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Biology

생체 외 쥐 지방 조직 및 in vitro에서 분화된 1차 지방전구세포에서 지방분해 속도 측정

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

지방 세포에서 트리글리세라이드 지방 분해는 유리 지방산과 글리세롤의 유리를 초래하는 중요한 대사 과정입니다. 여기에서 우리는 생쥐의 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 기저 및 자극 지방 분해를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

지방 세포는 지질 방울에 트리글리세리드 형태로 에너지를 저장합니다. 이 에너지는 지방산 측쇄가 글리세롤 골격에서 순차적으로 절단되어 유리 지방산과 글리세롤이 방출되는 지방 분해를 통해 동원될 수 있습니다. 백색 지방세포에서 글리세롤 키나아제의 낮은 발현으로 인해, 글리세롤 재흡수율은 무시할 수 있는 반면, 지방산 재흡수율은 알부민과 같은 배지 성분의 지방산 결합 능력에 의해 결정된다. 글리세롤과 배지로의 지방산 방출은 모두 지방 분해 속도를 결정하기 위해 비색 분석으로 정량화할 수 있습니다. 여러 시점에서 이러한 요인을 측정함으로써 높은 신뢰도로 지방 분해의 선형 속도를 결정할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 시험 관 내 분화된 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 지방 분해를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 지방전구세포 세포주 또는 다른 유기체의 지방 조직에 대해 최적화될 수 있습니다. 고려 사항 및 최적화 매개변수에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 마우스 모델과 치료 사이의 지방 세포 지방 분해 속도를 결정하고 비교하는 데 유용하도록 설계되었습니다.

Introduction

과잉 영양소는 지질 방울의 중성 지질 코어에서 트리글리세리드 형태로 백색 지방 조직에 저장됩니다. 트리글리세리드 저장은 지방 분해를 통해 동원되며, 지방 조직 트리글리세리드 리파아제(ATGL), 호르몬 민감성 리파아제(HSL) 및 모노글리세리드 리파아제(MGL)에 의해 지방산 측쇄가 순차적으로 절단되어 유리 지방산(FFA)과 글리세롤 골격 1,2. 지방 분해는 지방 조직에서 카테콜아민 신호 전달에 의해 활성화됩니다. 교감 신경 말단은 지방 세포 원형질막의 β-아드레날린 수용체에 결합하는 카테콜아민을 국소적으로 방출합니다. 리간드 결합 시, 이러한 G-단백질 결합 수용체(GPCR)는 Gαs를 통해 아데닐릴 시클라제를 활성화합니다. cAMP에 의한 단백질 키나아제 A (PKA)의 후속 활성화는 ATGL 및 HSL 모두의 상향 조절을 초래한다. PKA에 의한 페리핀-1의 인산화는 ATGL3에 결합하고 공동 활성화하는 ABHD5(CGI-58이라고도 함)의 해리를 유발합니다. PKA는 HSL을 직접 인산화하여 세포질에서 지질 방울로의 전좌를 촉진하며, 여기서 인산화된 페리핀-1과의 상호작용은 리파아제 활성을 더욱 촉진합니다 4,5,6,7. 지방분해에 관여하는 세 번째 리파아제인 MGL은 카테콜아민 신호전달에 의해 조절되지 않는 것으로 보인다8. 중요하게도, 지방 세포에서의 트리글리세리드 합성은 글리세롤 지질 합성 경로에 의해 매개되며, 이는 중간체로서 모노글리세리드의 형성을 포함하지 않습니다. 대신, 글리세롤-3-포스페이트 아실 트랜스퍼라제는 리소포스파티드산의 형성을 촉매하며, 이는 다른 지방 아실-CoA와 결합하여 포스파티드산을 형성한 다음 트리글리세리드의 최종 합성 전에 디글리세리드로 이성질화됩니다(그림 1)9,10,11.

Figure 1
그림 1: 지방 분해 및 글리세롤 지질 합성 경로. 상단: 지질 경로; 빨간색으로 표시된 효소: 지방 조직 트리글리세리드 리파아제(ATGL), 호르몬 민감성 리파아제(HSL) 및 모노글리세리드 리파아제(MGL). 바닥: 글리세롤 지질 합성 경로; 녹색으로 표시된 효소: 디글리세리드 아실트랜스퍼라제(DGAT), 포스파티드산 포스파타제(PAP), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAT, LPAAT라고도 함) 및 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT). 지질: 트리글리세리드(TG), 디글리세리드(DG), 모노글리세리드(MG), 유리 지방산(FFA), 지방 아실-CoA(FA-CoA), 리소포스파티드산(LPA) 및 포스파티드산(PA). 기타 대사 산물 : 무기 인산염 (Pi) 및 글리세롤 3- 인산염 (G3P). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포외 아데노신은 지방 분해의 또 다른 중요한 조절자이며, Gs- 및 Gi 결합 GPCR을 통해 작용하여 아데닐 시클라제 활성에 영향을 미칩니다. 지방세포에서 우세한 아데노신 수용체인 ADORA1은 아데닐릴 시클라제를 억제하고, 따라서 Gi12의 활성화를 통해 지방 분해를 억제한다. 낮은 수준에서, 주로 갈색 지방세포에서 발현되는 ADORA2A는 Gs 신호전달13을 통해 지방분해를 활성화한다. ADORA1은 기저 지방 분해와 아드레날린 작용제에 대한 반응 모두에 영향을 미칩니다. 지방 분해에 대한 아데노신의 효과는 아데노신을 중화시키기 위해 아데노신 데아미나제와 ADORA1 특이적 작용제인 페닐이소프로필아데노신14,15를 첨가하여 조절할 수 있습니다. Gq-결합 GPCR의 호르몬 활성화는 또한 포스포리파제 C 및 단백질 키나아제 C16,17,18,19의 활성화를 통해 지방 분해에 영향을 미칠 수 있습니다. 염증 신호는 또한 지방 분해 속도에 영향을 미칩니다. LPS(및 기타 내독소)에 의한 TLR4 활성화는 페리핀-1 및 HSL20을 인산화하는 ERK를 활성화하여 지방 분해율을 증가시킵니다. TNF-α는 또한 ERK 및 NF-κB 활성화뿐만 아니라 포스포디에스테라제 PDE-3B 및 CIDEC21,22,23의 전사 하향 조절을 통해 지방 분해를 활성화합니다. IL-6는 또한 특히 장간막 지방 조직에서 증가된 지방세포 지방 분해와 관련이 있으며, 그의 FFA 방출은 간 지방증 및 포도당 생성에 영향을 미친다24,25,26.

