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Biology

생체 외 쥐 지방 조직 및 in vitro에서 분화된 1차 지방전구세포에서 지방분해 속도 측정

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65106
,
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine,Weill Cornell Medicine

Summary

지방 세포에서 트리글리세라이드 지방 분해는 유리 지방산과 글리세롤의 유리를 초래하는 중요한 대사 과정입니다. 여기에서 우리는 생쥐의 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 기저 및 자극 지방 분해를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

지방 세포는 지질 방울에 트리글리세리드 형태로 에너지를 저장합니다. 이 에너지는 지방산 측쇄가 글리세롤 골격에서 순차적으로 절단되어 유리 지방산과 글리세롤이 방출되는 지방 분해를 통해 동원될 수 있습니다. 백색 지방세포에서 글리세롤 키나아제의 낮은 발현으로 인해, 글리세롤 재흡수율은 무시할 수 있는 반면, 지방산 재흡수율은 알부민과 같은 배지 성분의 지방산 결합 능력에 의해 결정된다. 글리세롤과 배지로의 지방산 방출은 모두 지방 분해 속도를 결정하기 위해 비색 분석으로 정량화할 수 있습니다. 여러 시점에서 이러한 요인을 측정함으로써 높은 신뢰도로 지방 분해의 선형 속도를 결정할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스의 시험 관 내 분화된 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 지방 분해를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 지방전구세포 세포주 또는 다른 유기체의 지방 조직에 대해 최적화될 수 있습니다. 고려 사항 및 최적화 매개변수에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 마우스 모델과 치료 사이의 지방 세포 지방 분해 속도를 결정하고 비교하는 데 유용하도록 설계되었습니다.

Introduction

과잉 영양소는 지질 방울의 중성 지질 코어에서 트리글리세리드 형태로 백색 지방 조직에 저장됩니다. 트리글리세리드 저장은 지방 분해를 통해 동원되며, 지방 조직 트리글리세리드 리파아제(ATGL), 호르몬 민감성 리파아제(HSL) 및 모노글리세리드 리파아제(MGL)에 의해 지방산 측쇄가 순차적으로 절단되어 유리 지방산(FFA)과 글리세롤 골격 1,2. 지방 분해는 지방 조직에서 카테콜아민 신호 전달에 의해 활성화됩니다. 교감 신경 말단은 지방 세포 원형질막의 β-아드레날린 수용체에 결합하는 카테콜아민을 국소적으로 방출합니다. 리간드 결합 시, 이러한 G-단백질 결합 수용체(GPCR)는 Gαs를 통해 아데닐릴 시클라제를 활성화합니다. cAMP에 의한 단백질 키나아제 A (PKA)의 후속 활성화는 ATGL 및 HSL 모두의 상향 조절을 초래한다. PKA에 의한 페리핀-1의 인산화는 ATGL3에 결합하고 공동 활성화하는 ABHD5(CGI-58이라고도 함)의 해리를 유발합니다. PKA는 HSL을 직접 인산화하여 세포질에서 지질 방울로의 전좌를 촉진하며, 여기서 인산화된 페리핀-1과의 상호작용은 리파아제 활성을 더욱 촉진합니다 4,5,6,7. 지방분해에 관여하는 세 번째 리파아제인 MGL은 카테콜아민 신호전달에 의해 조절되지 않는 것으로 보인다8. 중요하게도, 지방 세포에서의 트리글리세리드 합성은 글리세롤 지질 합성 경로에 의해 매개되며, 이는 중간체로서 모노글리세리드의 형성을 포함하지 않습니다. 대신, 글리세롤-3-포스페이트 아실 트랜스퍼라제는 리소포스파티드산의 형성을 촉매하며, 이는 다른 지방 아실-CoA와 결합하여 포스파티드산을 형성한 다음 트리글리세리드의 최종 합성 전에 디글리세리드로 이성질화됩니다(그림 1)9,10,11.

Figure 1
그림 1: 지방 분해 및 글리세롤 지질 합성 경로. 상단: 지질 경로; 빨간색으로 표시된 효소: 지방 조직 트리글리세리드 리파아제(ATGL), 호르몬 민감성 리파아제(HSL) 및 모노글리세리드 리파아제(MGL). 바닥: 글리세롤 지질 합성 경로; 녹색으로 표시된 효소: 디글리세리드 아실트랜스퍼라제(DGAT), 포스파티드산 포스파타제(PAP), 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제(LPAT, LPAAT라고도 함) 및 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제(GPAT). 지질: 트리글리세리드(TG), 디글리세리드(DG), 모노글리세리드(MG), 유리 지방산(FFA), 지방 아실-CoA(FA-CoA), 리소포스파티드산(LPA) 및 포스파티드산(PA). 기타 대사 산물 : 무기 인산염 (Pi) 및 글리세롤 3- 인산염 (G3P). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포외 아데노신은 지방 분해의 또 다른 중요한 조절자이며, Gs– 및 Gi 결합 GPCR을 통해 작용하여 아데닐 시클라제 활성에 영향을 미칩니다. 지방세포에서 우세한 아데노신 수용체인 ADORA1은 아데닐릴 시클라제를 억제하고, 따라서 Gi12의 활성화를 통해 지방 분해를 억제한다. 낮은 수준에서, 주로 갈색 지방세포에서 발현되는 ADORA2A는 Gs 신호전달13을 통해 지방분해를 활성화한다. ADORA1은 기저 지방 분해와 아드레날린 작용제에 대한 반응 모두에 영향을 미칩니다. 지방 분해에 대한 아데노신의 효과는 아데노신을 중화시키기 위해 아데노신 데아미나제와 ADORA1 특이적 작용제인 페닐이소프로필아데노신14,15를 첨가하여 조절할 수 있습니다. Gq-결합 GPCR의 호르몬 활성화는 또한 포스포리파제 C 및 단백질 키나아제 C16,17,18,19의 활성화를 통해 지방 분해에 영향을 미칠 수 있습니다. 염증 신호는 또한 지방 분해 속도에 영향을 미칩니다. LPS(및 기타 내독소)에 의한 TLR4 활성화는 페리핀-1 및 HSL20을 인산화하는 ERK를 활성화하여 지방 분해율을 증가시킵니다. TNF-α는 또한 ERK 및 NF-κB 활성화뿐만 아니라 포스포디에스테라제 PDE-3B 및 CIDEC21,22,23의 전사 하향 조절을 통해 지방 분해를 활성화합니다. IL-6는 또한 특히 장간막 지방 조직에서 증가된 지방세포 지방 분해와 관련이 있으며, 그의 FFA 방출은 간 지방증 및 포도당 생성에 영향을 미친다24,25,26.

지방 분해는 인슐린에 의해 섭식 상태 동안 억제됩니다. AKT는 PDE-3B를 인산화하고 활성화시켜 cAMP 신호전달을 억제하고 PKA 활성화를 방지한다27. 인슐린은 또한 전사적으로 ATGL28을 하향 조절합니다. 비만은 지방 세포에서 β-아드레날린 수용체의 하향 조절을 포함하여 다양한 메커니즘을 통해 카테콜아민 내성을 촉진합니다 29,30,31,32,33. 지방 세포는 세 가지 β-아드레날린 수용체(β-1, β-2 및 β-3)를 모두 발현합니다. β-1 및 β-2 아드레날린 수용체가 유비쿼터스하게 발현되는 반면, β-3 아드레날린 수용체는 마우스34,35의 지방 세포에서 우세하게 발현됩니다. Adrb3 발현은 지방 생성 동안 C/EBPα에 의해 유도됩니다36. β-3 아드레날린 수용체는 성숙한 지방 세포에서 고도로 발현됩니다. β-1 및 β-2 아드레날린 수용체의 활성화는 β-arrestin37에 의한 피드백 억제로 인해 자가 제한적입니다. β-3 아드레날린 수용체의 피드백 억제는 Adrb3 발현을 감소시키는 다른 신호 전달 경로에 의해 매개됩니다33,38,39.

지방 세포 지방 분해를 활성화하기 위해 수많은 화합물을 사용할 수 있습니다. 카테콜아민은 지방 분해의 주요 생리학적 활성제입니다. 노르에피네프린(노르아드레날린)과 에피네프린(또는 아드레날린)은 세 가지 β-아드레날린 수용체를 모두 활성화시킨다40. 노르에피네프린과 에피네프린은 또한 α-아드레날린 수용체 신호 전달의 활성화 를 통해 지방 분해에 영향을 미칩니다41. 통상적으로 사용되는 β-아드레날린 수용체 작용제는 비선택적 β-아드레날린 수용체 작용제인 이소프로테레놀, 및 β-3 아드레날린 수용체 작용제 CL-316,243 및 미라베그론42를 포함한다. 지방 세포가 주로 β-3 아드레날린 수용체를 발현한다는 점을 감안할 때 여기서는 CL-316,243을 예로 사용합니다. β-3 아드레날린 수용체에 대한 특이성은 또한 생체 내에서도 안전하게 사용할 수 있는 지방 세포 카테콜아민 신호 전달의 비교적 특이적인 활성화제입니다. 세포 배양에서 일반적으로 사용되는 10 μM CL-316,243 농도는 최대 반응33을 달성하는 데 필요한 ~0.1 μM 용량보다 훨씬 더 높다는 점에 유의하십시오. 포스콜린은 아드레날린 수용체를 우회하여 아데닐릴 시클라제와 다운스트림 지방 분해 신호를 직접 활성화합니다. 지방 분해의 억제 인자뿐만 아니라 더 많은 활성제가 있습니다. 지방 분해를 자극하는 화합물을 선택할 때 수용체 특이성과 다운스트림 신호 전달 경로를 실험 설계 내에서 신중하게 고려해야 합니다.

