הפרוטוקול הנוכחי משלב גירוי ex vivo וציטומטריה של זרימה כדי לנתח פרופילים של תאי T פוליפונקציונליים (T PF) בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בתוך ילדים שחוסנו בנגיף דלקת המוח היפנית (JEV). שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים של ציטומטריה של TPFs ספציפיים ל- JEV נבדקו כדי לספק סימוכין למחקרים דומים.
חסינות בתיווך תאי T ממלאת תפקיד חשוב בשליטה על זיהום בנגיף הפלבי, לאחר חיסון או לאחר הדבקה טבעית. יש להעריך את “איכותו” של תא T לפי תפקוד, ותפקוד גבוה יותר נקשר להגנה חזקה יותר על מערכת החיסון. תאי T שיכולים לייצר בו-זמנית שני ציטוקינים או כימוקינים או כימוקינים ברמת התא הבודד נקראים תאי T רב-תפקודיים (TPFs), אשר מתווכים תגובות חיסוניות באמצעות מגוון מנגנונים מולקולריים כדי לבטא סמני פירוק (CD107a) ולהפריש אינטרפרון (IFN)-γ, גורם נמק גידולי (TNF)-α, אינטרלוקין (IL)-2, או חלבון דלקתי מקרופאגים (MIP)-1α. ישנן עדויות הולכות וגוברות לכך ש- TPFs קשורים קשר הדוק לשמירה על זיכרון חיסוני לטווח ארוך והגנה וכי שיעורם המוגבר הוא סמן חשוב של חסינות מגן והוא חשוב בשליטה יעילה של זיהום ויראלי והפעלה מחדש. הערכה זו חלה לא רק על תגובות חיסוניות ספציפיות, אלא גם על הערכת תגובות חיסוניות צולבות. כאן, אם ניקח את נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) כדוגמה, נבדקה שיטת הזיהוי וסכמת הצבעים הציטומטריה של TPFספציפי ל- JEV המיוצר על ידי תאי דם חד-גרעיניים היקפיים של ילדים שחוסנו נגד דלקת המוח היפנית כדי לספק התייחסות למחקרים דומים.
נגיף דלקת המוח היפנית (JEV) הוא נגיף חשוב המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus בתוך משפחת Flaviviridae1. מדינות רבות באסיה-פסיפיק מתמודדות זה זמן רב עם אתגרים עצומים בבריאות הציבור בשל נטל התחלואה העצום הנגרם על ידי דלקת המוח היפנית (JE), אך זה השתפר באופן דרמטי עם הזמינות הגוברת של סוגים שונים של חיסונים2. תגובות חיסוניות הגנתיות נרכשות המעוררות על ידי זיהום טבעי או חיסון תורמות למניעה ולוויסות אנטי-ויראלי. חסינות הומורלית וחסינות תאית מסווגות כחסינות מסתגלת, והאינדוקציה של הראשונה תמיד נחשבה לאסטרטגיה מרכזית בתכנון חיסונים, אם כי עם הבנה מוגבלת יחסית ב-3 האחרונים. עם זאת, התפקיד של חסינות בתיווך תאי T בהגבלת הפצת נגיף הפלבי וסילוק הנגיף התמקד יותר ויותר ונחקר בהרחבה4. יתר על כן, חסינות תאי T היא לא רק הכרחית בתגובות אנטי-ויראליות ספציפיות ל-JEV, אלא גם ממלאת תפקיד בולט בהגנה צולבת מפני זיהום משני בנגיפי פלבי הטרולוגיים, שהוכח במחקרים קודמים5. משערים כי השפעה זו עשויה לעקוף השפעות שיפור פוטנציאליות בתיווך נוגדנים בזיהום5. יש לציין כי חסינות תאי T צולבת כזו חשובה, במיוחד בהיעדר חיסונים ותרופות אנטי-ויראליות נגד נגיפי פלבי. למרות שמחקרים רבים בוצעו כדי לקבוע את התרומה של תאי T בזיהום JEV ביחס לתאי CD4+ ו- CD8+ T6,7, השושלות המתאימות המפרישות ציטוקינים והגיוון התפקודי שלהם נותרו בלתי מוגדרות, כלומר הבהרת הפונקציות המדויקות של תאי T מסייעים והורגים מתעכבת.