지방 분해는 인슐린에 의해 섭식 상태 동안 억제됩니다. AKT는 PDE-3B를 인산화하고 활성화시켜 cAMP 신호전달을 억제하고 PKA 활성화를 방지한다27. 인슐린은 또한 전사적으로 ATGL28을 하향 조절합니다. 비만은 지방 세포에서 β-아드레날린 수용체의 하향 조절을 포함하여 다양한 메커니즘을 통해 카테콜아민 내성을 촉진합니다 29,30,31,32,33. 지방 세포는 세 가지 β-아드레날린 수용체(β-1, β-2 및 β-3)를 모두 발현합니다. β-1 및 β-2 아드레날린 수용체가 유비쿼터스하게 발현되는 반면, β-3 아드레날린 수용체는 마우스34,35의 지방 세포에서 우세하게 발현됩니다. Adrb3 발현은 지방 생성 동안 C/EBPα에 의해 유도됩니다36. β-3 아드레날린 수용체는 성숙한 지방 세포에서 고도로 발현됩니다. β-1 및 β-2 아드레날린 수용체의 활성화는 β-arrestin37에 의한 피드백 억제로 인해 자가 제한적입니다. β-3 아드레날린 수용체의 피드백 억제는 Adrb3 발현을 감소시키는 다른 신호 전달 경로에 의해 매개됩니다33,38,39.

지방 세포 지방 분해를 활성화하기 위해 수많은 화합물을 사용할 수 있습니다. 카테콜아민은 지방 분해의 주요 생리학적 활성제입니다. 노르에피네프린(노르아드레날린)과 에피네프린(또는 아드레날린)은 세 가지 β-아드레날린 수용체를 모두 활성화시킨다40. 노르에피네프린과 에피네프린은 또한 α-아드레날린 수용체 신호 전달의 활성화 를 통해 지방 분해에 영향을 미칩니다41. 통상적으로 사용되는 β-아드레날린 수용체 작용제는 비선택적 β-아드레날린 수용체 작용제인 이소프로테레놀, 및 β-3 아드레날린 수용체 작용제 CL-316,243 및 미라베그론42를 포함한다. 지방 세포가 주로 β-3 아드레날린 수용체를 발현한다는 점을 감안할 때 여기서는 CL-316,243을 예로 사용합니다. β-3 아드레날린 수용체에 대한 특이성은 또한 생체 내에서도 안전하게 사용할 수 있는 지방 세포 카테콜아민 신호 전달의 비교적 특이적인 활성화제입니다. 세포 배양에서 일반적으로 사용되는 10 μM CL-316,243 농도는 최대 반응33을 달성하는 데 필요한 ~0.1 μM 용량보다 훨씬 더 높다는 점에 유의하십시오. 포스콜린은 아드레날린 수용체를 우회하여 아데닐릴 시클라제와 다운스트림 지방 분해 신호를 직접 활성화합니다. 지방 분해의 억제 인자뿐만 아니라 더 많은 활성제가 있습니다. 지방 분해를 자극하는 화합물을 선택할 때 수용체 특이성과 다운스트림 신호 전달 경로를 실험 설계 내에서 신중하게 고려해야 합니다.

백색 지방 조직의 지방 분해 속도는 단식 또는 운동 중 내한성 및 영양소 가용성에 영향을 미치는 중요한 대사 인자입니다43,44,45,46. 이 프로토콜의 목적은 지방 세포 및 지방 조직의 지방 분해 속도를 측정하는 것이며, 이는 지방 세포 대사에 대한 이해와 다양한 쥐 모델의 대사 표현형에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 이해를 용이하게 합니다. 지방 분해 비율을 정량화하기 위해 우리는 배지(즉, FFA 및 글리세롤)에서 지방 분해 제품의 모양을 측정합니다. 이 방법은 지방 세포에서 배지로 지방 분해 생성물의 방출에 의존합니다. 백색 지방세포는 낮은 수준의 글리세롤 키나아제를 발현하기 때문에 글리세롤 재흡수율은 낮다(47). 반대로, 지방 분해 이외의 대사 경로에 의한 FFA 및 글리세롤의 생산도 고려해야 합니다. 지방세포는 글리세롤-3 포스페이트에 대해 활성을 갖는 포스파타제를 발현하는 것으로 보이며, 글루코스48,49,50으로부터 유래된 글리세롤-3-포스페이트로부터 글리세롤의 생산을 가능하게 한다. 해당과정은 백색 지방세포에서 FFA 재에스테르화에 사용되는 글리세롤-3-포스페이트의 공급원입니다. 포도당 수치가 제한되면 글리세로신생성에는 젖산 및 피루브산51과 같은 다른 3-탄소원이 필요합니다. 세포 내 지방 분해에 의해 방출되는 FFA의 채널링과 그 대사 운명은 잘 알려져 있지 않습니다. 지방 분해에 의해 방출된 FFA는 재에스테르화되거나 β산화되기 전에 지방 아실-CoA로 전환되어야 합니다. 지방 분해에 의해 방출된 FFA는 다시 흡수되어 지방 아실-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62로 전환되기 전에 세포를 빠져나갈 가능성이 있는 것으로 보입니다. FFA는 알부민에 의해 세포 외부로 격리될 수 있습니다. 중요하게도, 장쇄 FFA는 알부민 63,64,65,66,67에 의해 격리되지 않는 경우 피드백 억제 지방 분해를 억제하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 지방 분해 분석 동안 배지의 FFA 완충 용량을 최적화하는 것이 중요합니다. 여기에 기술된 절차는 마우스 및 인간 15,68,69,70,71로부터의 지방세포 및 생체외 지방 조직에서의 지방 분해율을 측정하기 위해 이전에 발표된 방법과 유사하다. 이 프로토콜은 직렬 샘플링을 사용하여 다릅니다. 직렬 샘플링을 수행함으로써 지방 분해가 선형 위상으로 측정되고 있음을 내부적으로 검증하고 여러 측정을 활용하여 지방 분해 속도를 계산함으로써 측정 오류를 줄여 최종 계산된 값에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 연속 샘플링의 단점은 분석에 더 많은 시간과 시약이 필요하다는 것입니다. 그러나 기간이 길수록 측정 오차가 비율 추정치의 표준 오차에 미치는 영향이 줄어듭니다. 부가적으로, 이 프로토콜은 FFA 및 글리세롤 방출 둘 다를 측정하고, 완전한 지방분해 및 배지 내로의 지방분해 생성물의 방출로부터 예상될 수 있는 바와 같이, 3:1 비율을 달성하는 것을 목표로 FFA:글리세롤 방출의 비율을 고려한다(72).

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Protocol

모든 동물의 사용은 코넬 대학교 웨일 코넬 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 완충액 및 수집 플레이트의 준비

  1. 페놀 레드가 없는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 100mL에 BSA 5g을 용해시켜 5% 소혈청알부민(BSA)을 만듭니다. BSA를 부드럽게 저어 용해시킵니다(흔들면 비생산적입니다). BSA가 완전히 용해되면 0.2μm 필터로 매체를 필터 멸균합니다. BSA 배지를 4°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다.
  2. 제어 및 자극 매체의 작동 농도를 확인하십시오. 제어 매체: 차량 제어 기능이 있는 5% BSA 매체. 자극 매체: 0.5μM CL-316,243을 사용한 5% BSA 매체. 각 실험에 대해 새로운 자극 매체를 만드십시오.
  3. 사용할 미디어를 37°C로 가온합니다. 배지 수집을 위해 96웰 플레이트에 라벨을 붙입니다.

2. 시료 전처리

  1. 아래에 설명된 대로 세포 배양을 수행합니다. 외부 오염을 최소화하기 위해 멸균 흄 후드에서 모든 셀 작업을 수행합니다.
    1. 73,74에서와 같이 1차 지방전구세포를 분리하고 분화합니다.
      1. 1mL/웰 배양 배지(DMEM/F12의 15% 소 태아 혈청(FBS) 및 1x 페니실린-스트렙토마이신-글루타민)의 24웰 플레이트에서 1 x 105 세포/웰과 같은 고밀도의 1차 지방전구세포 플레이트.
      2. 세포가 100% 밀도에 도달한 후 5μM 덱사메타손, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 1μg/mL 인슐린 및 1μM 티아졸리딘디온(TZD)으로 3일 동안 배양 배지에서 분화합니다. 그런 다음 최소 3일 동안 1μg/mL 인슐린으로 배양 배지로 변경하여 지질 방울을 성장시킵니다. 24웰 플레이트에 1mL/웰의 배지를 사용합니다.
      3. 배양 배지(1ml/웰)를 2-3일마다 인슐린으로 교체합니다. 세포는 최대 2주 동안 인슐린과 함께 배지에서 유지될 수 있습니다. 분화율이 90% 이상이고 이 분석에는 분화율이 감소하면 지방 분해율의 감소로 잘못 해석될 수 있으므로 그룹 간에 유사한 배양물만 사용하십시오.
      4. 지방 분해를 측정하기 전에 인슐린 없는 배지에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
        참고: 배지의 인슐린은 지질 방울을 유지하지만 지방 분해도 억제합니다. 24시간 동안 인슐린 없이 배양하면 지질 액적 부피의 손실 없이 완전한 지방 분해 활성화가 가능합니다. 일부 시스템에서는 인슐린이 없는 배양 시간을 단축하거나 연장해야 할 수 있습니다.
    2. 세포를 DPBS로 한번 세척하여 배양 배지로부터 잔류 혈청을 제거한다.
      참고: 이 프로토콜에는 지방 분해를 활성화할 수 있는 혈청 기아가 포함되지 않습니다. 혈청 기아는 연구자의 재량에 따라 사용될 수 있습니다.
  2. 아래에 설명된 대로 생체 외 배양을 수행합니다.
    1. 각 마우스에서 채취 할 각 조직에 대해 하나의 웰을 갖는 6 웰 플레이트를 준비한다. 사용할 각 웰에 4mL의 실온 DMEM을 넣습니다.
      참고: 수집 매체의 BSA는 필요하지 않습니다.
    2. 지방 분해 분석을 위해 48웰 플레이트를 준비하고, 각 복제물에 대해 하나의 웰을 사용합니다. 사용할 각 웰에 400μL의 실온 DMEM을 넣습니다. 마우스당 조직당 2-4개의 대조군과 2-4개의 자극된 웰을 사용합니다.
    3. 마취 하에 자궁경부 탈구로 마우스를 안락사시키고, 양측 기흉과 같은 2차 방법을 사용합니다. 여기에서는 32g, 7개월 된 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 4개월 동안 45% 고지방 식단을 먹였습니다.
      참고: 이 프로토콜은 남성뿐만 아니라 다른 균주, 식단 및 연령에도 사용할 수 있습니다.
    4. 70% 에탄올을 뿌리고 가위로 복부 피부 중앙에 작은(~1cm) 측면 절개를 하고 엄지와 집게손가락으로 양쪽을 꼬집어 피부를 떼어내고 하복부 피부를 접어 후방 피하 저장소를 드러냅니다. 사타구니 림프절을 찾아 제거하고 겸자를 사용하여 사타구니 림프절 바로 뒤쪽에 있는 사타구니 지방 조직을 무뚝뚝하게 해부합니다.
    5. 생식선 지방 조직을 수집하려면 복막에 측면 및 수직 절개를하여 복강에 접근하십시오. 족집게로 생식선 지방 패드를 잡고 자궁 (또는 남성의 경우 부고환)을 따라 잘라 생식선 지방 조직을 제거합니다. 수집된 저장소를 6웰 플레이트에 넣습니다.
    6. 우물에서 티슈를 꺼내 실리콘 매트 위에 놓고 가위로 5-7mg 덩어리로 자릅니다.
    7. 각 분석 웰에 대해 25-30mg(5개 또는 6개 덩어리)의 무게를 측정하고 48웰 분석 플레이트에 넣습니다. 무게를 측정하기 전에 깨끗한 수건에 티슈를 닦아내어 배지를 제거합니다. 조직을 제거한 후 웨이트 보트의 무게를 측정하고 남은 잔류물의 무게를 기록합니다. 샘플 사이에 웨이트 보트를 깨끗하게 닦고 필요한 경우 다시 용기를 냅니다. 각 조직에 새 웨이트 보트를 사용하십시오.
    8. 일단 모든 조직 샘플의 칭량이 이루어지면, 48-웰 분석 플레이트를 37°C, 10%CO2 인큐베이터에 15분 동안 둔다.

3. 지방 분해 분석

  1. 미디어 수집을 수행합니다. 매체를 이송하고 멸균 흄 후드에서 후속 시료 수집을 수행하여 외부 소스의 잠재적인 오염을 최소화합니다.
    1. t=0에서, 배지를 제거하고, 대조군 또는 자극 배지의 웰 당 400 μL를 추가하고, 플레이트를 37°C, 10%CO2 인큐베이터에 넣어 분석한다. 생체 외 조직 배양의 경우 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 제거합니다. 흡입은 절대 사용해서는 안 됩니다.
      알림: 또는 대조군 및 자극 매체가 있는 두 번째 플레이트를 준비하고 조직을 옮깁니다.
    2. t = 1, 2, 3 및 4h에서 200μL의 배지를 수집하고 200μL의 적절한 대조군 또는 자극 배지로 교체한 후 분석 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 수집 플레이트를 4°C에서 보관하십시오. BSA 미디어의 FFA 버퍼링 용량을 확인하려면 24시간에 추가 수집을 사용합니다.
      참고: 여기에서 실험을 중지할 수 있으며 수집된 배지를 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

4. FFA 비색 분석

  1. 시약을 실온으로 데우고 색 시약 A 1 병을 용매 A 1 병과 용해시키고, 색 시약 B 1 병을 용매 B 1 병과 용해시킨다. 재구성일로부터 이러한 시약은 1주일 이내에 사용하는 것이 가장 좋습니다. 재구성 후 1 개월 후에 폐기하십시오.
  2. 샘플을 해동하고 혼합하십시오.
  3. FFA 표준 곡선을 작성합니다. 표준 용액은 1mM입니다. 표준 곡선의 시약과 함께 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 희석), 10 μL (1:4 희석), 10 μL (1:8 희석) 및 10 μL 물을 사용합니다. 낮은 FFA 수준의 경우 10μL의 1mM, 0.8mM, 0.6mM, 0.4mM, 0.2mM, 0.1mM 및 0.05mM 표준이 더 적합할 수 있습니다.
  4. 표준물질과 샘플을 96웰 분석 플레이트에 피펫팅합니다. 권장 샘플 부피는 10μL입니다. 배경 보정을 위해 샘플과 동일한 부피의 BSA 배지를 가진 3개의 웰을 포함합니다.
    알림: 만약 ample 농도가 표준 곡선의 범위를 벗어나면 분석을 반복하여 s를 조정하십시오.ample 부피를 2-25μL로 조정합니다.
  5. 각 웰에 150μL의 시약 A를 넣고 혼합합니다. 거품을 생성하지 마십시오. 미세한 게이지 바늘로 거품을 터뜨립니다. 분석 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  6. 550 nm 및 660 nm 기준에서 플레이트의 흡광도를 판독합니다(판독값 A).
  7. 75 μL의 시약 B를 각 웰에 첨가하고 혼합한다. 거품을 생성하지 마십시오. 미세한 게이지 바늘로 거품을 터뜨립니다. 분석 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  8. 플레이트의 흡광도를 550 nm 및 660 nm 기준에서 다시 판독한다(판독값 B).

5. 글리세롤 비색 분석

  1. 유리 글리세롤 시약을 초순수 36mL로 재구성하고 실온에 순응시킨다. 이 시약은 몇 주 이내에 사용하는 것이 가장 좋습니다. 재구성 후 2 개월 후에 폐기하십시오.
  2. 샘플을 해동하고 혼합하십시오.
  3. 글리세롤 표준용액을 7점, 2배 연속 희석하고 블랭크를 사용하여 글리세롤 표준물질 곡선을 만듭니다.
    참고: 표준 곡선은 2.8mM 글리세롤의 최대 25μL까지 비교적 선형이지만 더 높은 농도에서는 선형이 아닙니다.
  4. 표준물질과 시료 각각 25 μL를 96-웰 분석 플레이트에 넣었다. 배경 보정을 위해 BSA 미디어에 3개의 웰을 포함합니다.
  5. 175 μL의 유리 글리세롤 시약을 각 웰에 넣고 혼합합니다. 거품을 생성하지 마십시오. 미세한 게이지 바늘로 거품을 터뜨립니다. 분석 플레이트를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
  6. 540nm에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다.

6. 지방 분해 비율의 계산

  1. 광학 밀도(OD) 값으로 시작합니다. 글리세롤의 경우A 540 OD 값을 직접 사용하십시오. 다음 공식에 따라 FFA 분석의 OD를 계산합니다.
    OD = (판독값 B: A 550 - A 660) - (판독값 A: A550 - A660)
  2. 표준 곡선을 사용하여 수집된 샘플의 FFA 및 글리세롤 수준을 계산합니다. y축에 표준 OD 값을 표시하고 x축에 표준 농도를 사용하여 샘플 부피를 사용합니다(즉, 10μL 샘플이 있는 플레이트에 1mM FFA 표준물 20μL이 있는 웰의 농도는 2mM과 같습니다). 선형 추세선 맞추기:
    y = mx + b
  3. 표준 곡선을 육안으로 검사하고 분석의 선형 범위를 벗어난 점을 제거합니다. 다음 방정식을 사용하여 시료 농도를 계산합니다.
    시료 농도 : x = (OD - b) ÷ m
  4. 선형 분석 범위를 벗어나는 샘플을 조정하고 다시 분석합니다. 최종 샘플 농도를 얻으려면 샘플의 농도에서 BSA 미디어만 포함된 백그라운드 웰의 농도를 뺍니다.
  5. 공식에 따라 각 시점에서 각 샘플에 의해 생성된 FFA와 글리세롤의 몰을 계산합니다.
    Equation 1
    여기서 Cn = 시간 t=n에서의 농도; Vt = 우물 내의 총 부피; Vs = 샘플 수집 부피; 및 M n = 시간 t = n에서 생성된 몰(농도가 mM 단위이고 부피가 mL 단위일 때 출력은 μMol임).
    예를 들어, 다양한 시점에서 다음을 수행합니다.
    미디엄 1 =C1 ×Vt
    M4 =C4 ×Pt+(C1 +C2+C3)Vs
    또는
    M4 =C4 ×Pt+C3× Vs +C2× Vs +C1×Vs
  6. 각 샘플의 조직 중량을 그램 단위로 나누어 조직 중량을 정규화하여 μmol/g 단위를 구합니다. 배양된 세포의 경우 값은 μmol/well로 표시됩니다. 세포 수와 분화 효율이 우물에서 우물로 비교할 수 있는지 확인하십시오.
    참고: 증식 또는 분화 효율의 차이는 결과의 해석을 복잡하게 만들고 다른 정규화 방법(예: 단백질로의 정규화, 토론 참조)이 필요합니다.
  7. 각 샘플에 대해 생성된 μmol/g(y축) 대 시간(x축)의 기울기를 개별적으로 계산합니다.
    1. 스프레드시트에서는 =SLOPE(known_ys,known_xs) 함수를 사용하여 이 작업을 수행할 수 있습니다. 새 셀에 "=SLOPE"를 입력합니다(그런 다음 커서를 사용하여 샘플 글리세롤 또는 FFA 값(μmol/g)을 강조 표시한 다음 해당 시간 값을 강조 표시).
    2. 데이터의 선형성을 확인합니다. R2 값은 샘플의 선형성을 결정하는 빠른 방법입니다. 스프레드시트에서 6.7.1단계에서 설명한 것과 동일한 방식으로 =RSQ(known_ys,known_xs) 함수를 사용하여 이 작업을 수행할 수 있지만 초기 입력은 =RSQ입니다. R2 값이 0.98 >인지 확인하십시오. 값이 낮을수록 선형성에서 벗어난 것을 나타냅니다. 이는 측정/샘플링 오류 또는 선형성 손실로 인해 발생할 수 있습니다.
      1. 선형성을 테스트하는 또 다른 방법은 각 표본에 대해 선형 회귀를 수행하고 잔차를 플로팅하는 것입니다. 통계 분석 소프트웨어에서 각 시점에 대해 단일 Y 값을 갖는 XY 테이블을 생성합니다. 분석 > 단순 선형 회귀를 선택하고 확인을 누르기 전에 잔차 그림 상자를 선택합니다. 잔차 그림이 새 그래프로 나타납니다.
  8. 각 샘플에 대한 FFA 및 글리세롤 생성 속도(즉, 기울기[(μmol/g/h])를 개별 데이터 포인트로 사용하여 통계 분석을 수행하고 다른 지방 분해 조건을 비교하는 경우 값을 표시합니다. 유전자형에 걸쳐 지방 분해 비율을 비교하는 경우 동물당 2개 또는 3개의 샘플을 기술 복제로 사용하고 동물당 하나의 데이터 포인트에 대한 평균을 사용하여 샘플 크기가 동물 수와 같도록 합니다.

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Representative Results

우리는 시험관 내 분화된 지방세포의 기저 및 자극 지방 분해 속도를 측정했습니다. 사타구니 백색 지방 조직의 1차 지방전구세포는 4일 동안 5μM 덱사메타손, 0.5mM IBMX, 1μg/mL 인슐린 및 1μM 트로글리타존으로 융합 세포를 처리한 후 1μg/mL 인슐린으로 추가 3일 처리하여 지방세포로 분화되었습니다. 세포는 지방 분해 분석 전에 24시간 동안 인슐린 없이 배지에서 배양되었습니다. 시간 = 0h에서, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 10 μM CL-316,243 또는 비히클 대조군을 함유하는 2% BSA를 갖는 페놀 레드-무함유 DMEM을 12-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 시간 = 1 h, 2 h, 3 h 및 4 h에서, 배지의 50 %를 수집하고, 페놀 레드가 없는 DMEM 중의 2% BSA로 대체하였다. 수집된 배지와 FFA의 몰에서 FFA 및 글리세롤 수치를 측정하고 배지로 분비된 글리세롤을 각 시점에서 계산했습니다(그림 2A, B). FFA 및 글리세롤 생산은 4시간 분석에 대해 선형이었고,R2 값은 0.98 이상이었다. 4시간 FFA 수준은 약간 낮았으며, 이는 지방 분해 비율이 느려졌을 수 있음을 나타냅니다. 그러나 4시간 시점을 사용하거나 사용하지 않는 분석은 계산된 지방 분해 비율에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 자극된 지방 분해 비율은 기저 비율보다 유의하게 높았다(그림 2C). 지방분해 자극은 수집된 모든 샘플에서 거의 3:1 몰비로 FFA와 글리세롤을 생성했으며, 이는 상당한 재흡수 또는 유지 없이 완전한 트리글리세리드 지방분해에서 예상할 수 있습니다(그림 2D). 그러나, 자극되지 않은 세포에서, 비율은 1에 가까웠으며, 이는 글리세롤48,49,50의 비-지방분해성 공급원을 시사한다.

Figure 2
그림 2: 시험관 내 분화된 1차 지방세포에서의 지분해 속도. 지방전구세포는 12-웰 플레이트에서 분화되었다. 인슐린은 지방 분해 분석 24시간 전에 배지로부터 제거되었습니다. 시간 = 0 h에서, 세포를 10 μM CL-316,243 (CL)로 자극하거나 비히클 (V) 대조군 배지로 처리하였다. 각 시점별로 각 웰에서 생성된 (A) FFA 및 (B) 글리세롤의 nmol을 시간 경과에 따라 플롯하고, 선형 회귀선을 각 개별 웰에 적합시켰다. (C) FFA 생산 비율. (D) 글리세롤 생산 속도. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. (E) 각 시점에서 수집된 배지에서 FFA:글리세롤의 몰비. (C)와 (D)의 통계 분석은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었습니다. CL의 효과는 α = 0.05에서 유의하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 배양에서 세포의 단층은 배지와 직접 접촉하는 반면, 생체 외 배양된 조직에서는 중앙의 세포가 배지와 접촉하지 않습니다. 따라서, 생체 외 배양에서, FFA는 조직 내에 보유될 가능성이 더 높다. 표면적 대 부피 비율이 낮은 더 큰 조직 덩어리는 더 높은 FFA 보유율을 나타내므로 FFA:글리세롤 몰 비율이 더 낮습니다(그림 3A). 조직 덩어리 크기가 감소함에 따라 방출된 FFA:글리세롤의 몰비는 3:1에 가까워집니다(그림 3A). 그러나 조직 덩어리가 너무 작을 수도 있습니다. 작은 지방 조직 조각으로 작업하는 어려움 외에도 1-2mg의 지방 조직 덩어리는 감소된 지방 분해 속도를 나타내어 조직의 생존력과 기능이 감소함을 시사합니다(그림 3B, C). 지방 조직을 일정한 크기와 모양의 덩어리로 자르는 것은 지루하고 시간이 많이 걸리지만 비교 가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 것이 필요합니다. 5-10mg의 지방 조직 덩어리를 권장하지만 일관성이 가장 중요합니다. 지방 분해 속도는 여전히 더 큰 조직 덩어리에서 재현 가능하게 측정할 수 있지만, FFA 63,64,65,66,67에 의한 지방 분해의 피드백 억제를 고려하는 것이 중요합니다.

Figure 3
그림 3: 조직 덩어리 크기가 FFA 방출 및 지방 분해 속도에 미치는 영향. 암컷 C57Bl/6J 마우스를 먹인 고지방 식단의 생식선 백색 지방 조직을 수집하여 다양한 크기의 덩어리로 절단했습니다. 모든 웰에는 총 25-30mg의 지방 조직이 포함되어 있습니다. 25mg 웰의 경우 이것은 하나의 조직 덩어리였습니다. 10 mg 웰은 각각 ~ 10 mg의 3 개의 조직 덩어리를 가지며, 5 mg 웰은 5 개 또는 6 개의 조직 덩어리를 함유하고, 2 mg 웰은 13-16 개의 덩어리를 함유한다. 시간 = 0 h에서, 지방 분해를 0.5 μM CL-316,243 (CL)로 자극하거나, 대조군 웰을 비히클 (V)로 처리하였다. 1시간, 2시간 및 3시간 후에 수집된 샘플에서 계산된 지방 분해 비율은 (A) FFA 및 (B) 글리세롤에 대해 표시됩니다. (C) 각 웰에서 FFA : 글리세롤 생산의 몰비. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. (A) 및 (B)에서의 통계분석은 Holm-Sidak post-hoc 분석, α=0.05와 함께 양방향 ANOVA를 사용하여 수행하였다. CL의 효과는 모든 샘플에서 유의하였다. CL 처리된 샘플 내에서 FFA 및 글리세롤 생산 속도는 10mg 대 5mg 샘플을 제외한 모든 쌍별 비교에서 유의하게 달랐습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FFA 유지의 부정적인 영향은 자극 시 FFA와 글리세롤 생성 비율이 더 낮은 25mg 조직 덩어리에서 관찰할 수 있습니다(그림 3B, C). 이러한 피드백 억제는 배지의 FFA 결합 용량이 너무 낮을 때(즉, 배지에 BSA가 충분하지 않을 때) 또한 명백하다. 배지 내 BSA가 0.5%로 감소했을 때, FFA 방출은 4배 이상 감소하였고, 글리세롤 방출은 거의 2배 감소하였다(그림 4A,B). 쉽게 경험상, 배지 내 FFA의 마이크로몰 수준은 배지 내 BSA 비율에 근접해서는 안 됩니다(즉, FFA 수준은 5% BSA 배지에서 5mM FFA 미만, 0.5% BSA 배지에서 0.5mM 미만으로 유지되어야 합니다[이 수준에서는 FFA:BSA의 몰비가 20:3입니다]). BSA 배지 준비의 최대 BSA 완충 용량을 테스트하려면 24시간 자극된 샘플에서 배지를 수집하고 FFA 농도를 측정합니다(농도가 높으므로 더 낮은 샘플 부피 또는 샘플 희석이 권장됨). 24시간 자극 후 5% BSA 배지의 FFA 축적은 약 5mM인 반면, 0.5% BSA 배지의 FFA 함량은 0.6mM에 불과했습니다(그림 4C). 수집된 배지 내의 FFA 농도를 살펴보면, 0.5% BSA 배지 FFA 결합 능력이 과부하되어 있음을 알 수 있다(도 4D). 5% BSA 배지의 FFA 수준은 훨씬 더 높지만 배지의 버퍼링 용량을 초과하지는 않습니다(그림 4D). 이상적으로, 배지 내의 FFA 농도는 3:1 FFA:BSA 몰비(즉, 5%[0.75 mM] BSA에서 2.3 mM FFA) 미만으로 유지되어야 한다.

Figure 4
그림 4: 불충분한 BSA 수치는 겉보기 지방 분해율 감소를 초래합니다. 암컷 C57Bl/6J 마우스를 먹인 고지방 식단의 생식선 백색 지방 조직을 수집하여 ~5mg 덩어리로 자릅니다. 총 20-30 mg의 지방 조직을 각 웰에 넣었다. 시간 = 0 h에서, 지방 분해를 0.5 μM CL-316,243 (CL)로 자극하거나, 대조군 웰을 5% BSA 배지 또는 0.5% BSA만을 함유하는 배지에서 비히클 (V)로 처리하였다. 4시간 후에 수집된 샘플에서 계산된 지방 분해 속도는 (A) FFA 및 (B) 글리세롤에 대해 표시됩니다. CL의 효과는 모든 샘플에서 유의하였다. CL 처리된 샘플 내에서, FFA 및 글리세롤 생산율은 5% 및 0.5% BSA 배지 조건 간에 유의하게 달랐다. (C) 24시간 후 자극된 웰로부터의 배지 중의 FFA 수준. (D) 4시간에서 수집된 샘플의 FFA 수준. (E) DMEM에서 5% BSA의 다양한 제제를 포함하거나 포함하지 않는 FFA 표준 곡선. 광학 밀도는 (판독값 B: A550 - A660) - (판독값 A:A550 -660)으로 계산된다. (F) BSA가 있거나 없는 글리세롤 표준 곡선. 광학 밀도는 540 nm에서 흡수제이다(A540). 5.6mM에서의 OD 값은 선형이 아니므로 표준 곡선에 포함되지 않았습니다. (G) 분석 배지에서 다양한 유형의 BSA를 사용하여 여성 생식선 지방 조직에서 FFA 방출 속도. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. (A) 및 (B)에서의 통계 분석은 Holm-Sidak 사후 분석과 함께 양방향 ANOVA를 사용하였고, *p 값은 0.05<. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BSA의 일부 준비물에는 FFA가 포함되어 있다는 점을 지적하는 것이 중요합니다. BSA의 각 로트는 FFA 함량이 무시할 수 있는지 확인하기 위해 테스트되어야 합니다(일부 BSA 제제는 FFA가 없는 것으로 판매됨). FFA가 없는 것으로 특별히 판매되지는 않지만 여기에 사용된 BSA에는 검출 가능한 FFA가 포함되어 있지 않습니다. FFA가 없는 BSA(Equitech Bio Inc, BAH66), 여기에서 실험에 사용된 BSA(Sigma, A9418), 및 조잡한(덜 저렴한) 분획 V BSA(Sigma, 810531)를 포함하는 분석 배지를 테스트했습니다. FFA가 없는 BSA와 A9418 BSA는 모두 배경 신호를 생성하지 않았거나 표준 곡선 기울기 또는 절편을 변경하지 않았습니다. 표준 곡선은 중첩 가능했습니다(그림 4E). BSA의 DMEM의 영향 역시 글리세롤 표준곡선에서 관찰되지 않았다(도 4F). 반면에, 분획 V BSA는 FFA 분석에서 배경 신호를 생성하였는데, 이는 0.3 mM의 FFA 농도에 해당한다(도 4E). 이 배경은 표준 곡선을 위로 이동시켰지만 기울기에는 큰 영향을 미치지 않았으며, 이는 배경 빼기가 충분하다는 것을 나타냅니다. 우리는 또한 이 세 가지 다른 유형의 BSA를 사용하여 자극된 지방 분해 실험을 수행했으며, 배경 빼기 후 계산된 지방 분해 속도가 BSA 제형 간에 차이가 없음을 발견했습니다(그림 4F). 그러나 이것은 종종 그렇지 않으며, 특히 지방 분해 속도에 영향을 미치는 인슐린 또는 기타 성분을 쉽게 함유할 수 있는 덜 순수한 BSA 제제의 경우에는 더욱 그렇습니다. BSA의 각 로트는 테스트되고 검증되어야 하며 일관되게 사용되어야 합니다(즉, 서로 다른 BSA 로트로 분석된 샘플은 비교할 수 없습니다). BSA의 각 로트를 검증할 때 BSA와 DMEM을 추가한 전체 표준 곡선을 수행하여 비색 분석에서 효소를 방해하는 것이 포함되어 있지 않은지 확인해야 합니다.

일련의 샘플을 채취하고 볼륨을 새 배지로 교체하면 실험 전반에 걸쳐 배지의 FFA 부하를 낮추는 데 도움이 됩니다. 우리는 4개월 동안 고지방 식단을 먹인 암컷 마우스의 생식선 지방 조직에서 지방 분해율을 측정했습니다. 이 실험에서, 5-8 mg 조직 덩어리 (총 중량 25-30 mg)를 200 μL의 5 % BSA 배지에서 배양하고, 100 μL를 수집하여 1 시간, 2 시간, 3 시간 및 4 시간에 교체하였다. 3 시간에, 매체의 FFA 수준은 2.3 mM의 위험 영역에 도달했다 (그림 5A). 지방 분해의 피드백 억제는 4시간에서 배지 FFA 및 글리세롤 수준의 증가 부족으로 제안되었습니다(그림 5A, B). 각 시점에서 방출된 FFA 및 글리세롤의 μmol을 계산하고 선형 곡선을 맞춘 후, 자극된 샘플에서 지방 분해 비율이 4시간에 감소하기 시작하고, R2 값은 FFA의 경우 0.976, 글리세롤의 경우 0.983으로 낮습니다(그림 5C, D). 잔차 그림을 보면 4h 값이 선형 추세 아래에 있음이 분명합니다(즉, 잔차가 음수임)(그림 5E,F). 4시간 시점의 배제는 FFA 및 글리세롤에 대해 각각R2 값을 0.997 및 0.998 이상으로 증가시켰다. 4시간 시점을 포함하면 계산된 FFA 및 글리세롤 방출률이 작지만 크게 감소합니다(그림 5G,H).

Figure 5
그림 5: 생체 외 지방 조직의 선형 지방 분해율 계산. 암컷 C57Bl/6J 마우스를 먹인 고지방 식단의 생식선 백색 지방 조직을 수집하여 ~5mg 덩어리로 자릅니다. 총 20-30 mg의 지방 조직을 각 웰에 넣었다. 시간 = 0 h에서, 지방 분해를 0.5 μM CL-316,243 (CL)로 자극하거나, 대조군 웰을 비히클 (V)로 처리하였다. 미디어 수집은 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간에서 수행되었습니다. (A) 미디어의 FFA 및 (B) 글리세롤 수준. (C) FFA 및 (D) 시간 경과에 따른 글리세롤 생산. 시간 경과에 따른 (E) FFA 및 (F) 글리세롤 생산을 위한 잔류 플레이트. (G) FFA 및 (H) 글리세롤의 방출 속도, 4시간 시점 유무에 관계없이 계산. (I) 여성 생식선 지방 조직에서의 FFA 방출. 미디어의 거의 50%가 1시간, 2시간, 3시간에 변경되었습니다. 몇 시간 사이에 15분 시점은 교체 없이 미디어의 2.75%를 수집했습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. (G) 및 (H)에서의 통계 분석은 Holm-Sidak 사후 분석과 함께 2원 ANOVA를 사용하였고, * p 값은 0.05<. CL의 효과는 모든 샘플에서 유의하였다(p 값 < 0.05). CL 처리된 샘플 내에서, FFA 및 글리세롤 생산의 속도는 4시간 시점을 갖는 계산과 그렇지 않은 계산 사이에서 유의하게 달랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이전 프로토콜과 달리 이 프로토콜은 여러 시점을 활용하여 지방 분해 속도를 결정하므로 측정 오류를 줄이고 선형 지방 분해 비율이 측정되고 있다는 내부 검증을 제공합니다. 각 수집 지점에서 선형 단계에서 지방 분해를 유지하기 위해 배지의 50%가 수집되고 교체됩니다. 선형성이 중요하기 때문에 우리는 새로운 배지의 추가가 각 추가에서 지방 분해의 폭발을 일으키지 않는지 확인하고 싶었습니다. 시점 간의 선형성을 검증하기 위해 교체 없이 1시간에서 3시간까지의 시간별 시점 사이에 15분마다 매우 작은 샘플(2.75%)을 채취했습니다. 1시간, 2시간 및 3시간에서 정상적인 50% 샘플 수집이 이루어지고 교체되었습니다. FFA 방출 속도는 일반적인 시점 사이에서 선형이었고, 이는 새로운 배지를 추가할 때마다 지방 분해의 파열이 없었음을 나타냅니다(그림 5I).

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Discussion

여기에서는 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 지방 분해 속도를 측정하기 위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 지방 분해를 정량화하려면 선형 상에서 지방 분해 속도를 측정하는 것이 중요합니다. 우리는 많은 양의 매체를 수집하여 정기적으로 새로운 매체로 교체하는 직렬 샘플링 기술을 사용합니다. 이 반보존적 방법은 FFA 완충 용량을 가진 신선한 BSA의 추가를 허용하고 피드백 억제를 지연시켜 선형 지방 분해의 지속 기간을 연장합니다. 이 실험 설계는 방출된 FFA에 결합하기 위해 신선한 알부민을 전달하는 생체 내 지방 조직의 혈관화를 요약하려고 시도합니다75. 이 프로토콜은 시험관 내에서 분화된 쥐 생체외 백색 지방 조직 및 사타구니 지방 조직 1차 지방전구세포에서 지방 분해를 측정하도록 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 갈색 및 베이지색 지방 저장소뿐만 아니라 다른 유기체의 지방 조직 및 높은 지방 발생 잠재력을 가진 불멸화된 세포주에서 잘 작동하도록 최적화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 외 분석을 위해 지방 조직을 수집하기 전에 마우스의 연령, 성별 및 식단에 유연성을 허용합니다. 단식과 같은 일부 조작은 기초 지방 분해 비율에 영향을 미칠 수 있는 반면, 식이 유발 비만과 같은 다른 개입도 자극된 지방 분해 속도에 영향을 미칩니다.

프로토콜은 지방 분해 비율이 더 높거나 낮은지 여부에 따라 각 실험 시스템에 맞게 최적화되어야 합니다. 선형성을 검증하려면 R2 값을 계산하고 잔차 그림을 살펴보는 것이 좋습니다. R2 값은 1에 매우 가까워야 합니다. 잔차 플롯을 평가할 때, 이후 시점에서 음의 잔차 값을 주의해야 하는데, 이는 지방 분해 비율이 감소하고 선형성이 손실되고 있음을 나타내기 때문입니다. 이러한 잔차 플롯의 예는 그림 5E, F에 나와 있습니다. 이 경우 4h 시점을 제거하면 선형 지방분해 비율의 보다 정확한 계산이 제공되고R2 값이 개선된다. 그러나, 레이트는 다수의 시점으로부터 계산되기 때문에, 비교적 견고하고, 이러한 시점의 포함은R2 값 및 계산된 지방분해율에 단지 작은 영향을 미친다. 단일 시점을 사용하여 지방 분해 비율을 계산하는 경우 데이터가 더 쉽게 왜곡될 수 있습니다.

데이터가 정규화되는 방식도 샘플 간의 상대적 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 여기서, 생체 외 조직을 웰 당 분화된 조직 중량 및 시험 관 내 일차 지방전구세포로 정상화하는 것이 좋다. 그러나 이러한 정규화 기술은 모든 실험 시스템에 적합하지 않을 수 있습니다. 중요하게도, 증식 속도 또는 분화 효율이 그룹 간에 상이한 경우, 웰 당 정규화는 적절하지 않다. 대체 정규화 기술에는 단백질, 지질 및 DNA가 포함됩니다. 각 정규화 방법에는 장점과 단점이 있습니다. 조직 무게와 잘 정상화는 간단하고 간단합니다. 지방세포 크기의 차이는 희박한 지방 조직이 비만 지방 조직보다 그램당 더 많은 지방세포를 함유하고 있음을 의미할 수 있는 반면, 분화 효율의 차이는 웰당 지방세포 수의 차이를 초래할 수 있습니다. 지질은 유기 용매(예: 2:1 클로로포름:메탄올[v/v])와 비색 시약을 사용하여 측정된 트리글리세리드 함량으로 추출할 수 있습니다. 지질 함량에 대한 정규화는 전통적으로 사용되는 방법이 아니지만, 지질 방울은 결국 지방 분해를 겪는 세포 소기관이며, 이 정규화 방법은 지방 세포에 특이적이므로 세포 간 분화 속도가 다를 때 유용할 수 있습니다. 지질 추출 후, 0.1-0.3 N NaOH는 단백질을 추출하는데 사용될 수 있고, 그 후에 브래드포드 또는 BCA 단백질 분석에 의해 분석될 수 있다68. 대안적으로, 샘플은 용해 완충액에서 균질화될 수 있고, 지질 분획은 원심분리(70)에 의해 제거될 수 있다. 지질 오염은 단백질 분석을 방해합니다. 단백질이 정상화에 사용되는 경우, 세포를 광범위하게(최소 3회) 세척하여 분석 배지에서 BSA를 제거해야 합니다. 때때로, 분화된 지방세포는 플레이트에 잘 부착되지 않고 과잉 BSA를 제거하는 데 필요한 세 번의 세척을 견디지 못합니다. DNA로의 정규화는 세포 번호로의 정상화를 가능하게 하며, 상용 DNA 추출 키트로 수행한 후 유전자 복제 수의 흡광도 또는 실시간 PCR 분석에 의해 총 DNA를 정량화할 수 있습니다. 대안적으로, 도금된 세포에서, DAPI 염색 후 이미징을 사용하여 핵을 계수하고 세포 수로 정규화할 수 있습니다. 세포 수 또는 단백질을 사용하여 정규화할 때 샘플에서 비지방 세포를 고려하는 것이 중요합니다. 지방 조직은 또한 면역 및 내피 세포를 포함합니다. 비만 지방 조직에서 염증과 비대는 성숙한 지방 세포에서 나오는 핵 10 개 중 1 개를 초래할 수 있습니다. 그러나 지방 세포는 여전히 조직의 질량 및 지질 함량의 대부분에 기여합니다. 시험관내 분화된 지방전구세포의 경우, 분화 효율은 성숙한 지방세포의 상대적 비율에 영향을 미친다; 이 경우 정규화가 복잡합니다. 이상적으로는, 지방 분해 분석을 위해 세포를 활용하기 전에 분화 효율을 최적화해야 합니다. 가능하지 않은 경우, 분화된 지방세포 간에 지질 액적 부피가 유사한 경우 지질 함량으로 정규화하는 것이 좋습니다. 불균등한 분화와 함께 지방 세포 배양에 걸친 지방 분해 비율의 비교는 구동 요인이 실제로 지방 생성일 때 지방 분해에 대한 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이는 프로토콜의 제한 사항입니다.