백색 지방 조직의 지방 분해 속도는 단식 또는 운동 중 내한성 및 영양소 가용성에 영향을 미치는 중요한 대사 인자입니다43,44,45,46. 이 프로토콜의 목적은 지방 세포 및 지방 조직의 지방 분해 속도를 측정하는 것이며, 이는 지방 세포 대사에 대한 이해와 다양한 쥐 모델의 대사 표현형에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 이해를 용이하게 합니다. 지방 분해 비율을 정량화하기 위해 우리는 배지(즉, FFA 및 글리세롤)에서 지방 분해 제품의 모양을 측정합니다. 이 방법은 지방 세포에서 배지로 지방 분해 생성물의 방출에 의존합니다. 백색 지방세포는 낮은 수준의 글리세롤 키나아제를 발현하기 때문에 글리세롤 재흡수율은 낮다(47). 반대로, 지방 분해 이외의 대사 경로에 의한 FFA 및 글리세롤의 생산도 고려해야 합니다. 지방세포는 글리세롤-3 포스페이트에 대해 활성을 갖는 포스파타제를 발현하는 것으로 보이며, 글루코스48,49,50으로부터 유래된 글리세롤-3-포스페이트로부터 글리세롤의 생산을 가능하게 한다. 해당과정은 백색 지방세포에서 FFA 재에스테르화에 사용되는 글리세롤-3-포스페이트의 공급원입니다. 포도당 수치가 제한되면 글리세로신생성에는 젖산 및 피루브산51과 같은 다른 3-탄소원이 필요합니다. 세포 내 지방 분해에 의해 방출되는 FFA의 채널링과 그 대사 운명은 잘 알려져 있지 않습니다. 지방 분해에 의해 방출된 FFA는 재에스테르화되거나 β산화되기 전에 지방 아실-CoA로 전환되어야 합니다. 지방 분해에 의해 방출된 FFA는 다시 흡수되어 지방 아실-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62로 전환되기 전에 세포를 빠져나갈 가능성이 있는 것으로 보입니다. FFA는 알부민에 의해 세포 외부로 격리될 수 있습니다. 중요하게도, 장쇄 FFA는 알부민 63,64,65,66,67에 의해 격리되지 않는 경우 피드백 억제 지방 분해를 억제하는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 지방 분해 분석 동안 배지의 FFA 완충 용량을 최적화하는 것이 중요합니다. 여기에 기술된 절차는 마우스 및 인간 15,68,69,70,71로부터의 지방세포 및 생체외 지방 조직에서의 지방 분해율을 측정하기 위해 이전에 발표된 방법과 유사하다. 이 프로토콜은 직렬 샘플링을 사용하여 다릅니다. 직렬 샘플링을 수행함으로써 지방 분해가 선형 위상으로 측정되고 있음을 내부적으로 검증하고 여러 측정을 활용하여 지방 분해 속도를 계산함으로써 측정 오류를 줄여 최종 계산된 값에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 연속 샘플링의 단점은 분석에 더 많은 시간과 시약이 필요하다는 것입니다. 그러나 기간이 길수록 측정 오차가 비율 추정치의 표준 오차에 미치는 영향이 줄어듭니다. 부가적으로, 이 프로토콜은 FFA 및 글리세롤 방출 둘 다를 측정하고, 완전한 지방분해 및 배지 내로의 지방분해 생성물의 방출로부터 예상될 수 있는 바와 같이, 3:1 비율을 달성하는 것을 목표로 FFA:글리세롤 방출의 비율을 고려한다(72).

Protocol

모든 동물의 사용은 코넬 대학교 웨일 코넬 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 완충액 및 수집 플레이트의 준비 페놀 레드가 없는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 100mL에 BSA 5g을 용해시켜 5% 소혈청알부민(BSA)을 만듭니다. BSA를 부드럽게 저어 용해시킵니다(흔들면 비생산적입니다). BSA가 완전히 용해되면 0.2μm 필터로…

Representative Results

우리는 시험관 내 분화된 지방세포의 기저 및 자극 지방 분해 속도를 측정했습니다. 사타구니 백색 지방 조직의 1차 지방전구세포는 4일 동안 5μM 덱사메타손, 0.5mM IBMX, 1μg/mL 인슐린 및 1μM 트로글리타존으로 융합 세포를 처리한 후 1μg/mL 인슐린으로 추가 3일 처리하여 지방세포로 분화되었습니다. 세포는 지방 분해 분석 전에 24시간 동안 인슐린 없이 배지에서 배양되었습니다. 시간 = 0h에서…

Discussion

여기에서는 지방 세포 및 생체 외 지방 조직에서 지방 분해 속도를 측정하기 위한 기본 프로토콜을 제공합니다. 지방 분해를 정량화하려면 선형 상에서 지방 분해 속도를 측정하는 것이 중요합니다. 우리는 많은 양의 매체를 수집하여 정기적으로 새로운 매체로 교체하는 직렬 샘플링 기술을 사용합니다. 이 반보존적 방법은 FFA 완충 용량을 가진 신선한 BSA의 추가를 허용하고 피드백 억제를…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 S.M.R.에 R01DK126944를 부여하여 지원했습니다.

Materials

24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work
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References

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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).
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