Måling af lipolysehastigheden i ex vivo murine fedtvæv og primære preadipocytter differentieret in vitro

Summary

Triglyceridlipolyse i adipocytter er en vigtig metabolisk proces, der resulterer i frigørelse af frie fedtsyrer og glycerol. Her giver vi en detaljeret protokol til måling af basal og stimuleret lipolyse i adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus.

Abstract

Adipocytter opbevarer energi i form af triglycerider i lipiddråber. Denne energi kan mobiliseres via lipolyse, hvor fedtsyresidekæderne sekventielt spaltes fra glycerolrygraden, hvilket resulterer i frigivelse af frie fedtsyrer og glycerol. På grund af den lave ekspression af glycerolkinase i hvide adipocytter er glycerolgenoptagelseshastigheder ubetydelige, mens fedtsyreoptagelse dikteres af fedtsyrebindingskapaciteten af mediekomponenter såsom albumin. Både glycerol og fedtsyrefrigivelse i medier kan kvantificeres ved kolorimetriske assays for at bestemme den lipolytiske hastighed. Ved at måle disse faktorer på flere tidspunkter kan man bestemme den lineære lipolysehastighed med høj tillid. Her giver vi en detaljeret protokol til måling af lipolyse i in vitro differentierede adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus. Denne protokol kan også optimeres til andre præadipocytcellelinjer eller fedtvæv fra andre organismer; Overvejelser og optimeringsparametre diskuteres. Denne protokol er designet til at være nyttig til bestemmelse og sammenligning af hastigheden af adipocytlipolyse mellem musemodeller og behandlinger.

Introduction

Overskydende næringsstoffer opbevares i hvidt fedtvæv i form af triglycerider i den neutrale lipidkerne af lipiddråber. Triglyceridlagre mobiliseres via lipolyse, en proces, hvorved fedtsyresidekæderne sekventielt spaltes af fedtvævets triglyceridlipase (ATGL), hormonfølsom lipase (HSL) og monoglyceridlipase (MGL), hvilket resulterer i frigivelse af frie fedtsyrer (FFA’er) og glycerolrygraden ^1,2. Lipolyse aktiveres ved catecholamin signalering i fedtvævet. Sympatiske nerveterminaler frigiver lokalt katekolaminer, som binder til β-adrenerge receptorer på adipocytplasmamembranen. Ved ligandbinding aktiverer disse G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) adenylylcyklase via G_αs. Efterfølgende aktivering af proteinkinase A (PKA) af cAMP resulterer i opregulering af både ATGL og HSL. PKA’s phosphorylering af perilipin-1 forårsager dissociation af ABHD5 (også kendt som CGI-58), som binder og coaktiverer^ATGL3. PKA phosphorylerer HSL direkte og fremmer dets translokation fra cytosolen til lipiddråben, hvor interaktion med phosphoryleret perilipin-1 yderligere fremmer dets lipaseaktivitet 4,5,6,7. Den tredje lipase involveret i lipolyse, MGL, synes ikke at være reguleret af catecholamin signalering⁸. Det er vigtigt, at triglyceridsyntese i adipocytter medieres af glycerollipidsyntesevejen, som ikke involverer dannelsen af monoglycerider som et mellemprodukt; i stedet katalyserer glycerol-3-phosphatacyltransferaser dannelsen af lysophosphatidsyre, som kombineres med en anden fedtacyl-CoA til dannelse af phosphatidsyre og derefter isomeriseres til diglycerider før den endelige syntese af triglycerider (figur 1) 9,10,11.

Figur 1: Lipolyse og glycerol lipidsyntese veje. Øverst: Lipolytisk vej; enzymer vist i rødt: fedtvævs triglyceridlipase (ATGL), hormonfølsom lipase (HSL) og monoglyceridlipase (MGL). Nederst: glycerol lipid syntese vej; enzymer vist i grønt: diglyceridacyltransferase (DGAT), phosphatidsyrephosphatase (PAP), lysophosphatidsyreacyltransferase (LPAT, også kendt som LPAAT’er) og glycerol-3-phosphatacyltransferase (GPAT). Lipider: triglycerid (TG), diglycerid (DG), monoglycerid (MG), fri fedtsyre (FFA), fedtacyl-CoA (FA-CoA), lysophosphatidsyre (LPA) og phosphatidsyre (PA). Andre metabolitter: uorganisk phosphat (Pi) og glycerol-3-phosphat (G3P). Klik her for at se en større version af denne figur.

Ekstracellulær adenosin er en anden vigtig regulator af lipolyse, der arbejder gennem G_s– og G_i-koblede GPCR’er for at påvirke adenylcyklaseaktivitet. Den dominerende adenosinreceptor i adipocytter, ADORA1, hæmmer adenylylcyclase og dermed lipolyse gennem aktiveringen af G_i¹². Udtrykt på lavere niveauer, og primært i brune adipocytter, aktiverer ADORA2A lipolyse via G_s signalering¹³. ADORA1 påvirker både basal lipolyse og responsen på adrenerge agonister. Adenosins virkning på lipolyse kan kontrolleres ved tilsætning af adenosindeaminase for at neutralisere adenosin, såvel som den ADORA1-specifikke agonist phenylisopropyladenosin^14,15. Hormonel aktivering af G_q-koblede GPCR’er kan også påvirke lipolyse via aktivering af phospholipase C og proteinkinase C^16,17,18,19. Inflammatoriske signaler påvirker også lipolytiske hastigheder. TLR4-aktivering af LPS (og andre endotoksiner) øger den lipolytiske hastighed ved at aktivere ERK, som phosphorylerer perilipin-1 og HSL²⁰. TNF-α aktiverer også lipolyse via ERK og NF-κB aktivering, samt transkriptionel nedregulering af phosphodiesterase PDE-3B og CIDEC^21,22,23. IL-6 har også været forbundet med øget adipocytlipolyse, især i mesenterisk fedtvæv, hvis FFA-frigivelse påvirker hepatisk steatose og glukoneogenese^24,25,26.

Lipolyse undertrykkes under fodret tilstand af insulin. AKT phosphorylerer og aktiverer PDE-3B for at undertrykke cAMP-signalering og forhindre PKA-aktivering²⁷. Insulin nedregulerer også transkriptionelt ATGL²⁸. Fedme fremmer catecholamin resistens gennem en række mekanismer, herunder nedregulering af β-adrenerge receptorer i adipocytter 29,30,31,32,33. Adipocytter udtrykker alle tre β-adrenerge receptorer (β-1, β-2 og β-3). Mens β-1 og β-2 adrenerge receptorer udtrykkes allestedsnærværende, udtrykkes den β-3 adrenerge receptor overvejende i adipocytter hos mus^34,35. Adrb3-ekspression induceres af C / EBPα under adipogenese³⁶. Den β-3 adrenerge receptor udtrykkes stærkt i modne adipocytter. Aktiveringen af β-1 og β-2 adrenerge receptorer er selvbegrænsende på grund af feedbackhæmning af β-arrestin³⁷. Feedbackhæmning af β-3 adrenerge receptor medieres af andre signalveje, hvilket reducerer Adrb3-ekspression^33,38,39.

Talrige forbindelser kan anvendes til at aktivere adipocytlipolyse. Katekolaminer er store fysiologiske aktivatorer af lipolyse. Noradrenalin (eller noradrenalin) og adrenalin (eller adrenalin) aktiverer alle tre β-adrenerge receptorer⁴⁰. Noradrenalin og adrenalin påvirker også lipolyse via aktivering af α-adrenerg receptorsignalering⁴¹. Almindeligt anvendte β-adrenerge receptoragonister omfatter isoproterenol, som er en ikke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, og β-3 adrenerge receptoragonister CL-316,243 og mirabegron⁴². I betragtning af at adipocytter overvejende udtrykker den β-3 adrenerge receptor, bruger vi CL-316,243 som et eksempel her. Dens specificitet for β-3 adrenerge receptor gør det også til en relativt specifik aktivator af adipocyt catecholamin signalering, der også sikkert kan anvendes in vivo. Bemærk, at den almindeligt anvendte koncentration på 10 μM CL-316,243 i cellekultur er størrelsesordener højere end den ~ 0,1 μM dosis, der kræves for at opnå et maksimalt respons³³. Forskolin omgår den adrenerge receptor, direkte aktivering af adenylylcyklase og nedstrøms lipolytisk signalering. Der er mange flere aktivatorer, såvel som suppressorer af lipolyse. Når du vælger en forbindelse til stimulering af lipolyse, bør receptorspecificiteten og nedstrøms signalveje overvejes nøje inden for det eksperimentelle design.

Lipolysehastigheden i hvidt fedtvæv er en vigtig metabolisk faktor, der påvirker kuldetolerance og næringsstoftilgængelighed under faste eller motion^43,44,45,46. Formålet med denne protokol er at måle lipolysehastigheden i adipocytter og fedtvæv, hvilket vil lette forståelsen af adipocytmetabolisme, og hvordan det kan påvirke den metaboliske fænotype af forskellige murine modeller. For at kvantificere den lipolytiske hastighed måler vi udseendet af lipolytiske produkter i medierne (dvs. FFA’er og glycerol). Metoden er afhængig af frigivelsen af lipolytiske produkter fra adipocytten i medierne. Da hvide adipocytter udtrykker lave niveauer af glycerolkinase, er glycerolgenoptagelseshastigheder lave⁴⁷. Omvendt bør produktionen af FFA’er og glycerol ad andre metaboliske veje end lipolyse også tages i betragtning. Adipocytter synes at udtrykke en fosfatase med aktivitet mod glycerol-3-phosphat, hvilket muliggør produktion af glycerol fra glycerol-3-phosphat afledt af glucose^48,49,50. Glykolyse er en kilde til glycerol-3-phosphat, der anvendes til FFA-reesterificering i hvide adipocytter. Når glukoseniveauerne er begrænsede, kræver glyceroneogenese andre 3-carbonkilder, såsom lactat og pyruvat⁵¹. Kanaliseringen af FFA’er frigivet ved lipolyse i cellen og deres metaboliske skæbne er dårligt forstået; FFA’er frigivet ved lipolyse skal omdannes til fedtacyl-CoA, før de reesterificeres eller gennemgår β-oxidation. Det ser ud til, at FFA’er frigivet ved lipolyse sandsynligvis forlader cellen, før de tages op igen og omdannes til fedtacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA’er kan sekvestreres uden for cellen med albumin. Det er vigtigt, at langkædede FFA’er er kendt for at feedback-hæmme lipolyse, hvis de ikke er sekvestreret af albumin 63,64,65,66,67. Således er optimering af mediets FFA-bufferkapacitet under lipolyseanalysen kritisk. Proceduren beskrevet her svarer til tidligere offentliggjorte metoder til måling af lipolytisk hastighed i adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus og mennesker 15,68,69,70,71. Denne protokol adskiller sig ved brug af seriel prøveudtagning; Ved at udføre seriel prøveudtagning kan vi internt validere, at lipolyse måles i den lineære fase og bruge flere målinger til at beregne lipolysehastigheden og derved reducere målefejl for at øge tilliden til den endelige beregnede værdi. Ulempen ved seriel prøveudtagning er, at analysen kræver mere tid og reagenser; Den længere tidsramme reducerer imidlertid målefejlens indvirkning på standardfejlen i estimaterne af satsen. Derudover måler denne protokol både FFA- og glycerolfrigivelse og overvejer forholdet mellem FFA: glycerolfrigivelse med det formål at opnå et 3: 1-forhold, som det ville forventes ved fuldstændig lipolyse og frigivelse af lipolytiske produkter i medierne⁷².

Protocol

Brugen af alle dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medical College of Cornell University. 1. Klargøring af puffer og opsamlingsplader Lav 5% bovin serumalbumin (BSA) ved at opløse 5 g BSA i 100 ml af Dulbeccos modificerede Eagle’s medium (DMEM) uden phenolrød. Rør forsigtigt BSA for at opløse (omrystning er kontraproduktiv). Når BSA er helt opløst, filtreres mediet med et 0,2 μm filter. Opbevar BSA-mediet…

Representative Results

Vi målte den basale og stimulerede lipolytiske hastighed af in vitro differentierede adipocytter. Primære præadipocytter fra inguinalt hvidt fedtvæv blev differentieret til adipocytter ved behandling af sammenflydende celler med 5 μM dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin og 1 μM troglitazon i 4 dage, efterfulgt af yderligere 3 dages behandling med 1 μg/ml insulin. Celler blev inkuberet i medier uden insulin i 24 timer før lipolyseanalysen. På tidspunktet = 0h blev cellerne vasket en gang med PBS, …

Discussion

Her giver vi en grundlæggende protokol til måling af lipolysehastigheden i adipocytter og ex vivo fedtvæv. For at kvantificere lipolyse er det vigtigt at måle lipolytisk hastighed i den lineære fase. Vi bruger en seriel prøveudtagningsteknik, hvor en stor del af medierne indsamles og erstattes med friske medier med jævne mellemrum. Denne semikonservative metode giver mulighed for tilsætning af frisk BSA med FFA-bufferkapacitet og forsinker feedbackhæmning, hvilket forlænger varigheden af lineær lipoly…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work