קנה המידה של ההגנות האנטי-ויראליות שלהם קובע את איכות התגובות של תאי T. תאי CD4+ או CD8+ T שיכולים להעניק באופן תואם שתי פונקציות או יותר, כולל הפרשת ציטוקינים ודה-גרנולציה, מאופיינים כתאי T רב-תכליתיים (TPFs) על גירוי ספציפי ברמת התא הבודד8. לתאי CD4+ T המייצרים ציטוקינים בודדים או מרובים עשויות להיות השפעות שונות וזיכרונות חיסוניים. לדוגמה, תאי IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T נוטים יותר ליצור תגובת הגנה יעילה לטווח ארוך מאשר תאי IL-2+ CD4+ T9, שיכולים לשמש כפרמטר חשוב בהערכת אפקט החיסון. התדירות של IL-2+ IFN-γ+ CD4+ תאי T מוגברת בחולים עם אי-התקדמות ארוכת טווח של תסמונת מחסור חיסוני נרכש (איידס), בעוד שתאי CD4+ T בחולים עם התקדמות איידס נוטים יותר לייצר IFN-γ בלבד בשל ההשפעה המקדמת של IL-2 על התפשטות תאי T10. יתר על כן, תת-קבוצה של IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ הוכחה כשורדה לטווח ארוך in vivo ומקדמת בסינרגיה את פונקציית ההרג11. למרות שתאי CD8+ T נוטים יותר להפגין פעילות ציטוטוקסית, חלק מתאי CD4+ T מצוידים גם בפעילות ציטוטוקסית כביטוי שזוהה בעקיפין של מולקולות CD107a על פני השטח12. בנוסף, תת-קבוצות מסוימות של תאי T מבטאות את הכימוקין MIP-1α, שלעתים קרובות מופרש על ידי מונוציטים כדי להשתתף בגיוס נויטרופילים בתיווך תאי T13. באופן דומה, CD8+ TPFs יכול לשמש גם כדי לאפיין את הרבגוניות של הסמנים לעיל. מחקרים הראו כי אסטרטגיית הדחיפה הראשונית יכולה לגרום ביעילות לתקופה ממושכת של השפעות מגןT PF 13, אשר יכול לשפר את ההגנה שמעורר החיסון. מאפיין מרכזי בבחינת מערכת החיסון הוא היכולת של תאי זיכרון מסוג T לאפשר תגובות חזקות, מהירות ויעילות יותר לאתגרים נגיפיים משניים מאשר תאי T נאיביים. תאי T של זיכרון אפקטים (TEM) ותאי זיכרון T מרכזיים (TCM) הם תת-קבוצות חשובות של תאי T שלעתים קרובות מתמיינות על ידי הביטוי המורכב של CD27/CD45RO או CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ או CCR7+ CD45RA–) נוטה להתמקם ברקמות לימפה משניות, בעוד ש- TEM (CD27- CD45RO+ או CCR7- CD45RA–) מתמקם ברקמות לימפואידיות והיקפיות15,16. TEM מספק הגנה מיידית אך לא מתמשכת, ואילו TCM מקיים את התגובה על ידי שגשוג באיברי הלימפה המשניים ויצירת אפקטים חדשים17. לפיכך, בהתחשב בכך שתאי זיכרון יכולים לתווך תגובות היזכרות ספציפיות ויעילות לווירוסים, מתעוררות שאלות לגבי תרומתה של תת-קבוצה זו של פוליפונקציות.
עם התפתחות טכנולוגיית ציטומטריה של זרימה, זה הפך נפוץ לזהות בו זמנית סמנים של יותר מ -10 אשכולות, פנוטיפים ואנטיגנים התמיינות, אשר מועיל לבאר בשפע רב יותר את התכונות החיסוניות הפונקציונליות על תאי T בודדים כדי להפחית פרשנות שגויה וקשיים בהבנה של פנוטיפים של תאי T. מחקר זה השתמש בגירוי ex vivo ובציטומטריית זרימה כדי לנתח פרופיליT PF בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) בקרב ילדים שחוסנו ב-JEV. ביישום גישה זו, תורחב ההבנה של חסינות תאי T ספציפיים ל-JEV לטווח קצר וארוך ואף צולבת הנגרמת על ידי חיסון.
פרוטוקול זה מייצג שיטת זיהוי אפשרית מבוססת ציטומטריה של זרימה עבור פרופיליT PF ב- PBMCs של ילדים שחוסנו בחיסון JEV SA14-14-2. מחקר זה השתמש ב-PBMCs בדם ורידי של ילדים מחוסנים ולא מחוסנים כאחד כחומרי מחקר. עם הגירוי של PBMCs עם אנטיגן JEV, אלה אנטיגן מוגבר ספציפי TPFs יכול להיות מאופיין על ידי כתמים…
The authors have nothing to disclose.
R.W. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג’ינג למדעי הטבע של סין (7222059). ZD.X. נתמך על ידי קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |