente protocollo combina la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili delle cellule T polifunzionali (T PF) nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all’interno di bambini vaccinati con virus dell’encefalite giapponese (JEV). Il metodo di rilevazione e lo schema di colori della citometria a flusso dei TPF specifici di JEV sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.
L’immunità mediata dalle cellule T svolge un ruolo importante nel controllo dell’infezione da flavivirus, sia dopo la vaccinazione che dopo l’infezione naturale. La “qualità” di una cellula T deve essere valutata per funzione e una funzione più elevata è associata a una protezione immunitaria più potente. Le cellule T che possono produrre simultaneamente due o più citochine o chemochine a livello di singola cellula sono chiamate cellule T polifunzionali (TPFs), che mediano le risposte immunitarie attraverso una varietà di meccanismi molecolari per esprimere marcatori di degranulazione (CD107a) e secernere interferone (IFN)-γ, fattore di necrosi tumorale (TNF)-α, interleuchina (IL)-2 o proteina infiammatoria dei macrofagi (MIP)-1α. Vi è una crescente evidenza che le TPFsono strettamente correlate al mantenimento della memoria immunitaria a lungo termine e alla protezione e che la loro maggiore proporzione è un importante marker di immunità protettiva ed è importante nel controllo efficace dell’infezione virale e della riattivazione. Questa valutazione si applica non solo a specifiche risposte immunitarie, ma anche alla valutazione delle risposte immunitarie cross-reattive. Qui, prendendo come esempio il virus dell’encefalite giapponese (JEV), il metodo di rilevamento e lo schema di colori della citometria a flussodei PF Tspecifici di JEV prodotti dalle cellule mononucleate del sangue periferico di bambini vaccinati contro l’encefalite giapponese sono stati testati per fornire un riferimento per studi simili.
Il virus dell’encefalite giapponese (JEV) è un importante virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus all’interno della famiglia Flaviviridae1. Molti paesi dell’Asia-Pacifico hanno affrontato a lungo enormi sfide per la salute pubblica a causa dell’enorme carico di malattia causato dall’encefalite giapponese (JE), ma questo è migliorato notevolmente con la crescente disponibilità di vari tipi di vaccinazioni2. Le risposte immunitarie protettive adattative evocate dall’infezione naturale o dalla vaccinazione contribuiscono alla prevenzione e alla regolazione antivirale. L’immunità umorale e l’immunità cellulo-mediata sono classificate come immunità adattativa e l’induzione della prima è sempre stata considerata una strategia chiave nella progettazione di vaccini, sebbene con una comprensione relativamente limitata negli ultimi3. Tuttavia, il ruolo dell’immunità mediata dalle cellule T nel limitare la diffusione del flavivirus e la clearance del virus è stato sempre più focalizzato e ampiamente studiato4. Inoltre, l’immunità delle cellule T non è solo indispensabile nelle risposte antivirali specifiche per JEV, ma svolge anche un ruolo di primo piano nella protezione incrociata dall’infezione secondaria con flavivirus eterologhi, che è stato dimostrato in studi precedenti5. Si ipotizza che questo effetto possa bypassare potenziali effetti di potenziamento mediati da anticorpi nell’infezione5. Da notare, tale immunità delle cellule T cross-reattive è importante, specialmente in assenza di vaccini e farmaci antivirali contro i flavivirus. Sebbene siano stati condotti molti studi per determinare il contributo delle cellule T nell’infezione da JEV rispetto alle cellule T CD4+ e CD8+ 6,7, le rispettive linee che secernono citochine e la loro diversificazione funzionale rimangono indeterminate, il che significa che la delucidazione delle esatte funzioni delle cellule T helper e killer è ostacolata.
La scala delle loro difese antivirali determina la qualità delle risposte delle cellule T. Le cellule T CD4+ o CD8+ che possono conferire compatibilmente due o più funzioni, tra cui la secrezione e la degranulazione delle citochine, sono caratterizzate come cellule T polifunzionali (TPFs) dopo stimolazione specificaa livello 8 di singola cellula. Le cellule T CD4 + che producono citochine singole o multiple possono avere vari effetti e memorie immunitarie. Ad esempio, le cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ hanno maggiori probabilità di formare una risposta protettiva efficace a lungo termine rispetto alle cellule T IL-2+ CD4+ 9, che possono essere utilizzate come parametro importante nella valutazione dell’effetto della vaccinazione. La frequenza delle cellule T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ è aumentata nei pazienti con non-progressione a lungo termine della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), mentre le cellule T CD4+ nei pazienti con progressione dell’AIDS sono più inclini a produrre IFN-γ da solo a causa dell’effetto promotore di IL-2 sulla proliferazione delle cellule T10. Inoltre, un sottogruppo di IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ ha dimostrato di sopravvivere a lungo termine in vivo e promuovere sinergicamente la funzione di uccisione11. Sebbene le cellule T CD8+ abbiano maggiori probabilità di mostrare attività citotossica, alcune cellule T CD4+ sono anche dotate di attività citotossica come espressione rilevata indirettamente delle molecole di superficie CD107a12. Inoltre, alcuni sottogruppi di cellule T esprimono la chemochina MIP-1α, che è spesso secreta dai monociti per partecipare al reclutamento dei neutrofili mediato dalle cellule T13. Allo stesso modo, CD8+ TPFs può anche essere utilizzato per caratterizzare la versatilità dei marcatori di cui sopra. Gli studi hanno dimostrato che la strategia prime-boost può effettivamente indurre un periodo prolungato di effetti protettivi TPF 13, che possono migliorare la protezione suscitata dalla vaccinazione. Una caratteristica centrale nell’esame del sistema immunitario è la capacità delle cellule T di memoria di facilitare risposte più forti, più veloci e più efficaci alle sfide virali secondarie rispetto alle cellule T naïve. Le cellule T della memoria effettrice (TEM) e le cellule T della memoria centrale (TCM) sono importanti sottoinsiemi di cellule T che sono spesso differenziate dall’espressione composita di CD27/CD45RO o CCR7/CD45RA14. La TCM (CD27+ CD45RO+ o CCR7+ CD45RA-) tende a localizzarsi nei tessuti linfoidi secondari, mentre la TEM (CD27- CD45RO+ o CCR7– CD45RA–) si localizza nei tessuti linfoidi e periferici15,16. TEM fornisce una difesa immediata ma non sostenuta, mentre TCM sostiene la risposta proliferando negli organi linfoidi secondari e generando nuovi effettori17. Pertanto, dato che le cellule di memoria possono mediare risposte di richiamo specifiche ed efficienti ai virus, sorgono domande sul contributo di questo sottoinsieme di polifunzioni.
Con lo sviluppo della tecnologia di citometria a flusso, è diventato comune rilevare simultaneamente marcatori di oltre 10 cluster, fenotipi e antigeni di differenziazione, il che è utile per annotare più abbondantemente le caratteristiche immunologiche funzionali sulle singole cellule T per ridurre l’interpretazione errata e le difficoltà nella comprensione dei fenotipi delle cellule T. Questo studio ha utilizzato la stimolazione ex vivo e la citometria a flusso per analizzare i profili TPF nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) all’interno di bambini vaccinati con JEV. Applicando questo approccio, verrà ampliata la comprensione dell’immunità delle cellule T JEV-specifica e persino cross-reattiva a breve e lungo termine indotta dalla vaccinazione.
Questo protocollo rappresenta un metodo di rilevazione fattibile basato sulla citometria a flusso per i profili TPF nelle PBMC di bambini vaccinati con il vaccino JEV SA14-14-2. Questo studio ha utilizzato le PBMC del sangue venoso di bambini vaccinati e non vaccinati come materiali di ricerca. Con la stimolazione delle PBMC con l’antigene JEV, quellePF Tamplificate antigene-specifiche possono essere caratterizzate dalla colorazione anticorpale con citometria a flusso multicolore. Rispetto al metodo…
The authors have nothing to disclose.
R.W. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82002130), dalla Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. è stato supportato dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |