Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling af lipolysehastigheden i ex vivo murine fedtvæv og primære preadipocytter differentieret in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Triglyceridlipolyse i adipocytter er en vigtig metabolisk proces, der resulterer i frigørelse af frie fedtsyrer og glycerol. Her giver vi en detaljeret protokol til måling af basal og stimuleret lipolyse i adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus.

Abstract

Adipocytter opbevarer energi i form af triglycerider i lipiddråber. Denne energi kan mobiliseres via lipolyse, hvor fedtsyresidekæderne sekventielt spaltes fra glycerolrygraden, hvilket resulterer i frigivelse af frie fedtsyrer og glycerol. På grund af den lave ekspression af glycerolkinase i hvide adipocytter er glycerolgenoptagelseshastigheder ubetydelige, mens fedtsyreoptagelse dikteres af fedtsyrebindingskapaciteten af mediekomponenter såsom albumin. Både glycerol og fedtsyrefrigivelse i medier kan kvantificeres ved kolorimetriske assays for at bestemme den lipolytiske hastighed. Ved at måle disse faktorer på flere tidspunkter kan man bestemme den lineære lipolysehastighed med høj tillid. Her giver vi en detaljeret protokol til måling af lipolyse i in vitro differentierede adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus. Denne protokol kan også optimeres til andre præadipocytcellelinjer eller fedtvæv fra andre organismer; Overvejelser og optimeringsparametre diskuteres. Denne protokol er designet til at være nyttig til bestemmelse og sammenligning af hastigheden af adipocytlipolyse mellem musemodeller og behandlinger.

Introduction

Overskydende næringsstoffer opbevares i hvidt fedtvæv i form af triglycerider i den neutrale lipidkerne af lipiddråber. Triglyceridlagre mobiliseres via lipolyse, en proces, hvorved fedtsyresidekæderne sekventielt spaltes af fedtvævets triglyceridlipase (ATGL), hormonfølsom lipase (HSL) og monoglyceridlipase (MGL), hvilket resulterer i frigivelse af frie fedtsyrer (FFA'er) og glycerolrygraden 1,2. Lipolyse aktiveres ved catecholamin signalering i fedtvævet. Sympatiske nerveterminaler frigiver lokalt katekolaminer, som binder til β-adrenerge receptorer på adipocytplasmamembranen. Ved ligandbinding aktiverer disse G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) adenylylcyklase via Gαs. Efterfølgende aktivering af proteinkinase A (PKA) af cAMP resulterer i opregulering af både ATGL og HSL. PKA's phosphorylering af perilipin-1 forårsager dissociation af ABHD5 (også kendt som CGI-58), som binder og coaktivererATGL3. PKA phosphorylerer HSL direkte og fremmer dets translokation fra cytosolen til lipiddråben, hvor interaktion med phosphoryleret perilipin-1 yderligere fremmer dets lipaseaktivitet 4,5,6,7. Den tredje lipase involveret i lipolyse, MGL, synes ikke at være reguleret af catecholamin signalering8. Det er vigtigt, at triglyceridsyntese i adipocytter medieres af glycerollipidsyntesevejen, som ikke involverer dannelsen af monoglycerider som et mellemprodukt; i stedet katalyserer glycerol-3-phosphatacyltransferaser dannelsen af lysophosphatidsyre, som kombineres med en anden fedtacyl-CoA til dannelse af phosphatidsyre og derefter isomeriseres til diglycerider før den endelige syntese af triglycerider (figur 1) 9,10,11.

Figure 1
Figur 1: Lipolyse og glycerol lipidsyntese veje. Øverst: Lipolytisk vej; enzymer vist i rødt: fedtvævs triglyceridlipase (ATGL), hormonfølsom lipase (HSL) og monoglyceridlipase (MGL). Nederst: glycerol lipid syntese vej; enzymer vist i grønt: diglyceridacyltransferase (DGAT), phosphatidsyrephosphatase (PAP), lysophosphatidsyreacyltransferase (LPAT, også kendt som LPAAT'er) og glycerol-3-phosphatacyltransferase (GPAT). Lipider: triglycerid (TG), diglycerid (DG), monoglycerid (MG), fri fedtsyre (FFA), fedtacyl-CoA (FA-CoA), lysophosphatidsyre (LPA) og phosphatidsyre (PA). Andre metabolitter: uorganisk phosphat (Pi) og glycerol-3-phosphat (G3P). Klik her for at se en større version af denne figur.

Ekstracellulær adenosin er en anden vigtig regulator af lipolyse, der arbejder gennem Gs- og Gi-koblede GPCR'er for at påvirke adenylcyklaseaktivitet. Den dominerende adenosinreceptor i adipocytter, ADORA1, hæmmer adenylylcyclase og dermed lipolyse gennem aktiveringen af Gi12. Udtrykt på lavere niveauer, og primært i brune adipocytter, aktiverer ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 påvirker både basal lipolyse og responsen på adrenerge agonister. Adenosins virkning på lipolyse kan kontrolleres ved tilsætning af adenosindeaminase for at neutralisere adenosin, såvel som den ADORA1-specifikke agonist phenylisopropyladenosin14,15. Hormonel aktivering af Gq-koblede GPCR'er kan også påvirke lipolyse via aktivering af phospholipase C og proteinkinase C16,17,18,19. Inflammatoriske signaler påvirker også lipolytiske hastigheder. TLR4-aktivering af LPS (og andre endotoksiner) øger den lipolytiske hastighed ved at aktivere ERK, som phosphorylerer perilipin-1 og HSL20. TNF-α aktiverer også lipolyse via ERK og NF-κB aktivering, samt transkriptionel nedregulering af phosphodiesterase PDE-3B og CIDEC21,22,23. IL-6 har også været forbundet med øget adipocytlipolyse, især i mesenterisk fedtvæv, hvis FFA-frigivelse påvirker hepatisk steatose og glukoneogenese24,25,26.

Lipolyse undertrykkes under fodret tilstand af insulin. AKT phosphorylerer og aktiverer PDE-3B for at undertrykke cAMP-signalering og forhindre PKA-aktivering27. Insulin nedregulerer også transkriptionelt ATGL28. Fedme fremmer catecholamin resistens gennem en række mekanismer, herunder nedregulering af β-adrenerge receptorer i adipocytter 29,30,31,32,33. Adipocytter udtrykker alle tre β-adrenerge receptorer (β-1, β-2 og β-3). Mens β-1 og β-2 adrenerge receptorer udtrykkes allestedsnærværende, udtrykkes den β-3 adrenerge receptor overvejende i adipocytter hos mus34,35. Adrb3-ekspression induceres af C / EBPα under adipogenese36. Den β-3 adrenerge receptor udtrykkes stærkt i modne adipocytter. Aktiveringen af β-1 og β-2 adrenerge receptorer er selvbegrænsende på grund af feedbackhæmning af β-arrestin37. Feedbackhæmning af β-3 adrenerge receptor medieres af andre signalveje, hvilket reducerer Adrb3-ekspression33,38,39.

