O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.
A imunidade mediada por células T desempenha um papel importante no controle da infecção por flavivírus, seja após a vacinação ou após a infecção natural. A “qualidade” de uma célula T precisa ser avaliada por função, e uma função mais alta está associada a uma proteção imunológica mais poderosa. As células T que podem produzir simultaneamente duas ou mais citocinas ou quimiocinas no nível de célula única são chamadas de células T polifuncionais (TPFs), que medeiam respostas imunes através de uma variedade de mecanismos moleculares para expressar marcadores de degranulação (CD107a) e secretar interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 ou proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1α. Há evidências crescentes de que asT PFestão intimamente relacionadas à manutenção da memória e proteção imunológica a longo prazo e que sua proporção aumentada é um importante marcador de imunidade protetora e é importante no controle efetivo da infecção viral e reativação. Esta avaliação aplica-se não só a respostas imunitárias específicas, mas também à avaliação de respostas imunitárias reativas cruzadas. Aqui, tomando o vírus da encefalite japonesa (JEV) como exemplo, o método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFespecíficos do JEV produzidos por células mononucleares do sangue periférico de crianças vacinadas contra a encefalite japonesa foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.
O vírus da encefalite japonesa (JEV) é um importante vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae1. Muitos países da Ásia-Pacífico há muito enfrentam enormes desafios de saúde pública devido à enorme carga de doenças causadas pela encefalite japonesa (JE), mas isso melhorou drasticamente com a crescente disponibilidade de vários tipos de vacinas2. As respostas imunes protetoras adaptativas evocadas pela infecção natural ou vacinação contribuem para a prevenção e regulação antiviral. A imunidade humoral e a imunidade mediada por células são classificadas como imunidade adaptativa, e a indução da primeira sempre foi considerada uma estratégia-chave no desenho da vacina, embora com compreensão relativamente limitada no passado3. No entanto, o papel da imunidade mediada por células T na limitação da disseminação e depuração do flavivírus tem sido cada vez mais focado e extensivamente estudado4. Além disso, a imunidade das células T não é apenas indispensável nas respostas antivirais específicas do JEV, mas também desempenha um papel proeminente na proteção cruzada contra infecção secundária por flavivírus heterólogos, o que foi demonstrado em estudos anteriores5. Especula-se que esse efeito possa ignorar potenciais efeitos de realce mediados por anticorpos na infecção5. É importante ressaltar que essa imunidade de células T reativas cruzadas é importante, especialmente na ausência de vacinas e medicamentos antivirais contra flavivírus. Embora muitos estudos tenham sido realizados para determinar a contribuição das células T na infecção por JEV em relação às células T CD4+ e CD8+ 6,7, as respectivas linhagens secretoras de citocinas e sua diversificação funcional permanecem indeterminadas, o que significa que a elucidação das funções exatas das células T auxiliares e assassinas é dificultada.
A escala de suas defesas antivirais determina a qualidade das respostas das células T. As células T CD4+ ou CD8+ que podem conferir de forma compatível duas ou mais funções, incluindo secreção e degranulação de citocinas, são caracterizadas como células T polifuncionais (TPFs) após estimulação específica no nível de célula única8. As células T CD4+ que produzem citocinas únicas ou múltiplas podem ter vários efeitos e memórias imunológicas. Por exemplo, as células T IL-2+ IFN-γ+ CD4+ são mais propensas a formar uma resposta protetora eficaz a longo prazo do que as células T IL-2+ CD4+ 9, que podem ser usadas como um parâmetro importante na avaliação do efeito da vacinação. A frequência de IL-2+ IFN-γ+ células T CD4+ está aumentada em pacientes com não progressão a longo prazo da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), enquanto as células T CD4+ em pacientes com progressão da AIDS estão mais inclinadas a produzir IFN-γ isoladamente devido ao efeito promotor da IL-2 na proliferação de células T10. Além disso, um subconjunto de IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ demonstrou sobreviver a longo prazo in vivo e promover sinergicamente a função de morte11. Embora as células T CD8+ sejam mais propensas a exibir atividade citotóxica, algumas células T CD4+ também estão equipadas com atividade citotóxica como uma expressão indiretamente detectada de moléculas CD107a de superfície12. Além disso, certos subconjuntos de células T expressam a quimiocina MIP-1α, que é frequentemente secretada pelos monócitos para participar do recrutamento de neutrófilos mediados por células T13. Da mesma forma, o CD8+ TPFs também pode ser usado para caracterizar a versatilidade dos marcadores acima. Estudos têm demonstrado que a estratégia prime-boost pode efetivamente induzir um período prolongado de efeitos protetores da TPF 13, o que pode aumentar a proteção provocada pela vacinação. Uma característica central no exame do sistema imunológico é a capacidade das células T de memória de facilitar respostas mais fortes, rápidas e eficazes a desafios virais secundários do que as células T ingênuas. As células T de memória efetora (T EM) e as células T de memória central (TCM) são subconjuntos importantes de células T que são frequentemente diferenciados pela expressão composta de CD27/CD45RO ou CCR7/CD45RA14. O TCM (CD27+ CD45RO+ ou CCR7+ CD45RA-) tende a se localizar nos tecidos linfoides secundários, enquanto o TEM (CD27- CD45RO+ ou CCR7- CD45RA-) localiza-se nos tecidos linfoides e periféricos 15,16. O TEM fornece defesa imediata, mas não sustentada, enquanto o TCM sustenta a resposta proliferando nos órgãos linfoides secundários e gerando novos efetores17. Assim, dado que as células de memória podem mediar respostas de recordação específicas e eficientes aos vírus, surgem questões sobre a contribuição desse subconjunto de polifunções.
Com o desenvolvimento da tecnologia de citometria de fluxo, tornou-se comum detectar simultaneamente marcadores de mais de 10 clusters, fenótipos e antígenos de diferenciação, o que é benéfico para anotar mais abundantemente as características imunológicas funcionais em células T individuais para reduzir a má interpretação e as dificuldades na compreensão dos fenótipos de células T. Este estudo utilizou estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis de TPF em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com JEV. Aplicando essa abordagem, a compreensão da imunidade de células T específica de JEV de curto e longo prazo e até mesmo cruzada reativa induzida pela vacinação será expandida.
Este protocolo representa um método viável de detecção baseado em citometria de fluxo para perfis de TPF nos PBMCs de crianças vacinadas com a vacina JEV SA14-14-2. Este estudo utilizou como material de pesquisa os PBMCs de sangue venoso de crianças vacinadas e não vacinadas. Com a estimulação de PBMCs com o antígeno JEV,esses PFsT específicos de antígeno amplificados podem ser caracterizados pela coloração de anticorpos de citometria de fluxo multicolorida. Em comparação com o méto…
The authors have nothing to disclose.
R.W. foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim da China (7222059). A ZD.X. foi apoiada pelo Fundo de Inovação CAMS para as Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |