Измерение скорости липолиза в мышиной жировой ткани ex vivo и первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro

Summary

Триглицеридный липолиз в адипоцитах является важным метаболическим процессом, приводящим к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Здесь мы приводим подробный протокол измерения базального и стимулированного липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей.

Abstract

Адипоциты хранят энергию в виде триглицеридов в липидных каплях. Эта энергия может быть мобилизована посредством липолиза, где боковые цепи жирных кислот последовательно отщепляются от основной цепи глицерина, что приводит к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Из-за низкой экспрессии глицеринкиназы в белых адипоцитах скорость обратного захвата глицерина незначительна, в то время как обратный захват жирных кислот продиктован способностью связывания жирных кислот компонентов среды, таких как альбумин. Высвобождение глицерина и жирных кислот в среду может быть количественно определено с помощью колориметрических анализов для определения скорости липолитики. Измеряя эти факторы в несколько временных точек, можно с высокой достоверностью определить линейную скорость липолиза. Здесь мы приводим подробный протокол измерения липолиза в дифференцированных адипоцитах in vitro и жировой ткани ex vivo у мышей. Этот протокол также может быть оптимизирован для других клеточных линий преадипоцитов или жировой ткани других организмов; Обсуждаются соображения и параметры оптимизации. Этот протокол предназначен для определения и сравнения скорости липолиза адипоцитов между мышиными моделями и методами лечения.

Introduction

Избыток питательных веществ хранится в белой жировой ткани в виде триглицеридов в нейтральном липидном ядре липидных капель. Запасы триглицеридов мобилизуются посредством липолиза, процесса, при котором боковые цепи жирных кислот последовательно расщепляются триглицеридлипазой жировой ткани (ATGL), гормоночувствительной липазой (HSL) и моноглицеридлипазой (MGL), что приводит к высвобождению свободных жирных кислот (FFA) и глицериновой цепи ^1,2. Липолиз активируется передачей сигналов катехоламинов в жировой ткани. Симпатические нервные окончания локально высвобождают катехоламины, которые связываются с β-адренорецепторами на плазматической мембране адипоцитов. При связывании лиганда эти рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), активируют аденилатциклазу через G_αs. Последующая активация протеинкиназы А (PKA) цАМФ приводит к усилению регуляции как ATGL, так и HSL. Фосфорилирование перилипина-1 PKA вызывает диссоциацию ABHD5 (также известного как CGI-58), который связывает и коактивирует ATGL³. PKA непосредственно фосфорилирует HSL, способствуя его транслокации из цитозоля в липидную каплю, где взаимодействие с фосфорилированным перилипином-1 дополнительно способствует его липазной активности 4,5,6,7. Третья липаза, участвующая в липолизе, MGL, по-видимому, не регулируется передачей сигналов катехоламинов⁸. Важно отметить, что синтез триглицеридов в адипоцитах опосредован путем синтеза липидов глицерина, который не включает образование моноглицеридов в качестве промежуточного продукта; вместо этого глицерин-3-фосфатацилтрансферазы катализируют образование лизофосфатидной кислоты, которая соединяется с другим жирным ацил-КоА с образованием фосфатидной кислоты, а затем изомеризуется до диглицеридов до окончательного синтеза триглицеридов (рис. 1)9,10,11.

Рисунок 1: Пути синтеза липидов липолиза и глицерина. Вверху: Липолитический путь; ферменты, показанные красным цветом: триглицеридлипаза жировой ткани (ATGL), гормоночувствительная липаза (HSL) и моноглицеридлипаза (MGL). Внизу: путь синтеза липидов глицерина; ферменты, показанные зеленым цветом: диглицеридацилтрансфераза (DGAT), фосфатидная кислая фосфатаза (PAP), лизофосфатидная кислота ацилтрансфераза (LPAT, также известная как LPAAT) и глицерин-3-фосфат-ацилтрансфераза (GPAT). Липиды: триглицериды (ТГ), диглицериды (ДГ), моноглицериды (МГ), свободные жирные кислоты (СЖК), жирные ацил-КоА (ФА-КоА), лизофосфатидная кислота (ЛПА) и фосфатидная кислота (ПА). Другие метаболиты: неорганический фосфат (Pi) и глицерин-3-фосфат (G3P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Внеклеточный аденозин является еще одним важным регулятором липолиза, работая_{через Gs}– и G-i-связанные GPCR, чтобы влиять на активность аденилциклазы. Преобладающий аденозиновый рецептор в адипоцитах, ADORA1, ингибирует аденилатциклазу и, таким образом, липолиз посредством активации G_i¹². Экспрессируемый на более низких уровнях и в основном в коричневых адипоцитах, ADORA2A активирует липолиз через передачу^{сигналов G s 13}. ADORA1 влияет как на базальный липолиз, так и на реакцию на адренергические агонисты. Влияние аденозина на липолиз можно контролировать, добавляя аденозиндезаминазу для нейтрализации аденозина, а также ADORA1-специфический агонист фенилизопропиладенозин^14,15. Гормональная активация G_{q-связанных} GPCR также может влиять на липолиз через активацию фосфолипазы С и протеинкиназы С^16,17,18,19. Воспалительные сигналы также влияют на липолитические показатели. Активация TLR4 ЛПС (и другими эндотоксинами) увеличивает липолитическую скорость за счет активации ERK, который фосфорилирует перилипин-1 и HSL²⁰. TNF-α также активирует липолиз посредством активации ERK и NF-κB, а также транскрипционного подавления фосфодиэстеразы PDE-3B и CIDEC^21,22,23. IL-6 также был связан с повышенным липолизом адипоцитов, особенно в брыжеечной жировой ткани, высвобождение FFA которой влияет на стеатоз печени и глюконеогенез^24,25,26.

Липолиз подавляется во время вскормленного состояния инсулином. AKT фосфорилирует и активирует PDE-3B для подавления передачи сигналов цАМФ и предотвращения активации PKA²⁷. Инсулин также транскрипционно подавляет ATGL²⁸. Ожирение способствует резистентности к катехоламинам с помощью различных механизмов, включая подавление β-адренорецепторов в адипоцитах 29,30,31,32,33. Адипоциты экспрессируют все три β-адренорецептора (β-1, β-2 и β-3). В то время как адренорецепторы β-1 и β-2 экспрессируются повсеместно, адренорецептор β-3 преимущественно экспрессируется в адипоцитах у мышей^34,35. Экспрессия Adrb3 индуцируется C/EBPα во время адипогенеза³⁶. Адренорецептор β-3 высоко экспрессируется в зрелых адипоцитах. Активация адренорецепторов β-1 и β-2 является самоограничивающейся из-за ингибирования обратной связи β-аррестином³⁷. Ингибирование с обратной связью адренергического рецептора β-3 опосредовано другими сигнальными путями, которые снижают экспрессию Adrb3 ^33,38,39.

Многочисленные соединения могут быть использованы для активации липолиза адипоцитов. Катехоламины являются основными физиологическими активаторами липолиза. Норадреналин (или норадреналин) и адреналин (или адреналин) активируют все три β-адренорецептора⁴⁰. Норадреналин и адреналин также влияют на липолиз посредством активации передачи^{сигналов 41} α-адренергического рецептора. Обычно используемые агонисты β-адренорецепторов включают изопротеренол, который является неселективным агонистом β-адренорецепторов, и агонисты адренорецепторов β-3 CL-316,243 и мирабегрон⁴². Учитывая, что адипоциты преимущественно экспрессируют адренергический рецептор β-3, мы используем CL-316,243 в качестве примера. Его специфичность для адренорецептора β-3 также делает его относительно специфическим активатором передачи сигналов катехоламинов адипоцитов, который также можно безопасно использовать in vivo. Обратите внимание, что обычно используемая концентрация 10 мкМ CL-316,243 в культуре клеток на порядки выше, чем доза ~0,1 мкМ, необходимая для достижения максимального ответа³³. Форсколин обходит адренергический рецептор, непосредственно активируя аденилатциклазу и последующую липолитическую сигнализацию. Существует еще много активаторов, а также супрессоров липолиза. При выборе соединения для стимуляции липолиза в рамках экспериментального дизайна следует тщательно учитывать специфичность рецептора и последующие сигнальные пути.

Скорость липолиза в белой жировой ткани является важным метаболическим фактором, влияющим на переносимость холода и доступность питательных веществ во время голодания или физических упражнений^43,44,45,46. Целью этого протокола является измерение скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани, что облегчит понимание метаболизма адипоцитов и того, как он может влиять на метаболический фенотип различных мышиных моделей. Чтобы количественно оценить скорость липолитики, мы измеряем появление липолитических продуктов в средах (т.е. СЖК и глицерина). Метод основан на высвобождении липолитических продуктов из адипоцита в среду. Поскольку белые адипоциты экспрессируют низкие уровни глицеринкиназы, показатели обратного захвата глицерина низкие⁴⁷. И наоборот, следует также учитывать выработку СЖК и глицерина метаболическими путями, отличными от липолиза. Адипоциты, по-видимому, экспрессируют фосфатазу с активностью против фосфата глицерина-3, что позволяет производить глицерин из глицерин-3-фосфата, полученного из глюкозы^48,49,50. Гликолиз является источником глицерин-3-фосфата, используемого для повторной этерификации FFA в белых адипоцитах. Когда уровни глюкозы ограничены, глиценеогенез требует других 3-углеродных источников, таких как лактат и пируват⁵¹. Канализация FFA, высвобождаемых липолизом внутри клетки, и их метаболическая судьба плохо изучены; FFA, высвобождаемые липолизом, должны быть преобразованы в жирный ацил-КоА, прежде чем подвергаться повторной этерифицированности или β-окислению. Похоже, что СЖК, высвобождаемые липолизом, скорее всего, выходят из клетки, прежде чем возвращаться обратно и превращаться в жирный ацил-КоА 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . СЖК могут быть изолированы вне клетки альбумином. Важно отметить, что длинноцепочечные FFA, как известно, ингибируют липолиз с обратной связью, если они не секвестрированы альбумином 63,64,65,66,67. Таким образом, оптимизация буферной емкости среды FFA во время анализа липолиза имеет решающее значение. Описанная здесь процедура аналогична ранее опубликованным методам измерения скорости липолитиков в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей и людей 15,68,69,70,71. Этот протокол отличается использованием последовательной выборки; Выполняя последовательный отбор проб, мы можем внутренне подтвердить, что липолиз измеряется в линейной фазе, и использовать несколько измерений для расчета скорости липолиза, тем самым уменьшая погрешность измерения и повышая достоверность конечного расчетного значения. Недостатком серийного отбора проб является то, что анализ требует больше времени и реагентов; Однако более длительный срок снижает влияние погрешности измерения на стандартную погрешность оценок ставки. Кроме того, в этом протоколе измеряется высвобождение как СЖК, так и глицерина и рассматривается соотношение высвобождения СЖК и глицерина с целью достижения соотношения 3:1, как и следовало ожидать от полного липолиза и высвобождения липолитических продуктов в среду⁷².

Protocol

Использование всех животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Вейля Корнелла Корнельского университета. 1. Подготовка буферов и сборных пластин Сделайте 5% бычий сывороточный ал?…

Representative Results

Мы измерили базальную и стимулированную липолитическую скорость дифференцированных адипоцитов in vitro. Первичные преадипоциты из паховой белой жировой ткани дифференцировали в адипоциты путем обработки сливающихся клеток 5 мкМ дексаметазоном, 0,5 мМ IBMX, 1 мкг/мл инсулина и 1 мкМ трог?…

Discussion

Здесь мы приводим базовый протокол для измерения скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo . Для количественной оценки липолиза важно измерить скорость липолитики в линейной фазе. Мы используем метод серийного отбора проб, при котором большая часть среды собирается и за?…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work