긴 사슬 FFA는 피드백 억제 지방 분해 63,64,65,66,67. FFA는 미디어에서 충분히 격리되지 않을 때 누적됩니다. 지방 분해 측정 최적화와 관련된 문제 해결의 대부분은 FFA 보유를 최소화하는 것과 관련이 있습니다. 배지로의 FFA:글리세롤 방출의 몰 비율을 계산하면 FFA 유지와 관련된 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다. FFA:글리세롤의 몰 비율이 3:1이면 모든 지방 분해 산물이 방출되어 배지에 포획되는 반면 2:1 미만의 비율은 우려의 이유입니다. 생체 외 분석에 대한 중요한 고려 사항은 지방 조직 덩어리의 크기입니다. 더 큰 조직 덩어리는 표면적 대 부피 비율이 낮기 때문에 FFA를 유지하고 결과적으로 감소된 지방 분해율을 나타낼 가능성이 더 큽니다(그림 4A, B). 이를 염두에 두고 각 샘플의 지방 조직을 일관된 크기와 모양의 덩어리로 절단하는 것이 중요합니다. 미디어에서 FFA 격리를 용이하게 하기 위해, 미디어가 방출된 FFA를 바인딩하기에 충분한 BSA를 함유하고 있는지 확인하는 것도 중요하다. 배지의 FFA 완충 용량은 BSA의 농도를 증가시키거나 배지의 부피를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 수집량이나 빈도를 늘리는 것도 똑같이 효과적입니다. 높은 지방 분해 비율이 관찰되지만 FFA:글리세롤 비율이 2:1 미만인 경우 수집 빈도를 30분마다로 늘리고 2.5시간에 분석을 중지하는 것이 좋습니다.

여기에 제공된 프로토콜은 생체 외 백색 지방 조직과 시험관 내에서 분화된 1차 지방전구세포에 최적화되어 있으며, 둘 다 지방 분해성이 높습니다. 분석은 다른 시스템에서 지방 분해를 측정하거나 상대적으로 낮은 지방 분해 기저 비율의 차이가 특히 중요한 경우 최적화되어야 합니다. 예를 들어, 3T3-L1 지방세포는 더 낮은 지방분해 활성을 갖는다32. 지방 분해 속도가 낮을 때, 배양 부피를 감소시켜야 한다(즉, 24-웰 플레이트에서 웰당 400 μL 대신에, 24-웰 플레이트에서 200 μL가 사용되거나, 12-웰 플레이트에서 300 μL가 사용되어야 하며, 100-150 μL가 시점 당 수집되어야 한다). 낮은 FFA 및 글리세롤 수치를 정확하게 측정하기 위해서는 더 많은 시료 부피가 필요하므로 분취 부피가 100μL 미만으로 떨어지지 않아야 합니다. 시료당 50μL의 배지를 사용하여 글리세롤을 분석하려면 유리 글리세롤 시약을 물 31mL에 용해시키고 각 웰의 시료 50μL와 함께 사용하는 시약 150μL를 용해시켜야 합니다. FFA 수준은 선형성이 유지되는 한 웰당 25μL의 샘플로 측정할 수 있으며, 그 이상일 수도 있습니다. 신호를 증가시키기 위해 시점을 확장할 수도 있습니다. 백색 지방세포가 아닌 다른 세포에서 지방분해율을 분석할 때 세포 대사의 차이를 고려해야 합니다. 예를 들어, 갈색 및 베이지색 지방세포는 훨씬 더 높은 수준의 글리세롤 키나아제를 발현하고, 따라서 지방분해에 의해 글리세롤 방출을 유지할 수 있다76,77. 이러한 대사 활성 세포는 또한 방출된 지방산을 배지로 방출하지 않고 이화 또는 합성 경로로 전달할 수 있습니다. 분석되는 특정 세포 유형에서 FFA 및 글리세롤의 대사 운명은 특히 백색 지방 세포 이외의 세포 유형에서 지방 분해 분석의 결과를 해석할 때 고려되어야 합니다. 다른 세포 유형의 지방 분해 분석은 최적화되고 검증되어야 합니다.

이 프로토콜은 마우스 모델에서 지방 분해율의 차이를 평가하도록 설계되었습니다. 시험관 내에서 분화된 1차 지방전구세포는 지방세포에서 유전자 조작 또는 약리학적 치료의 세포 자율적 효과를 조사하는 데 유용한 도구입니다. 반면에 지방 조직에는 면역 세포를 포함한 다른 세포 유형이 포함되어 있습니다. 지방 분해를 조절하는 지방 조직 면역 세포의 영향은 전체 조직 지방 분해를 평가할 때 고려하는 것이 중요합니다. 배양된 지방세포 지방분해 모델은 면역 세포의 잠재적인 복잡한 영향을 우회하고 특정 세포 유형에 대한 철저한 조사를 가능하게 하는 반면, 지방 조직 외식편은 생체 내 환경과 보다 강력한 비교를 가능하게 합니다. 또한, 생체 외 분석은 다양한 지방 저장소에서 지방 분해 속도를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이들 시스템에서, 지방 분해는 β-아드레날린 수용체 작용제와 같은 화합물에 의해 자극되고, 따라서, 생체내 마우스 모델에 영향을 미칠 수 있는 교감신경 톤의 어떠한 변화도 관찰되지 않을 것이다. 지방 분해의 생체 내 측정은 FFA와 글리세롤의 역학 및 신체 전체의 다양한 조직에서의 흡수에 의해 복잡합니다. 주어진 시점에서 혈청 FFA 및 글리세롤 수치는 분비와 흡수의 균형이며, 혈청 FFA 및 글리세롤 수치의 변화가 전적으로 지방 조직 지방 분해에 기인한다고 가정해서는 안 됩니다. 공복 유발 지방 분해는 교감신경 톤의 영향을 받지만 혈청 FFA 또는 글리세롤 수치의 빠르고 강력한 변화를 일으키지 않아 FFA 및 글리세롤의 공복 혈청 수치의 변화를 해석하기 어렵습니다. 생체 내 지방 분해는 CL-316,243과 같은 β-3 아드레날린 수용체 작용제를 사용하여 자극 될 수 있으며, 증가 된 혈청 FFA 및 글리세롤은 자극 후 20 분 이내에 검출 가능합니다. 생체내 지방분해 분석에는 혈청 FFA 및 글리세롤의 기준선 측정과 비히클 대조군이 모두 포함되어야 합니다. 이러한 방식으로 혈청 FFA 및 글리세롤 수치의 자극 특이적 변화를 측정할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 S.M.R.에 R01DK126944를 부여하여 지원했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

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생체 <em>외</em> 쥐 지방 조직 및 <em>in vitro</em>에서 분화된 1차 지방전구세포에서 지방분해 속도 측정
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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

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