Talrige forbindelser kan anvendes til at aktivere adipocytlipolyse. Katekolaminer er store fysiologiske aktivatorer af lipolyse. Noradrenalin (eller noradrenalin) og adrenalin (eller adrenalin) aktiverer alle tre β-adrenerge receptorer40. Noradrenalin og adrenalin påvirker også lipolyse via aktivering af α-adrenerg receptorsignalering41. Almindeligt anvendte β-adrenerge receptoragonister omfatter isoproterenol, som er en ikke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, og β-3 adrenerge receptoragonister CL-316,243 og mirabegron42. I betragtning af at adipocytter overvejende udtrykker den β-3 adrenerge receptor, bruger vi CL-316,243 som et eksempel her. Dens specificitet for β-3 adrenerge receptor gør det også til en relativt specifik aktivator af adipocyt catecholamin signalering, der også sikkert kan anvendes in vivo. Bemærk, at den almindeligt anvendte koncentration på 10 μM CL-316,243 i cellekultur er størrelsesordener højere end den ~ 0,1 μM dosis, der kræves for at opnå et maksimalt respons33. Forskolin omgår den adrenerge receptor, direkte aktivering af adenylylcyklase og nedstrøms lipolytisk signalering. Der er mange flere aktivatorer, såvel som suppressorer af lipolyse. Når du vælger en forbindelse til stimulering af lipolyse, bør receptorspecificiteten og nedstrøms signalveje overvejes nøje inden for det eksperimentelle design.

Lipolysehastigheden i hvidt fedtvæv er en vigtig metabolisk faktor, der påvirker kuldetolerance og næringsstoftilgængelighed under faste eller motion43,44,45,46. Formålet med denne protokol er at måle lipolysehastigheden i adipocytter og fedtvæv, hvilket vil lette forståelsen af adipocytmetabolisme, og hvordan det kan påvirke den metaboliske fænotype af forskellige murine modeller. For at kvantificere den lipolytiske hastighed måler vi udseendet af lipolytiske produkter i medierne (dvs. FFA'er og glycerol). Metoden er afhængig af frigivelsen af lipolytiske produkter fra adipocytten i medierne. Da hvide adipocytter udtrykker lave niveauer af glycerolkinase, er glycerolgenoptagelseshastigheder lave47. Omvendt bør produktionen af FFA'er og glycerol ad andre metaboliske veje end lipolyse også tages i betragtning. Adipocytter synes at udtrykke en fosfatase med aktivitet mod glycerol-3-phosphat, hvilket muliggør produktion af glycerol fra glycerol-3-phosphat afledt af glucose48,49,50. Glykolyse er en kilde til glycerol-3-phosphat, der anvendes til FFA-reesterificering i hvide adipocytter. Når glukoseniveauerne er begrænsede, kræver glyceroneogenese andre 3-carbonkilder, såsom lactat og pyruvat51. Kanaliseringen af FFA'er frigivet ved lipolyse i cellen og deres metaboliske skæbne er dårligt forstået; FFA'er frigivet ved lipolyse skal omdannes til fedtacyl-CoA, før de reesterificeres eller gennemgår β-oxidation. Det ser ud til, at FFA'er frigivet ved lipolyse sandsynligvis forlader cellen, før de tages op igen og omdannes til fedtacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA'er kan sekvestreres uden for cellen med albumin. Det er vigtigt, at langkædede FFA'er er kendt for at feedback-hæmme lipolyse, hvis de ikke er sekvestreret af albumin 63,64,65,66,67. Således er optimering af mediets FFA-bufferkapacitet under lipolyseanalysen kritisk. Proceduren beskrevet her svarer til tidligere offentliggjorte metoder til måling af lipolytisk hastighed i adipocytter og ex vivo fedtvæv fra mus og mennesker 15,68,69,70,71. Denne protokol adskiller sig ved brug af seriel prøveudtagning; Ved at udføre seriel prøveudtagning kan vi internt validere, at lipolyse måles i den lineære fase og bruge flere målinger til at beregne lipolysehastigheden og derved reducere målefejl for at øge tilliden til den endelige beregnede værdi. Ulempen ved seriel prøveudtagning er, at analysen kræver mere tid og reagenser; Den længere tidsramme reducerer imidlertid målefejlens indvirkning på standardfejlen i estimaterne af satsen. Derudover måler denne protokol både FFA- og glycerolfrigivelse og overvejer forholdet mellem FFA: glycerolfrigivelse med det formål at opnå et 3: 1-forhold, som det ville forventes ved fuldstændig lipolyse og frigivelse af lipolytiske produkter i medierne72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af alle dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medical College of Cornell University.

1. Klargøring af puffer og opsamlingsplader

  1. Lav 5% bovin serumalbumin (BSA) ved at opløse 5 g BSA i 100 ml af Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) uden phenolrød. Rør forsigtigt BSA for at opløse (omrystning er kontraproduktiv). Når BSA er helt opløst, filtreres mediet med et 0,2 μm filter. Opbevar BSA-mediet ved 4 °C i op til 1 måned.
  2. Lav arbejdskoncentrationer af kontrol- og stimuleringsmedier. Kontrolmedier: 5 % BSA-medier med køretøjsstyring. Stimuleringsmedier: 5% BSA-medier med 0,5 μM CL-316.243. Lav friske stimuleringsmedier til hvert eksperiment.
  3. Det medie, der skal bruges, opvarmes til 37 °C. Mærk en plade med 96 brønde til medieindsamling.

2. Forberedelse af prøver

  1. Udfør cellekultur som beskrevet nedenfor. Udfør alt cellearbejde i en steril stinkhætte for at minimere forurening udefra.
    1. Isoler og differentier primære preadipocytter som i73,74.
      1. Plade primære præadipocytter ved høj densitet, såsom 1 x 105 celler / brønd i en 24-brøndplade i 1 ml / brøndkulturmedier (15% føtalt bovint serum (FBS) og 1x penicillin-streptomycin-glutamin i DMEM / F12).
      2. Når cellerne når 100% sammenløb, differentieres med 5 μM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthin, 1 μg / ml insulin og 1 μM thiazolidindion (TZD) i kulturmedier i 3 dage. Skift derefter til dyrkningsmedier med 1 μg / ml insulin i mindst 3 dage for at dyrke lipiddråber. Brug 1 ml/hul medie i 24-brøndspladen.
      3. Skift dyrkningsmediet (1 ml/hul) med insulin hver 2. eller 3. dag. Cellerne kan opretholdes i medier med insulin i op til 2 uger. Brug kun kulturer, hvor differentieringsraterne er over 90% og er ens på tværs af grupper til dette assay, da reduceret differentiering kan fejlfortolkes som en reduktion i lipolytisk hastighed.
      4. Cellerne dyrkes i insulinfrie medier i 24 timer før måling af lipolyse.
        BEMÆRK: Insulin i medierne opretholder lipiddråber, men hæmmer også lipolyse. Inkubation uden insulin i 24 timer muliggør fuld lipolytisk aktivering uden tab af lipiddråbevolumen. I nogle systemer kan det være nødvendigt at forkorte eller forlænge dyrkningstiden uden insulin.
    2. Cellerne vaskes én gang med DPBS for at fjerne resterende serum fra dyrkningsmediet.
      BEMÆRK: Denne protokol inkluderer ikke serumsult, som kan aktivere lipolyse. Serumsult kan anvendes efter forskerens skøn.
  2. Der udføres ex vivo-kultur som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered en 6-brønds plade med en brønd til hvert væv, der skal opsamles fra hver mus. Anbring 4 ml DMEM ved stuetemperatur i hvert hul, der skal bruges.
      BEMÆRK: BSA i indsamlingsmediet er ikke nødvendigt.
    2. Forbered en 48-brøndplade til lipolyseanalysen med en brønd for hver replikat. Der anbringes 400 μL DMEM ved stuetemperatur i hvert hul, der skal bruges. Brug to til fire kontroller og to til fire stimulerede brønde pr. væv pr. Mus.
    3. Aflive musen ved cervikal dislokation under anæstesi med en sekundær metode såsom bilateral pneumothorax. Her brugte vi en 32 g, 7 måneder gammel C57BL/6J hunmus, fodret med en 45% fedtrig kost i 4 måneder.
      BEMÆRK: Denne protokol kan også bruges til mænd, såvel som andre stammer, kostvaner og aldre.
    4. Spray med 70% ethanol og brug en saks til at lave et lille (~ 1 cm) lateralt snit i midten af mavehuden, træk huden fra hinanden ved at klemme hver side med tommelfinger og pegefinger og fold den nedre mavehud over for at afsløre de bageste subkutane depoter. Find og fjern den indinale lymfeknude og stump dissekere det inguinale fedtvæv umiddelbart bagved til den indinale lymfeknude ved hjælp af tang.
    5. For at samle gonadalt fedtvæv skal du lave et lateralt og et lodret snit i bughinden for at få adgang til peritonealhulen. Hold gonadal fedtpude med pincet og skær langs livmoderen (eller epididymis for mænd) for at fjerne gonadal fedtvæv. Anbring de opsamlede depoter i en 6-brønds plade.
    6. Fjern vævet fra brønden, læg det på en silikonemåtte, og skær det i stykker på 5 til 7 mg med en saks.
    7. Der afvejes 25 til 30 mg (fem eller seks stykker) for hver analysebrønd og anbringes i en analyseplade med 48 brønde. Blot vævet på et rent håndklæde inden vejning for at fjerne eventuelle medier. Vej vægtbåden efter fjernelse af vævet, og registrer vægten af eventuelle rester, der er efterladt. Tør vægtbåden ren mellem prøverne og tara igen, hvis det er nødvendigt. Brug en ny vægtbåd til hvert væv.
    8. Når alle vævsprøverne er vejet, anbringes analysepladen med 48 brønde i en 10 % CO2 -inkubator på 37 °C i 15 minutter.

3. Lipolyseanalyse

  1. Udfør medieindsamling. Foretag overførsel af mediet og efterfølgende prøveopsamling i en steril stinkhætte for at minimere potentiel kontaminering fra eksterne kilder.
    1. Ved t = 0 fjernes mediet, og der tilsættes 400 μL pr. hul kontrol- eller stimuleringsmedie, og pladen anbringes i en 37 °C, 10 % CO2 -inkubator. Ved ex vivo-vævskultur fjernes mediet forsigtigt ved hjælp af en pipette. Sug bør aldrig anvendes.
      BEMÆRK: Alternativt kan du forberede en anden plade med kontrol- og stimuleringsmedier og overføre vævene.
    2. Ved t = 1, 2, 3 og 4 timer opsamles 200 μL medier, udskiftes med 200 μL af det relevante kontrol- eller stimuleringsmedie, og analysepladen returneres til inkubatoren. Opbevar opsamlingspladen ved 4 °C. For at bestemme BSA-mediets FFA-bufferkapacitet skal du bruge en ekstra samling ved 24 timer.
      BEMÆRK: Forsøgene kan stoppes her, og de indsamlede medier kan opbevares ved -20 °C.

4. FFA kolorimetrisk assay

  1. Reagenserne opvarmes til stuetemperatur, og en flaske farvereaens A opløses med en flaske opløsningsmiddel A og en flaske farvereagens B med en flaske opløsningsmiddel B. Fra datoen for rekonstitution anvendes disse reagenser bedst inden for 1 uge. Kassér 1 måned efter rekonstitution.
  2. Optø og bland prøverne.
  3. Opret en FFA-standardkurve. Standardopløsningen er 1 mM. Brug følgende volumen med reagenserne til standardkurven: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 fortynding), 10 μL (1:4 fortynding), 10 μL (1:8 fortynding) og 10 μL vand for maksimalt interval. For lave FFA-niveauer kan 10 μL 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0,05 mM standard være mere anvendelige.
  4. Pipettestandarder og prøver til en analyseplade med 96 brønde. Det anbefalede prøvevolumen er 10 μL. Der medlægges tre huller med samme volumen BSA-medier som prøverne til baggrundskorrektion.
    BEMÆRK: Hvis prøvekoncentrationerne falder uden for standardkurvens område, gentages analysen, idet prøvevolumenet justeres til 2-25 μL.
  5. Der tilsættes 150 μL reagens A til hvert hul og blandes. Undgå at generere bobler. Pop eventuelle bobler med en fin gauge nål. Analysepladen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
  6. Absorbansen af pladen aflæses ved 550 nm og 660 nm reference (aflæsning A).
  7. Der tilsættes 75 μL reagens B til hvert hul og blandes. Undgå at generere bobler. Pop eventuelle bobler med en fin gauge nål. Analysepladen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
  8. Absorbansen aflæses igen ved 550 nm og 660 nm reference (aflæsning B).

5. Glycerol kolorimetrisk analyse

  1. Rekonstituér det frie glycerolreagens med 36 ml ultrarent vand og akklimatiser til stuetemperatur. Disse reagenser anvendes bedst inden for få uger. Kassér 2 måneder efter rekonstitution.
  2. Optø og bland prøverne.
  3. Opret en glycerolstandardkurve ved at lave en syvpunkts, 2 gange seriel fortynding af glycerolstandardopløsningen og et vandemne.
    BEMÆRK: Standardkurven er relativt lineær op til 25 μL 2,8 mM glycerol, men ikke lineær ved højere koncentrationer.
  4. Der pipetteres 25 μL hver af standardprøverne og prøves ind i analysepladen med 96 brønde. Medtag tre brønde med BSA-mediet til baggrundskorrektion.
  5. Tilsæt 175 μL frit glycerolreagens til hvert hul og bland. Undgå at generere bobler. Pop eventuelle bobler med en fin gauge nål. Analysepladen inkuberes ved 37 °C i 5 min.
  6. Pladens absorbans aflæses ved 540 nm.

6. Beregning af lipolytisk hastighed

  1. Start med OD-værdier (optisk tæthed). For glycerol skal du bruge A540 OD-værdier direkte. Beregn OD for FFA-analysen efter følgende formel:
    OD = (Læsning B: A 550 - A 660) - (Læsning A: A550 - A 660)
  2. Brug standardkurven til at beregne FFA- og glycerolniveauerne i de indsamlede prøver. Standard OD-værdierne plottes på y-aksen og på x-aksen, brug standardkoncentrationer i forhold til prøvevolumenet (dvs. koncentrationen af brøndene med 20 μL 1 mM FFA-standard på en plade med 10 μL prøver er lig med 2 mM). Tilpas en lineær trendlinje:
    y = mx + b
  3. Undersøg standardkurven visuelt, og fjern eventuelle punkter uden for analysens lineære område. Beregn prøvekoncentrationer ved hjælp af ligningen:
    Prøvekoncentration: x = (OD - b) ÷ m
  4. Juster og genoptag prøver, der falder uden for det lineære analyseområde. For at få den endelige prøvekoncentration trækkes koncentrationen af baggrundshullerne, der kun indeholder BSA-medier, fra koncentrationen af prøverne.
  5. Beregn mol FFA og glycerol produceret af hver prøve på hvert tidspunkt i henhold til formlen:
    Equation 1
    hvor C n = koncentration på tidspunktet t = n Vt = samlet volumen i brønden; Vs = prøveindsamlingsvolumen og M n = mol produceret på tidspunktet t = n (når koncentrationerne er i mM og volumenerne er i ml, er outputtet μMol).
    For eksempler på forskellige tidspunkter:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2 + C3) Vs
    eller
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normaliseres til vævsvægt ved at dividere med vævsvægten for hver prøve i gram for at opnå enheder af μmol / g. For dyrkede celler præsenteres værdier som μmol / brønd. Sørg for, at cellenummeret og differentieringseffektiviteten er sammenlignelige fra brønd til brønd.
    BEMÆRK: Forskelle i spredning eller differentieringseffektivitet vil komplicere fortolkningen af resultater og kræve en anden metode til normalisering (f.eks. normalisering til protein; se diskussion).
  7. Beregn hældningen af den producerede μmol/g (y-akse) versus tid (x-aksen) for hver prøve individuelt.
    1. I et regneark kan dette gøres ved hjælp af funktionen = SLOPE (known_ys,known_xs). Skriv "= SLOPE" i en ny celle (brug derefter markøren til at fremhæve prøveglycerol- eller FFA-værdierne i μmol / g og derefter fremhæve de tilsvarende tidsværdier).
    2. Kontroller dataenes linearitet. R2-værdier er en hurtig måde at bestemme prøvernes linearitet på. I et regneark kan dette gøres ved hjælp af funktionen =RSQ(known_ys.known_xs) på samme måde som beskrevet i trin 6.7.1, men det første input er =RSQ. Sørg for, atR2-værdierne er > 0,98; Lavere værdier angiver afvigelse fra linearitet. Dette kan skyldes en måle-/prøvetagningsfejl eller tab af linearitet.
      1. En anden måde at teste linearitet på er at udføre en lineær regression for hver prøve og plotte resterne. I en statistisk analysesoftware skal du generere en XY-tabel med en enkelt Y-værdi for hvert tidspunkt. Vælg Analysér > Simpel lineær regression, og markér feltet for Restplot , før du trykker på OK. Det resterende plot vises som en ny graf.
  8. Brug FFA- og glycerolproduktionshastigheden (dvs. hældning [(μmol / g / h]) for hver prøve som et individuelt datapunkt til at udføre statistisk analyse og plotværdier, hvis forskellige lipolytiske forhold sammenlignes. Hvis lipolytiske rater sammenlignes på tværs af genotyper, skal du bruge to eller tre prøver pr. dyr som tekniske replikater, og bruge gennemsnittet for et datapunkt pr. dyr, så prøvestørrelsen er lig med antallet af dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi målte den basale og stimulerede lipolytiske hastighed af in vitro differentierede adipocytter. Primære præadipocytter fra inguinalt hvidt fedtvæv blev differentieret til adipocytter ved behandling af sammenflydende celler med 5 μM dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin og 1 μM troglitazon i 4 dage, efterfulgt af yderligere 3 dages behandling med 1 μg/ml insulin. Celler blev inkuberet i medier uden insulin i 24 timer før lipolyseanalysen. På tidspunktet = 0h blev cellerne vasket en gang med PBS, derefter blev phenol rødfri DMEM med 2% BSA, indeholdende enten 10 μM CL-316.243 eller køretøjskontrol, tilsat til hver brønd på 12-brøndpladen. På tidspunktet = 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer blev 50% af mediet opsamlet og erstattet med 2% BSA i phenol rødfri DMEM. FFA- og glycerolniveauerne blev målt i de indsamlede medier og mol FFA, og glycerol udskilt i medier blev beregnet på hvert tidspunkt (figur 2A, B). FFA- og glycerolproduktionen var lineær for 4-timers analysen medR2-værdier på 0,98 og derover. FFA-niveauerne på 4 timer var lidt lave, hvilket indikerer, at lipolytiske satser kan have været aftagende; Analyse med og uden 4 timers tidspunktet havde imidlertid ingen signifikant indvirkning på den beregnede lipolytiske hastighed. Stimulerede lipolytiske rater var signifikant højere end basale rater (figur 2C). Lipolytisk stimulering resulterede i produktion af FFA og glycerol i et næsten 3:1 molært forhold i alle indsamlede prøver, som man kunne forvente fra fuldstændig triglyceridlipolyse uden signifikant genoptagelse eller retention (figur 2D). I de ustimulerede celler var forholdet imidlertid tættere på 1, hvilket tyder på en ikke-lipolytisk kilde til glycerol48,49,50.

Figure 2
Figur 2: Lipolytisk hastighed i in vitro differentierede primære adipocytter. Preadipocytter blev differentieret i en 12-brøndplade. Insulin blev fjernet fra medierne 24 timer før den lipolytiske analyse. På tidspunktet = 0 timer blev cellerne stimuleret med 10 μM CL-316.243 (CL) eller behandlet med køretøj (V) kontrolmedier. Nmol af (A) FFA og (B) glycerol produceret i hver brønd ved hvert tidspunkt blev plottet over tid, og en lineær regressionslinje blev monteret for hver enkelt brønd. (C) FFA-produktionen. (D) Glycerolproduktionens hastighed. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM. (E) Molært forhold mellem FFA:glycerol i de indsamlede medier på hvert tidspunkt. Statistisk analyse i (C) og (D) blev udført ved hjælp af en studerendes t-test; effekten af CL var signifikant ved α = 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

I cellekultur er monolaget af celler i direkte kontakt med medierne, mens celler i midten i væv, der dyrkes ex vivo, ikke er i kontakt med medierne. I ex vivo-kulturer er FFA'er således mere tilbøjelige til at blive bevaret i vævet. Større klumper af væv, som har et lavere overfladeareal til volumenforhold, udviser højere satser for FFA-retention, hvilket resulterer i lavere FFA: glycerolmolære forhold (figur 3A). Med faldende vævsklumpstørrelse nærmer det molære forhold mellem FFA: glycerolfrigivet sig 3: 1 (figur 3A). Vævsbidder kan dog også være for små. Ud over udfordringen ved at arbejde med små stykker fedtvæv udviser 1-2 mg klumper fedtvæv reducerede lipolytiske hastigheder, hvilket tyder på en reduceret levedygtighed og funktionalitet af vævet (figur 3B, C). Selvom det er kedeligt og tidskrævende at skære fedtvæv i bidder af ensartet størrelse og form, er det nødvendigt at opnå sammenlignelige og pålidelige resultater. Vi anbefaler 5 til 10 mg bidder af fedtvæv, men konsistens er vigtigst. Lipolytiske hastigheder kan stadig reproduceres i større vævsstykker, men det er vigtigt at overveje feedbackhæmning af lipolyse ved FFA'er 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figur 3: Effekt af vævsklumpstørrelse på FFA-frigivelse og lipolytisk hastighed. Gonadal hvidt fedtvæv fra en fedtrig kost fodret med kvindelig C57Bl/6J mus blev opsamlet og skåret i bidder af varierende størrelse. Alle brønde indeholdt i alt 25-30 mg fedtvæv; For 25 mg brønde var dette en klump væv; 10 mg brønde havde tre stykker væv hver på ~ 10 mg, 5 mg brøndene indeholdt fem eller seks stykker væv, og 2 mg brøndene indeholdt 13-16 bidder. På tidspunktet = 0 timer blev lipolyse stimuleret med 0,5 μM CL-316.243 (CL), eller kontrolhullerne blev behandlet med køretøj (V). Den beregnede lipolytiske hastighed fra prøver indsamlet efter 1 time, 2 timer og 3 timer afbildes for (A) FFA'er og (B) glycerol. C) Molært forhold mellem FFA:glycerolproduktion i hver brønd. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse i (A) og (B) blev udført ved hjælp af en tovejs ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc analyse, α = 0,05. Effekten af CL var signifikant i alle prøver. Inden for de CL-behandlede prøver var satserne for FFA- og glycerolproduktion signifikant forskellige i alle parvise sammenligninger, undtagen prøverne på 10 mg versus 5 mg. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den negative virkning af FFA-retention kan observeres i 25 mg vævsstykker, som udviser lavere hastigheder af både FFA- og glycerolproduktion ved stimulering (figur 3B, C). Denne feedbackhæmning er også tydelig, når mediernes FFA-bindingskapacitet er for lav (dvs. der er ikke nok BSA i medierne). Da BSA i medierne blev reduceret til 0,5%, blev FFA-frigivelsen reduceret mere end fire gange, og glycerolfrigivelsen reduceret næsten det dobbelte (figur 4A, B). Som en nem tommelfingerregel bør mikromolære niveauer af FFA i medierne ikke nærme sig procentdelen af BSA i medierne (dvs. FFA-niveauer bør forblive under 5 mM FFA i 5% BSA-medier og 0,5 mM i 0,5% BSA-medier [på dette niveau er der 20:3 molært forhold mellem FFA: BSA]). For at teste den maksimale BSA-bufferkapacitet ved fremstilling af BSA-medier skal der indsamles medier fra en 24 timers stimuleret prøve og måles koncentrationen af FFA (koncentrationen vil være høj, så et lavere prøvevolumen eller prøvefortynding anbefales). FFA-akkumuleringen i 5% BSA-medierne efter 24 timers stimulering var ca. 5 mM, mens FFA-indholdet i 0,5% BSA-medierne kun var 0,6 mM (figur 4C). Når man ser på FFA-koncentrationen i de indsamlede medier, kan det ses, at BSA-medie-FFA-bindingskapaciteten på 0,5% er overbelastet (figur 4D). Mens FFA-niveauerne i 5% BSA-medierne er meget højere, overstiger de ikke mediets bufferkapacitet (figur 4D). Ideelt set bør FFA-koncentrationen i medierne forblive under et 3: 1 FFA: BSA-molært forhold (dvs. 2,3 mM FFA i 5% [0,75 mM] BSA).

Figure 4
Figur 4: Utilstrækkelige BSA-niveauer resulterer i reducerede tilsyneladende lipolytiske rater. Gonadal hvidt fedtvæv fra en fedtrig kost fodret kvindelig C57Bl / 6J mus blev indsamlet og skåret i ~ 5 mg bidder. I alt 20-30 mg fedtvæv blev anbragt i hver brønd. På tidspunktet = 0 timer blev lipolysen stimuleret med 0,5 μM CL-316.243 (CL), eller kontrolhullerne blev behandlet med vehikel (V) i enten 5% BSA-medier eller medier, der kun indeholdt 0,5% BSA. Den beregnede lipolytiske hastighed fra prøverne indsamlet efter 4 timer afbildes for (A) FFA'er og (B) glycerol. Effekten af CL var signifikant i alle prøver. Inden for de CL-behandlede prøver var satserne for både FFA- og glycerolproduktion signifikant forskellige mellem 5% og 0,5% BSA-medieforholdene. C) FFA-niveauer i medierne fra de stimulerede brønde efter 24 timer. D) FFA-niveauer i prøverne indsamlet ved 4 timer. E) FFA-standardkurver med og uden forskellige præparater af 5% BSA i DMEM. Optisk densitet beregnet som (Læsning B: A 550 - A 660) - (Læsning A: A550 - A660). F) Glycerolstandardkurve med og uden BSA. Optisk densitet er absorberende ved 540 nm (A540). OD-værdier ved 5,6 mM var ikke lineære og indgik derfor ikke i standardkurven. (G) Hastighed for FFA-frigivelse fra kvindeligt gonadefedtvæv ved anvendelse af forskellige typer BSA i analysemediet. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse i (A) og (B) blev udført ved hjælp af en tovejs ANOVA med en Holm-Sidak post hoc-analyse, * p-værdi < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Det er vigtigt at påpege, at nogle præparater af BSA indeholder FFA'er. Hvert parti BSA bør testes for at sikre, at FFA-indholdet er ubetydeligt (bemærk, at nogle BSA-præparater markedsføres som FFA-fri). Selvom BSA, der ikke specifikt markedsføres som FFA-fri, indeholder BSA, der anvendes her, ikke påviselige FFA'er. Vi testede analysemediet indeholdende FFA-fri BSA (Equitech Bio Inc, BAH66), BSA, der blev brugt i eksperimenter her (Sigma, A9418) og en grovere (billigere) fraktion V BSA (Sigma, 810531). Den FFA-fri BSA og A9418 BSA producerede begge ikke noget baggrundssignal eller ændrede standardkurvehældningen eller skæringspunktet; standardkurverne var overlejrede (figur 4E). Der blev heller ikke observeret nogen effekt af BSA DMEM på glycerolstandardkurven (figur 4F). Fraktionen V BSA frembragte derimod et baggrundssignal i FFA-assayet, hvilket svarede til en FFA-koncentration på 0,3 mM (figur 4E). Denne baggrund flyttede standardkurven op, men påvirkede ikke hældningen væsentligt, hvilket indikerer, at baggrundssubtraktion er tilstrækkelig. Vi udførte også et stimuleret lipolyseeksperiment ved hjælp af disse tre forskellige typer BSA og fandt ud af, at efter baggrundssubtraktion varierede den beregnede lipolysehastighed ikke mellem BSA-formuleringer (figur 4F). Dette er dog ofte ikke tilfældet, især med mindre rene BSA-præparater, som let kan indeholde insulin eller andre komponenter, der påvirker lipolysehastigheden. Hvert parti BSA skal testes og valideres og anvendes konsekvent (dvs. prøver analyseret med forskellige partier BSA er ikke sammenlignelige). Der skal udføres en fuld standardkurve med tilsætning af BSA og DMEM ved validering af hvert parti BSA for at sikre, at det ikke indeholder noget, der interfererer med enzymerne i de kolorimetriske assays.

At tage serielle prøver og erstatte lydstyrken med friske medier hjælper med at sænke FFA-belastningen i mediet under hele eksperimentet. Vi målte lipolytiske satser i gonadefedtvævet fra en hunmus, der blev fodret med en fedtrig kost i 4 måneder. I dette eksperiment blev 5-8 mg vævsstykker (totalvægt på 25-30 mg) inkuberet i 200 μL 5% BSA-medier, og 100 μL blev opsamlet og erstattet ved 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer. FFA- og glycerolniveauer i de indsamlede medier blev målt. Ved 3 timer havde FFA-niveauerne i medierne nået farezonen på 2,3 mM (figur 5A). Feedbackhæmning af lipolyse blev foreslået ved manglende stigning i medie-FFA- og glycerolniveauer ved 4 timer (figur 5A, B). Efter beregning af μmol af FFA og glycerol frigivet på hvert tidspunkt og tilpasning af en lineær kurve er det tydeligt, at den lipolytiske hastighed begynder at falde ved 4 timer i de stimulerede prøver, medR2-værdier så lave som 0,976 for FFA og 0,983 for glycerol (figur 5C, D). Når man ser på restdiagrammet, er det klart, at 4 h-værdierne ligger under den lineære tendens (dvs. residualerne er negative) (figur 5E,F). Udelukkelse af 4 timers tidspunktet øgedeR2-værdierne til 0,997 og 0,998 og derover for henholdsvis FFA og glycerol. Inkludering af 4 timers tidspunktet forårsager et lille, men signifikant fald i de beregnede FFA- og glycerolfrigivelseshastigheder (figur 5G, H).

Figure 5
Figur 5: Beregning af lineær lipolytisk hastighed i ex vivo fedtvæv. Gonadal hvidt fedtvæv fra en fedtrig kost fodret kvindelig C57Bl / 6J mus blev indsamlet og skåret i ~ 5 mg bidder. I alt 20-30 mg fedtvæv blev anbragt i hver brønd. På tidspunktet = 0 timer blev lipolysen stimuleret med 0,5 μM CL-316.243 (CL), eller kontrolhullerne blev behandlet med køretøj (V). Mediesamlinger blev udført ved 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer. (A) FFA og (B) glycerolniveauer i medierne. (C) FFA og (D) glycerolproduktion plottet over tid. Restplader til (E) FFA og (F) glycerolproduktion over tid. Frigivelseshastighed for (G) FFA og (H) glycerol, beregnet med og uden 4 timers tidspunkt. (I) FFA-frigivelse i kvindeligt gonadale fedtvæv. Næsten 50% af medierne ændrede sig efter 1 t, 2 timer og 3 timer. Mellem timer indsamlede 15 min-tiderne 2.75% af medierne uden udskiftning. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse i (G) og (H) blev udført ved hjælp af en tovejs ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc analyse, * p værdi < 0,05. Effekten af CL var signifikant i alle prøver (p-værdi < 0,05). Inden for de CL-behandlede prøver var hastighederne for både FFA- og glycerolproduktion signifikant forskellige mellem beregninger med og uden 4-timers tidspunktet. Klik her for at se en større version af denne figur.

I modsætning til tidligere protokoller bruger denne protokol flere tidspunkter til at bestemme den lipolytiske hastighed, hvilket reducerer målefejl og giver intern validering af, at den lineære lipolysehastighed måles. For at opretholde lipolyse i den lineære fase på hvert indsamlingssted opsamles og udskiftes 50% af mediet. Da linearitet er kritisk, ønskede vi at sikre, at tilsætning af friske medier ikke forårsagede et udbrud af lipolyse ved hver tilføjelse. For at validere lineariteten mellem tidspunkter tog vi en meget lille prøve (2,75%) hvert 15. minut mellem timetiderne fra 1 time til 3 timer uden udskiftning. Ved 1 time, 2 timer og 3 timer blev den normale 50% prøveindsamling foretaget og erstattet. Hastigheden af FFA-frigivelse var lineær mellem de sædvanlige tidspunkter, hvilket indikerer, at der ikke var et udbrud af lipolyse med hver tilsætning af friske medier (figur 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her giver vi en grundlæggende protokol til måling af lipolysehastigheden i adipocytter og ex vivo fedtvæv. For at kvantificere lipolyse er det vigtigt at måle lipolytisk hastighed i den lineære fase. Vi bruger en seriel prøveudtagningsteknik, hvor en stor del af medierne indsamles og erstattes med friske medier med jævne mellemrum. Denne semikonservative metode giver mulighed for tilsætning af frisk BSA med FFA-bufferkapacitet og forsinker feedbackhæmning, hvilket forlænger varigheden af lineær lipolyse. Dette eksperimentelle design forsøger at rekapitulere vaskulariseringen af fedtvæv in vivo, som leverer frisk albumin til at binde frigivet FFA'er75. Denne protokol blev optimeret til at måle lipolyse i murin ex vivo hvidt fedtvæv og inguinalt fedtvæv, primære preadipocytter differentieret in vitro. Protokollen kan sandsynligvis optimeres til at fungere godt i brune og beige fedtdepoter samt fedtvæv fra andre organismer og udødeliggjorte cellelinjer med højt adipogent potentiale. Protokollen giver mulighed for fleksibilitet i musenes alder, køn og kost forud for indsamling af fedtvæv til ex vivo-assays . Nogle manipulationer, såsom faste, kan påvirke den basale lipolytiske hastighed, mens andre interventioner såsom diætinduceret fedme også påvirker hastigheden af stimuleret lipolyse.

Protokollen skal optimeres for hvert eksperimentelt system, afhængigt af om lipolytiske hastigheder er højere eller lavere. For at validere linearitet anbefaler vi at beregneR2-værdierne og se på restplottet. R2-værdierne skal være meget tæt på 1. Ved vurdering af restplottet bør man være på udkig efter negative restværdier på senere tidspunkter, da disse indikerer, at lipolytiske satser falder, og linearitet går tabt. Eksempler på sådanne restområder er vist i figur 5E,F. Eliminering af 4 timers tidspunkter i dette tilfælde giver en mere nøjagtig beregning af den lineære lipolytiske hastighed og forbedrerR2-værdierne. Da hastigheden imidlertid beregnes ud fra flere tidspunkter, er den relativt robust, og medtagelsen af et sådant tidspunkt har kun en lille indvirkning påR2-værdierne og den beregnede lipolysehastighed. Hvis et enkelt tidspunkt bruges til at beregne den lipolytiske hastighed, kan dataene lettere skæves.

Den måde, hvorpå dataene normaliseres, kan også påvirke de relative resultater mellem prøverne. Her anbefaler vi at normalisere ex vivo-vævet til vævsvægten og de primære preadipocytter differentieret in vitro pr. Brønd. Imidlertid er disse normaliseringsteknikker muligvis ikke egnede til alle eksperimentelle systemer. Det er vigtigt, at hvis spredningshastigheden eller differentieringseffektiviteten varierer mellem grupper, er normalisering pr. Brønd ikke hensigtsmæssig. Alternative normaliseringsteknikker omfatter protein, lipid og DNA. Hver normaliseringsmetode har sine fordele og ulemper. Vævsvægt og godt normalisering er enkel og ligetil. Forskelle i adipocytstørrelse kan betyde, at magert fedtvæv indeholder mange flere adipocytter pr. gram end overvægtigt fedtvæv, mens forskelle i differentieringseffektivitet kan resultere i forskelle i antallet af adipocytter pr. Brønd. Lipider kan ekstraheres med organiske opløsningsmidler (fx 2: 1 chloroform: methanol [v / v]) og triglyceridindhold målt ved hjælp af et kolorimetrisk reagens. Mens normalisering til lipidindhold ikke er en traditionelt anvendt metode, er lipiddråberne trods alt organellen, der gennemgår lipolyse, og denne normaliseringsmetode er specifik for adipocytter, hvilket kan være nyttigt, når differentieringshastigheder varierer mellem celler. Efter lipidekstraktion kan 0,1-0,3 N NaOH anvendes til ekstraktion af protein, som derefter kan analyseres ved Bradford- eller BCA-proteinassay68. Alternativt kan prøverne homogeniseres i lysisbuffer, og lipidfraktionen fjernes ved centrifugering70. Bemærk, at lipidforurening vil forstyrre proteinanalyserne. Hvis protein skal bruges til normalisering, skal cellerne vaskes grundigt (mindst tre gange) for at fjerne BSA fra analysemediet. Nogle gange klæber differentierede adipocytter ikke godt til pladen og tolererer ikke de tre vaske, der kræves for at fjerne overskydende BSA. Normalisering til DNA muliggør normalisering til cellenummer og kan udføres med et kommercielt DNA-ekstraktionssæt efterfulgt af kvantificering af total DNA ved absorbans eller realtids PCR-analyse af genkopinummer. Alternativt kan DAPI-farvning efterfulgt af billeddannelse i belagte celler bruges til at tælle kerner og normalisere til cellenummer. Ved normalisering ved anvendelse af cellenummer eller protein er det vigtigt at overveje ikke-adipocytceller i prøven. Fedtvæv indeholder også immun- og endotelceller; I overvægtigt fedtvæv kan betændelse og hypertrofi resultere i så få som 1 ud af 10 kerner, der kommer fra modne adipocytter. Imidlertid bidrager adipocytter stadig til størstedelen af vævets masse- og lipidindhold. For in vitro-differentierede preadipocytter påvirker differentieringseffektiviteten den relative procentdel af modne adipocytter; Når dette er tilfældet, er normalisering kompliceret. Ideelt set bør differentieringseffektiviteten optimeres, før cellerne anvendes til et lipolyseassay. Hvis det ikke er muligt, anbefales normalisering til lipidindhold, hvis lipiddråbevolumenet er ens mellem differentierede adipocytter. Sammenligning af lipolytiske hastigheder på tværs af adipocytkulturer med ulige differentiering kan føre til fejlagtige konklusioner om lipolyse, når den drivende faktor faktisk er adipogenese; Dette er en begrænsning af protokollen.

Langkædede FFA'er feedback-hæmmer lipolyse 63,64,65,66,67. FFA'er akkumuleres, når de ikke er tilstrækkeligt afsondret i medierne. Meget af den fejlfinding, der er forbundet med optimering af måling af lipolyse, er relateret til minimering af FFA-tilbageholdelse. Beregning af det molære forhold mellem FFA: glycerolfrigivelse i medierne hjælper med at identificere problemer relateret til FFA-tilbageholdelse. Hvis molært forhold er 3: 1 for FFA: glycerol, frigives og fanges alle lipolyseprodukter i medierne, mens et forhold under 2: 1 er grund til bekymring. En vigtig overvejelse for ex vivo-assays er størrelsen af fedtvævsklumpen. Større klumper af væv har et lavere overfladeareal til volumenforhold og er således mere tilbøjelige til at bevare FFA'er og udvise reducerede lipolytiske hastigheder som følge heraf (figur 4A, B). Med dette i tankerne er det afgørende at skære fedtvævet for hver prøve i bidder af en ensartet størrelse og form. For at lette FFA-binding i medierne er det også vigtigt at sikre, at medierne indeholder tilstrækkelig BSA til at binde den frigivne FFA. Mediets FFA-bufferkapacitet kan øges ved at øge koncentrationen af BSA eller øge medievolumenet. Det er lige så effektivt at øge indsamlingsvolumen eller frekvens. Hvis man observerer høje lipolytiske hastigheder, men FFA: glycerolforhold under 2: 1, anbefaler vi at øge indsamlingsfrekvensen til hvert 30. minut og stoppe analysen ved 2,5 timer.

Protokollen, der leveres her, er optimeret til mus ex vivo hvidt fedtvæv og primære preadipocytter differentieret in vitro, som begge er meget lipolytiske. Analysen skal optimeres til at måle lipolyse i andre systemer, eller hvis forskelle i den relativt lave basale lipolysehastighed er af særlig interesse. For eksempel har 3T3-L1 adipocytter lavere lipolytisk aktivitet32. Når den lipolytiske hastighed er lav, skal inkubationsvolumenet reduceres (dvs. i stedet for 400 μL pr. hul i en 24-brøndplade skal der anvendes 200 μL i en 24-brøndplade eller 300 μL i en 12-brøndplade og 100-150 μL opsamlet pr. Tidspunkt. Opsamlingsvolumenet bør ikke falde til under 100 μL, da der kræves større prøvevolumener for nøjagtigt at måle lave FFA- og glycerolniveauer. For at analysere glycerol ved hjælp af 50 μL medier pr. prøve skal det frie glycerolreagens opløses i 31 ml vand, og 150 μL reagens anvendes med 50 μL prøve i hvert hul. FFA-niveauer kan måles med 25 μL prøve pr. brønd, måske mere, så længe lineariteten opretholdes. Tidspunkter kan også forlænges for at øge signalet. Ved analyse af lipolytiske hastigheder fra andre celler end hvide adipocytter bør forskelle i cellulær metabolisme overvejes. For eksempel udtrykker brune og beige adipocytter meget højere niveauer af glycerolkinase og er således i stand til at bevare glycerolfrigivelse ved lipolyse76,77. Disse metabolisk aktive celler kan også være i stand til at kanalisere frigivne fedtsyrer i kataboliske eller syntetiske veje uden frigivelse i medierne. FFA's og glycerols metaboliske skæbne i den specifikke celletype, der analyseres, skal tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne af et lipolyseassay, især i en anden celletype end hvide adipocytter. Lipolyseanalyser i andre celletyper skal optimeres og valideres.

Denne protokol er designet til at evaluere forskelle i lipolytisk hastighed i musemodeller. Primære præadipocytter differentieret in vitro er et nyttigt værktøj til undersøgelse af celleautonome virkninger af genetiske manipulationer eller farmakologiske behandlinger i adipocytter. Fedtvæv indeholder derimod andre celletyper, herunder immunceller. Virkningen af fedtvævsimmunceller til regulering af lipolyse er vigtig at overveje, når man vurderer helvævslipolyse. Dyrkede adipocytlipolysemodeller kan omgå immuncellernes potentielle komplicerende indflydelse og muliggøre en grundig undersøgelse af de specifikke celletyper, mens fedtvævseksplanter muliggør en mere robust sammenligning med in vivo-miljøet . Derudover kan ex vivo-analysen bruges til at undersøge lipolytiske hastigheder i forskellige fedtdepoter. I disse systemer stimuleres lipolyse af forbindelser såsom β-adrenerge receptoragonister, således at eventuelle ændringer i sympatisk tone, der kan påvirke in vivo-musemodellen , ikke vil blive observeret. In vivo måling af lipolyse er kompliceret af dynamikken i FFA og glycerol frigivelse og optagelse i forskellige væv i hele kroppen. Serum-FFA- og glycerolniveauer på et givet tidspunkt er balancen mellem sekretion og optagelse, og det bør ikke antages, at ændringer i serum-FFA- og glycerolniveauer udelukkende kan tilskrives fedtvævslipolyse. Faste-induceret lipolyse påvirkes af sympatisk tone, men producerer ikke hurtige og robuste ændringer i serum FFA eller glycerol niveauer, hvilket gør det vanskeligt at fortolke ændringer i fastende serum niveauer af FFA og glycerol. In vivo lipolyse kan stimuleres ved anvendelse af en β-3 adrenerg receptoragonist, såsom CL-316,243, og øget serum FFA og glycerol kan påvises inden for 20 minutter efter stimulering. In vivo lipolytiske assays bør omfatte både baselinemålinger af serum FFA og glycerol samt en vehikelkontrol; På denne måde kan den stimuleringsspecifikke ændring i serum FFA og glycerol niveauer bestemmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health grant R01DK126944 til S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 193
Måling af lipolysehastigheden i <em>ex vivo</em> murine fedtvæv og primære preadipocytter differentieret <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter