Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение скорости липолиза в мышиной жировой ткани ex vivo и первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Триглицеридный липолиз в адипоцитах является важным метаболическим процессом, приводящим к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Здесь мы приводим подробный протокол измерения базального и стимулированного липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей.

Abstract

Адипоциты хранят энергию в виде триглицеридов в липидных каплях. Эта энергия может быть мобилизована посредством липолиза, где боковые цепи жирных кислот последовательно отщепляются от основной цепи глицерина, что приводит к высвобождению свободных жирных кислот и глицерина. Из-за низкой экспрессии глицеринкиназы в белых адипоцитах скорость обратного захвата глицерина незначительна, в то время как обратный захват жирных кислот продиктован способностью связывания жирных кислот компонентов среды, таких как альбумин. Высвобождение глицерина и жирных кислот в среду может быть количественно определено с помощью колориметрических анализов для определения скорости липолитики. Измеряя эти факторы в несколько временных точек, можно с высокой достоверностью определить линейную скорость липолиза. Здесь мы приводим подробный протокол измерения липолиза в дифференцированных адипоцитах in vitro и жировой ткани ex vivo у мышей. Этот протокол также может быть оптимизирован для других клеточных линий преадипоцитов или жировой ткани других организмов; Обсуждаются соображения и параметры оптимизации. Этот протокол предназначен для определения и сравнения скорости липолиза адипоцитов между мышиными моделями и методами лечения.

Introduction

Избыток питательных веществ хранится в белой жировой ткани в виде триглицеридов в нейтральном липидном ядре липидных капель. Запасы триглицеридов мобилизуются посредством липолиза, процесса, при котором боковые цепи жирных кислот последовательно расщепляются триглицеридлипазой жировой ткани (ATGL), гормоночувствительной липазой (HSL) и моноглицеридлипазой (MGL), что приводит к высвобождению свободных жирных кислот (FFA) и глицериновой цепи 1,2. Липолиз активируется передачей сигналов катехоламинов в жировой ткани. Симпатические нервные окончания локально высвобождают катехоламины, которые связываются с β-адренорецепторами на плазматической мембране адипоцитов. При связывании лиганда эти рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), активируют аденилатциклазу через Gαs. Последующая активация протеинкиназы А (PKA) цАМФ приводит к усилению регуляции как ATGL, так и HSL. Фосфорилирование перилипина-1 PKA вызывает диссоциацию ABHD5 (также известного как CGI-58), который связывает и коактивирует ATGL3. PKA непосредственно фосфорилирует HSL, способствуя его транслокации из цитозоля в липидную каплю, где взаимодействие с фосфорилированным перилипином-1 дополнительно способствует его липазной активности 4,5,6,7. Третья липаза, участвующая в липолизе, MGL, по-видимому, не регулируется передачей сигналов катехоламинов8. Важно отметить, что синтез триглицеридов в адипоцитах опосредован путем синтеза липидов глицерина, который не включает образование моноглицеридов в качестве промежуточного продукта; вместо этого глицерин-3-фосфатацилтрансферазы катализируют образование лизофосфатидной кислоты, которая соединяется с другим жирным ацил-КоА с образованием фосфатидной кислоты, а затем изомеризуется до диглицеридов до окончательного синтеза триглицеридов (рис. 1)9,10,11.

Figure 1
Рисунок 1: Пути синтеза липидов липолиза и глицерина. Вверху: Липолитический путь; ферменты, показанные красным цветом: триглицеридлипаза жировой ткани (ATGL), гормоночувствительная липаза (HSL) и моноглицеридлипаза (MGL). Внизу: путь синтеза липидов глицерина; ферменты, показанные зеленым цветом: диглицеридацилтрансфераза (DGAT), фосфатидная кислая фосфатаза (PAP), лизофосфатидная кислота ацилтрансфераза (LPAT, также известная как LPAAT) и глицерин-3-фосфат-ацилтрансфераза (GPAT). Липиды: триглицериды (ТГ), диглицериды (ДГ), моноглицериды (МГ), свободные жирные кислоты (СЖК), жирные ацил-КоА (ФА-КоА), лизофосфатидная кислота (ЛПА) и фосфатидная кислота (ПА). Другие метаболиты: неорганический фосфат (Pi) и глицерин-3-фосфат (G3P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Внеклеточный аденозин является еще одним важным регулятором липолиза, работаячерез Gs- и G-i-связанные GPCR, чтобы влиять на активность аденилциклазы. Преобладающий аденозиновый рецептор в адипоцитах, ADORA1, ингибирует аденилатциклазу и, таким образом, липолиз посредством активации Gi12. Экспрессируемый на более низких уровнях и в основном в коричневых адипоцитах, ADORA2A активирует липолиз через передачусигналов G s 13. ADORA1 влияет как на базальный липолиз, так и на реакцию на адренергические агонисты. Влияние аденозина на липолиз можно контролировать, добавляя аденозиндезаминазу для нейтрализации аденозина, а также ADORA1-специфический агонист фенилизопропиладенозин14,15. Гормональная активация Gq-связанных GPCR также может влиять на липолиз через активацию фосфолипазы С и протеинкиназы С16,17,18,19. Воспалительные сигналы также влияют на липолитические показатели. Активация TLR4 ЛПС (и другими эндотоксинами) увеличивает липолитическую скорость за счет активации ERK, который фосфорилирует перилипин-1 и HSL20. TNF-α также активирует липолиз посредством активации ERK и NF-κB, а также транскрипционного подавления фосфодиэстеразы PDE-3B и CIDEC21,22,23. IL-6 также был связан с повышенным липолизом адипоцитов, особенно в брыжеечной жировой ткани, высвобождение FFA которой влияет на стеатоз печени и глюконеогенез24,25,26.

Липолиз подавляется во время вскормленного состояния инсулином. AKT фосфорилирует и активирует PDE-3B для подавления передачи сигналов цАМФ и предотвращения активации PKA27. Инсулин также транскрипционно подавляет ATGL28. Ожирение способствует резистентности к катехоламинам с помощью различных механизмов, включая подавление β-адренорецепторов в адипоцитах 29,30,31,32,33. Адипоциты экспрессируют все три β-адренорецептора (β-1, β-2 и β-3). В то время как адренорецепторы β-1 и β-2 экспрессируются повсеместно, адренорецептор β-3 преимущественно экспрессируется в адипоцитах у мышей34,35. Экспрессия Adrb3 индуцируется C/EBPα во время адипогенеза36. Адренорецептор β-3 высоко экспрессируется в зрелых адипоцитах. Активация адренорецепторов β-1 и β-2 является самоограничивающейся из-за ингибирования обратной связи β-аррестином37. Ингибирование с обратной связью адренергического рецептора β-3 опосредовано другими сигнальными путями, которые снижают экспрессию Adrb3 33,38,39.

Многочисленные соединения могут быть использованы для активации липолиза адипоцитов. Катехоламины являются основными физиологическими активаторами липолиза. Норадреналин (или норадреналин) и адреналин (или адреналин) активируют все три β-адренорецептора40. Норадреналин и адреналин также влияют на липолиз посредством активации передачисигналов 41 α-адренергического рецептора. Обычно используемые агонисты β-адренорецепторов включают изопротеренол, который является неселективным агонистом β-адренорецепторов, и агонисты адренорецепторов β-3 CL-316,243 и мирабегрон42. Учитывая, что адипоциты преимущественно экспрессируют адренергический рецептор β-3, мы используем CL-316,243 в качестве примера. Его специфичность для адренорецептора β-3 также делает его относительно специфическим активатором передачи сигналов катехоламинов адипоцитов, который также можно безопасно использовать in vivo. Обратите внимание, что обычно используемая концентрация 10 мкМ CL-316,243 в культуре клеток на порядки выше, чем доза ~0,1 мкМ, необходимая для достижения максимального ответа33. Форсколин обходит адренергический рецептор, непосредственно активируя аденилатциклазу и последующую липолитическую сигнализацию. Существует еще много активаторов, а также супрессоров липолиза. При выборе соединения для стимуляции липолиза в рамках экспериментального дизайна следует тщательно учитывать специфичность рецептора и последующие сигнальные пути.

Скорость липолиза в белой жировой ткани является важным метаболическим фактором, влияющим на переносимость холода и доступность питательных веществ во время голодания или физических упражнений43,44,45,46. Целью этого протокола является измерение скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани, что облегчит понимание метаболизма адипоцитов и того, как он может влиять на метаболический фенотип различных мышиных моделей. Чтобы количественно оценить скорость липолитики, мы измеряем появление липолитических продуктов в средах (т.е. СЖК и глицерина). Метод основан на высвобождении липолитических продуктов из адипоцита в среду. Поскольку белые адипоциты экспрессируют низкие уровни глицеринкиназы, показатели обратного захвата глицерина низкие47. И наоборот, следует также учитывать выработку СЖК и глицерина метаболическими путями, отличными от липолиза. Адипоциты, по-видимому, экспрессируют фосфатазу с активностью против фосфата глицерина-3, что позволяет производить глицерин из глицерин-3-фосфата, полученного из глюкозы48,49,50. Гликолиз является источником глицерин-3-фосфата, используемого для повторной этерификации FFA в белых адипоцитах. Когда уровни глюкозы ограничены, глиценеогенез требует других 3-углеродных источников, таких как лактат и пируват51. Канализация FFA, высвобождаемых липолизом внутри клетки, и их метаболическая судьба плохо изучены; FFA, высвобождаемые липолизом, должны быть преобразованы в жирный ацил-КоА, прежде чем подвергаться повторной этерифицированности или β-окислению. Похоже, что СЖК, высвобождаемые липолизом, скорее всего, выходят из клетки, прежде чем возвращаться обратно и превращаться в жирный ацил-КоА 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . СЖК могут быть изолированы вне клетки альбумином. Важно отметить, что длинноцепочечные FFA, как известно, ингибируют липолиз с обратной связью, если они не секвестрированы альбумином 63,64,65,66,67. Таким образом, оптимизация буферной емкости среды FFA во время анализа липолиза имеет решающее значение. Описанная здесь процедура аналогична ранее опубликованным методам измерения скорости липолитиков в адипоцитах и жировой ткани ex vivo у мышей и людей 15,68,69,70,71. Этот протокол отличается использованием последовательной выборки; Выполняя последовательный отбор проб, мы можем внутренне подтвердить, что липолиз измеряется в линейной фазе, и использовать несколько измерений для расчета скорости липолиза, тем самым уменьшая погрешность измерения и повышая достоверность конечного расчетного значения. Недостатком серийного отбора проб является то, что анализ требует больше времени и реагентов; Однако более длительный срок снижает влияние погрешности измерения на стандартную погрешность оценок ставки. Кроме того, в этом протоколе измеряется высвобождение как СЖК, так и глицерина и рассматривается соотношение высвобождения СЖК и глицерина с целью достижения соотношения 3:1, как и следовало ожидать от полного липолиза и высвобождения липолитических продуктов в среду72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование всех животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинском колледже Вейля Корнелла Корнельского университета.

1. Подготовка буферов и сборных пластин

  1. Сделайте 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), растворив 5 г BSA в 100 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) без фенольного красного. Аккуратно перемешайте BSA до растворения (встряхивание контрпродуктивно). Как только BSA полностью растворится, фильтруйте фильтр и стерилизуйте фильтр с помощью фильтра 0,2 мкм. Храните носитель BSA при температуре 4 °C до 1 месяца.
  2. Сделайте рабочие концентрации контрольных и стимулирующих сред. Управляющая среда: 5% среды BSA с управлением транспортным средством. Среда стимуляции: 5% среды BSA с 0,5 мкМ CL-316,243. Для каждого эксперимента приготовьте свежие среды для стимуляции.
  3. Нагрейте используемый носитель до 37 °C. Наклейте этикетку на 96-луночную пластину для сбора носителей.

2. Пробоподготовка

  1. Выполните культивирование клеток, как описано ниже. Выполняйте все работы с ячейками в стерильном вытяжном шкафу, чтобы свести к минимуму внешнее загрязнение.
    1. Выделяют и дифференцируют первичные преадипоциты, как в73,74.
      1. Пластинчатые первичные преадипоциты с высокой плотностью, такие как 1 x 105 клеток / лунка в 24-луночном планшете в 1 мл / лунка культуральная среда (15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1x пенициллин-стрептомицин-глутамин в DMEM / F12).
      2. После того, как клетки достигнут 100% слияния, дифференцируют с 5 мкМ дексаметазоном, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантином, 1 мкг/мл инсулина и 1 мкМ тиазолидиндионом (TZD) в питательных средах в течение 3 дней. Затем перейдите на питательную среду с инсулином 1 мкг / мл в течение не менее 3 дней, чтобы вырастить липидные капли. Используйте 1 мл/лунку среды в 24-луночной пластине.
      3. Меняйте питательные среды (1 мл/лунка) инсулином каждые 2 или 3 дня. Клетки могут поддерживаться в среде с инсулином до 2 недель. Для этого анализа используйте только культуры, в которых показатели дифференцировки превышают 90% и одинаковы в разных группах, так как снижение дифференцировки может быть неверно истолковано как снижение скорости липолитики.
      4. Культивируют клетки в безинсулиновых средах в течение 24 ч перед измерением липолиза.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин в среде поддерживает липидные капли, но также ингибирует липолиз. Инкубация без инсулина в течение 24 ч позволяет провести полную липолитическую активацию без потери объема липидных капель. В некоторых системах может потребоваться сокращение или продление времени культивирования без инсулина.
    2. Промойте клетки DPBS один раз, чтобы удалить остатки сыворотки из питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не включает сывороточное голодание, которое может активировать липолиз. Сывороточное голодание может быть использовано по усмотрению исследователя.
  2. Выполните культуру ex vivo, как описано ниже.
    1. Подготовьте 6-луночную тарелку с одной лункой для каждой ткани, которая будет собрана у каждой мыши. Поместите 4 мл DMEM комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BSA в средствах сбора не требуется.
    2. Подготовьте 48-луночную пластину для анализа липолиза, по одной лунке для каждой реплики. Поместите 400 мкл ДМЭМ комнатной температуры в каждую лунку, которая будет использоваться. Используйте две-четыре контрольных и две-четыре стимулированных лунки на ткань на мышь.
    3. Усыпить мышь вывихом шейки матки под наркозом, вторичным методом, таким как двусторонний пневмоторакс. Здесь мы использовали 32-граммовую 7-месячную самку мыши C57BL / 6J, которую кормили 45% диетой с высоким содержанием жиров в течение 4 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также может быть использован для мужчин, а также для других штаммов, диет и возрастов.
    4. Сбрызните 70% этанолом и с помощью ножниц сделайте небольшой (~ 1 см) боковой разрез в центре кожи живота, раздвиньте кожу, ущипнув обе стороны большим и указательным пальцами, и сложите нижнюю часть живота, чтобы обнажить задние подкожные депо. Найдите и удалите паховый лимфатический узел и затупите паховую жировую ткань непосредственно позади пахового лимфатического узла с помощью щипцов.
    5. Чтобы собрать гонадную жировую ткань, сделайте боковой и вертикальный разрез в брюшине, чтобы получить доступ к брюшной полости. Держите жировую подушку гонад пинцетом и разрежьте вдоль матки (или придатка яичка для мужчин), чтобы удалить жировую ткань гонады. Поместите собранные склады в 6-луночную тарелку.
    6. Снимите салфетку с лунки, положите на силиконовый коврик и нарежьте ножницами на кусочки по 5-7 мг.
    7. Взвесьте от 25 до 30 мг (пять или шесть кусков) для каждой пробирной лунки и поместите в пробирную пластину на 48 лунок. Промокните салфетку на чистом полотенце перед взвешиванием, чтобы удалить все носители. Взвесьте весовую лодку после удаления ткани и запишите вес любых оставшихся остатков. Протрите весовую лодку между образцами и при необходимости снова тарируйте. Используйте новую весовую лодку для каждой ткани.
    8. После того, как все образцы тканей будут взвешены, поместите 48-луночную тестовую пластину в инкубатор с 37 °C, 10% CO2 на 15 минут.

3. Анализ на липолиз

  1. Выполните сбор мультимедиа. Проведите перенос среды и последующий отбор проб в стерильный вытяжной шкаф, чтобы свести к минимуму потенциальное загрязнение из внешних источников.
    1. При t = 0 удалите среду и добавьте 400 мкл на лунку контрольной или стимулирующей среды, а затем поместите планшет для анализа в инкубатор с 37 °C и 10% CO2 . Для культивирования тканей ex vivo осторожно удалите среду с помощью пипетки; Ни в коем случае нельзя использовать всасывание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы подготовьте вторую пластину со средой для контроля и стимуляции и перенесите ткани.
    2. При t = 1, 2, 3 и 4 ч соберите 200 мкл среды, замените ее 200 мкл соответствующей контрольной или стимулирующей среды и верните пробирную пластину в инкубатор. Храните сборную пластину при температуре 4 °C. Чтобы определить буферную емкость среды BSA FFA, используйте дополнительный сбор через 24 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом эксперименты можно остановить, а собранные носители можно хранить при -20 °C.

4. Колориметрический анализ FFA

  1. Нагрейте реагенты до комнатной температуры и растворите один флакон цветного реагента А с одним флаконом растворителя А, а один флакон с цветным реагентом В с одним флаконом растворителя В. С момента восстановления эти реагенты лучше всего использовать в течение 1 недели. Выбросить через 1 месяц после восстановления.
  2. Разморозьте и перемешайте образцы.
  3. Создайте стандартную кривую FFA. Стандартный раствор составляет 1 мМ. Используйте следующий объем с реагентами для стандартной кривой: 25 мкл, 20 мкл, 15 мкл, 10 мкл, 10 мкл (разведение 1:2), 10 мкл (разбавление 1:4), 10 мкл (разбавление 1:8) и 10 мкл воды для максимального диапазона. Для низких уровней FFA могут быть более применимыми 10 мкл стандарта 1 мМ, 0,8 мМ, 0,6 мМ, 0,4 мМ, 0,2 мМ, 0,1 мМ и 0,05 мМ.
  4. Стандарты пипетки и образцы в 96-луночную пробирную пластину. Рекомендуемый объем образца составляет 10 мкл. Включите три лунки с тем же объемом среды BSA, что и образцы для коррекции фона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрации в пробе выходят за пределы диапазона стандартной кривой, повторите анализ, отрегулировав объем образца до 2-25 мкл.
  5. Добавьте по 150 мкл реагента А в каждую лунку и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
  6. Считайте коэффициент поглощения пластины при 550 нм и 660 нм эталона (чтение A).
  7. Добавьте 75 мкл реагента B в каждую лунку и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
  8. Еще раз считайте коэффициент поглощения пластины при 550 нм и 660 нм (чтение B).

5. Колориметрический анализ глицерина

  1. Восстановите свободный глицериновый реагент 36 мл сверхчистой воды и акклиматизируйте до комнатной температуры. Эти реагенты лучше всего использовать в течение нескольких недель. Выбросить через 2 месяца после восстановления.
  2. Разморозьте и перемешайте образцы.
  3. Создайте стандартную кривую глицерина, сделав семиточечное, 2-кратное последовательное разведение стандартного раствора глицерина и пустую воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая является относительно линейной до 25 мкл глицерина 2,8 мМ, но не линейной при более высоких концентрациях.
  4. Пипетка по 25 мкл каждого стандарта и образцов в 96-луночную пробирную пластину. Включите три лунки со средой BSA для коррекции фона.
  5. Добавьте в каждую лунку по 175 мкл свободного глицеринового реагента и перемешайте. Избегайте образования пузырей. Лопните любые пузырьки тонкой иглой. Инкубируйте пробирную пластину при 37 °C в течение 5 минут.
  6. Считайте поглощение пластины на длине волны 540 нм.

6. Расчет липолитического курса

  1. Начните со значений оптической плотности (OD). Для глицерина используйте значения ODA 540 напрямую. Рассчитайте OD анализа FFA по следующей формуле:
    OD = (Чтение B: A 550 - A 660) - (Чтение A: A550 - A660)
  2. Используйте стандартную кривую для расчета уровней СЖК и глицерина в собранных образцах. Нанесите стандартные значения OD на ось y, а на ось x используйте стандартные концентрации относительно объема образца (т. е. концентрация лунок с 20 мкл стандарта FFA 1 мМ на пластине с образцами 10 мкл равна 2 мМ). Подгонка линейной линии тренда:
    y = mx + b
  3. Визуально осмотрите стандартную кривую и удалите все точки за пределами линейного диапазона анализа. Рассчитайте концентрацию пробы, используя уравнение:
    Концентрация образца: x = (OD - b) ÷ м
  4. Корректируйте и повторно анализируйте образцы, выходящие за пределы линейного диапазона анализа. Чтобы получить окончательную концентрацию пробы, вычтите из концентрации проб концентрацию фоновых скважин, содержащих только среду BSA.
  5. Рассчитайте моли FFA и глицерина, продуцируемые каждым образцом в каждый момент времени, по формуле:
    Equation 1
    где C n = концентрация в момент времени t = n; Vt = общий объем в скважине; Vs = объем отбора проб; и M n = моли, образующиеся в момент времени t = n (когда концентрации указаны в мМ, а объемы - в мл, на выходе получается мкмоль).
    Например, в разные моменты времени:
    M 1 = C1 × Vt
    М 4 = С4 × В t + (С1 + С 2+ С3)В с
    или
    М 4 = С4 × Вт + С3 × Вс + С2 × В с + С1 ×В с
  6. Нормализуйте массу ткани путем деления на массу ткани для каждого образца в граммах, чтобы получить единицы мкмоль/г. Для культивируемых клеток значения представлены в мкмоль/лунка. Убедитесь, что количество клеток и эффективность дифференцировки сопоставимы от скважины к скважине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различия в эффективности пролиферации или дифференцировки усложнят интерпретацию результатов и потребуют другого метода нормализации (например, нормализации до белка; см. обсуждение).
  7. Рассчитайте наклон полученного мкмоль/г (ось y) в зависимости от времени (ось x) для каждого образца в отдельности.
    1. В электронной таблице это можно сделать с помощью функции =SLOPE(known_ys,known_xs). В новой ячейке введите «=НАКЛОН» (затем с помощью курсора выделите образцы значений глицерина или FFA в мкмоль/г, а затем выделите соответствующие значения времени).
    2. Проверьте линейность данных. Значения R2 являются быстрым способом определения линейности образцов. В электронной таблице это можно сделать с помощью функции =RSQ(known_ys,known_xs) так же, как описано в шаге 6.7.1, но начальные входные данные =RSQ. Убедитесь, что значения R2 > 0,98; Меньшие значения указывают на отклонение от линейности. Это может быть результатом ошибки измерения/выборки или потери линейности.
      1. Другой способ проверить линейность — выполнить линейную регрессию для каждого образца и построить график остатков. В программном обеспечении для статистического анализа создайте таблицу XY с одним значением Y для каждого момента времени. Выберите «Анализ» > «Простая линейная регрессия» и установите флажок « Остаточный график », прежде чем нажать кнопку «ОК». Остаточный график появится в виде нового графика.
  8. Используйте скорость производства FFA и глицерина (т. е. наклон [(мкмоль/г/ч]) для каждого образца в качестве отдельной точки данных для выполнения статистического анализа и построения графика значений, если сравниваются различные липолитические условия. Если липолитические показатели сравниваются между генотипами, используйте два или три образца на животное в качестве технических реплик и используйте среднее значение для одной точки данных на животное, чтобы размер выборки был равен количеству животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы измерили базальную и стимулированную липолитическую скорость дифференцированных адипоцитов in vitro. Первичные преадипоциты из паховой белой жировой ткани дифференцировали в адипоциты путем обработки сливающихся клеток 5 мкМ дексаметазоном, 0,5 мМ IBMX, 1 мкг/мл инсулина и 1 мкМ троглитазоном в течение 4 дней с последующим дополнительным 3-дневным лечением инсулином 1 мкг/мл. Клетки инкубировали в средах без инсулина в течение 24 ч до анализа липолиза. В момент времени = 0 ч, клетки промывали один раз PBS, затем в каждую лунку 12-луночной пластины добавляли ДМЭМ без фенола с 2% BSA, содержащий либо 10 мкМ CL-316,243, либо контрольный носитель. За время = 1 ч, 2 ч, 3 ч и 4 ч 50% среды было собрано и заменено 2% БСА в ДМЭМ, не содержащем фенола. Уровни СЖК и глицерина измеряли в собранных средах и молях СЖК, а глицерин, секретируемый в среду, рассчитывали в каждый момент времени (рис. 2А, Б). Производство СЖК и глицерина было линейным для 4-часового анализа со значениями R2 0,98 и выше. 4-часовые уровни FFA были несколько низкими, что указывает на то, что липолитические показатели, возможно, замедлялись; Однако анализ с 4-часовым временным моментом и без него не оказал существенного влияния на расчетную липолитическую скорость. Стимулированные липолитические показатели были значительно выше, чем базальные (рис. 2C). Липолитическая стимуляция привела к образованию СЖК и глицерина в молярном соотношении почти 3:1 во всех собранных образцах, как и следовало ожидать от полного триглицеридного липолиза без значительного обратного захвата или удержания (рис. 2D). Однако в нестимулированных клетках соотношение было ближе к 1, что указывает на нелиполитический источник глицерина48,49,50.

Figure 2
Рисунок 2: Липолитическая скорость в дифференцированных первичных адипоцитах in vitro . Преадипоциты дифференцировали в 12-луночной пластине. Инсулин был удален из среды за 24 ч до липолитического анализа. При времени = 0 ч клетки стимулировали 10 мкМ CL-316,243 (CL) или обрабатывали контрольной средой носителя (V). Нмоль (A) FFA и (B) глицерина, добытого в каждой скважине к каждому моменту времени, была построена с течением времени, и для каждой отдельной скважины была установлена линия линейной регрессии. c) Темпы производства СФА. d) Темпы производства глицерина. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. (E) Молярное соотношение FFA:глицерин в собранных средах в каждый момент времени. Статистический анализ в (C) и (D) проводился с использованием t-критерия Стьюдента; эффект CL был значимым при α = 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В клеточной культуре монослой клеток находится в непосредственном контакте со средой, в то время как в тканях, культивируемых ex vivo, клетки в центре не контактируют со средой. Таким образом, в культурах ex vivo FFA, скорее всего, будут сохраняться в ткани. Более крупные куски ткани, которые имеют более низкое отношение площади поверхности к объему, демонстрируют более высокие показатели удержания FFA, что приводит к более низким молярным соотношениям FFA: глицерина (рис. 3A). С уменьшением размера куска ткани молярное соотношение высвобождаемого FFA: глицерина приближается к 3:1 (рис. 3A). Однако куски ткани также могут быть слишком маленькими. В дополнение к проблеме работы с крошечными кусочками жировой ткани, куски жировой ткани в дозе 1-2 мг демонстрируют пониженные липолитические показатели, что свидетельствует о снижении жизнеспособности и функциональности ткани (рис. 3B, C). Несмотря на то, что разрезание жировой ткани на куски одинакового размера и формы утомительно и трудоемко, для получения сопоставимых и надежных результатов требуется получение сопоставимых и надежных результатов. Мы рекомендуем от 5 до 10 мг кусочков жировой ткани, но наиболее важна консистенция. Липолитические показатели все еще могут быть воспроизводимо измерены в более крупных кусках ткани, однако важно учитывать ингибирование липолиза с обратной связью FFA 63,64,65,66,67.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние размера куска ткани на высвобождение СЖК и скорость липолитики. Белая жировая ткань гонады из мышей с высоким содержанием жиров, которых кормили самкой мыши C57Bl / 6J, была собрана и разрезана на куски разного размера. Во всех лунках содержалось всего 25-30 мг жировой ткани; Для лунок 25 мг это был один кусок ткани; Лунки 10 мг содержали три куска ткани каждый по ~ 10 мг, лунки 5 мг содержали пять или шесть кусков ткани, а лунки 2 мг содержали 13-16 кусков. В момент = 0 ч липолиз стимулировали 0,5 мкМ CL-316,243 (CL) или обрабатывали контрольные лунки носителем (V). Рассчитанная липолитическая скорость из проб, собранных через 1 ч, 2 ч и 3 ч, построена для (A) FFAs и (B) глицерина. (C) Молярное соотношение добычи FFA:глицерина в каждой скважине. Данные представлены в виде средних ± SEM. Статистический анализ в (A) и (B) проводился с использованием двустороннего ANOVA с последующим анализом Холма-Сидака, α = 0,05. Эффект КЛ был значимым во всех образцах. В образцах, обработанных CL, скорость производства FFA и глицерина значительно различалась во всех парных сравнениях, за исключением образцов 10 мг и 5 мг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Негативное влияние удержания СЖК можно наблюдать в тканевых кусочках по 25 мг, которые демонстрируют более низкие показатели выработки как СЖК, так и глицерина при стимуляции (рис. 3B, C). Это ингибирование обратной связи также очевидно, когда связывающая способность среды к FFA слишком мала (т.е. в среде недостаточно BSA). Когда БСА в среде снижали до 0,5%, высвобождение СЖК снижалось более чем в четыре раза, а высвобождение глицерина снижалось почти в два раза (рис. 4А, Б). Как простое эмпирическое правило, микромолярные уровни СЖК в средах не должны приближаться к процентному содержанию БСА в средах (т.е. уровни СЖК должны оставаться ниже 5 мМ СЖК в 5% БСА и 0,5 мМ в 0,5% БСА [на этом уровне молярное соотношение СЖК:БСА составляет 20:3]). Чтобы проверить максимальную буферную емкость BSA при приготовлении среды BSA, соберите среду из 24-часовой стимулированной пробы и измерьте концентрацию FFA (концентрация будет высокой, поэтому рекомендуется меньший объем образца или разбавление образца). Накопление FFA в 5% среде BSA после 24-часовой стимуляции составляло около 5 мМ, в то время как содержание FFA в 0,5% среде BSA составляло всего 0,6 мМ (рис. 4C). Глядя на концентрацию FFA в собранных средах, можно увидеть, что 0,5% связывающая способность FFA среды BSA перегружена (рис. 4D). В то время как уровни FFA в 5% среде BSA намного выше, они не превышают буферную емкость среды (рис. 4D). В идеале концентрация СЖК в средах должна оставаться ниже молярного соотношения 3:1 FFA:BSA (т.е. 2,3 мМ FFA в 5% [0,75 мМ] BSA).

Figure 4
Рисунок 4: Недостаточные уровни BSA приводят к снижению кажущихся липолитических показателей. Белая жировая ткань гонады из самок мышей C57Bl / 6J с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой, была собрана и разрезана на кусочки ~ 5 мг. В каждую лунку помещали в общей сложности 20-30 мг жировой ткани. В момент времени = 0 ч липолиз стимулировали 0,5 мкМ CL-316,243 (CL), или контрольные лунки обрабатывали носителем (V) либо в 5% среде BSA, либо в средах, содержащих только 0,5% BSA. Рассчитанная липолитическая скорость из проб, собранных через 4 часа, построена для (A) FFAs и (B) глицерина. Эффект КЛ был значимым во всех образцах. В образцах, обработанных CL, скорость производства как FFA, так и глицерина значительно различалась между средами с 5% и 0,5% BSA. С) Уровни СЖК в средах из стимулированных скважин через 24 ч. (D) Уровни СЖК в пробах, отобранных через 4 ч. (Е) Стандартные кривые СЖК с различными препаратами 5% БСА в ДМЭМ и без них. Оптическая плотность рассчитывается как (Показания B: A 550 - A 660) - (Показания A: A550 - A 660). (F) Стандартная кривая глицерина с BSA и без нее. Оптическая плотность абсорбента при длине волны 540 нм (A540). Значения OD при 5,6 мМ не были линейными и, следовательно, не включались в стандартную кривую. (G) Скорость высвобождения СЖК из женской гонадной жировой ткани с использованием различных типов БСА в анализируемых средах. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ в (A) и (B) был выполнен с использованием двустороннего ANOVA с анализом Холма-Сидака post hoc, * значение p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Важно отметить, что некоторые препараты BSA содержат FFA. Каждая партия БСА должна быть протестирована, чтобы убедиться, что содержание СЖК незначительно (обратите внимание, что некоторые препараты БСА продаются как не содержащие СЖК). Несмотря на то, что BSA, используемый здесь, не продается как свободный от FFA, он не содержит обнаруживаемых FFA. Мы протестировали анализные среды, содержащие BSA, не содержащий FFA-(Equitech Bio Inc, BAH66), BSA, используемый в экспериментах здесь (Sigma, A9418), и более грубую (менее дорогую) фракцию V BSA (Sigma, 810531). BSA без FFA и BSA A9418 не производили фонового сигнала, не изменяли стандартный наклон кривой или не пересеклись; стандартные кривые накладывались друг на друга (рис. 4E). Никакого влияния BSA DMEM на стандартную кривую глицерина также не наблюдалось (рис. 4F). С другой стороны, фракция V BSA действительно производила фоновый сигнал в анализе FFA, который приравнивался к концентрации FFA 0,3 мМ (рис. 4E). Этот фон смещал стандартную кривую вверх, но не оказывал существенного влияния на наклон, что указывает на то, что вычитания фона достаточно. Мы также провели эксперимент по стимулированному липолизу с использованием этих трех различных типов BSA и обнаружили, что после фонового вычитания рассчитанная скорость липолиза не различалась между составами BSA (рис. 4F). Однако это часто не так, особенно с менее чистыми препаратами BSA, которые могут легко содержать инсулин или другие компоненты, влияющие на скорость липолиза. Каждая партия BSA должна быть протестирована и валидирована, а также использоваться последовательно (т.е. образцы, проанализированные с различными партиями BSA, несопоставимы). Полная стандартная кривая с добавлением BSA и DMEM должна быть выполнена при валидации каждой партии BSA, чтобы убедиться, что она не содержит ничего, что мешает ферментам в колориметрических анализах.

Взятие серийных образцов и замена объема свежими носителями помогает снизить нагрузку FFA в среде на протяжении всего эксперимента. Мы измерили липолитические показатели в жировой ткани гонад у самки мыши, получавшей диету с высоким содержанием жиров в течение 4 месяцев. В этом эксперименте кусочки ткани по 5-8 мг (общий вес 25-30 мг) инкубировали в 200 мкл 5% среды BSA, а 100 мкл собирали и заменяли через 1, 2 часа, 3 часа и 4 часа. Измеряли уровни FFA и глицерина в собранных средах. Через 3 часа уровни СЖК в среде достигли опасной зоны 2,3 мМ (рис. 5А). Ингибирование липолиза с обратной связью было обусловлено отсутствием повышения уровня СЖК и глицерина в средах через 4 ч (рис. 5А, Б). После расчета мкмоль СЖК и глицерина, высвобождаемых в каждый момент времени, и подгонки линейной кривой становится очевидным, что липолитическая скорость начинает снижаться через 4 ч в стимулированных образцах, при этом значения R2 составляют всего 0,976 для СЖК и 0,983 для глицерина (рис. 5C, D). Глядя на остаточный график, становится ясно, что значения 4 h находятся ниже линейного тренда (т. е. остатки отрицательны) (рис. 5E, F). Исключение 4-часовой временной точки увеличило значения R2 до 0,997 и 0,998 и выше для FFA и глицерина, соответственно. Включение 4-часовой временной точки вызывает небольшое, но значительное снижение расчетной скорости высвобождения FFA и глицерина (рис. 5G, H).

Figure 5
Рисунок 5: Расчет линейной липолитической скорости в жировой ткани ex vivo . Белая жировая ткань гонады из самок мышей C57Bl / 6J с высоким содержанием жиров, которых кормили диетой, была собрана и разрезана на кусочки ~ 5 мг. В каждую лунку помещали в общей сложности 20-30 мг жировой ткани. В момент времени = 0 ч липолиз стимулировали 0,5 мкМ CL-316,243 (CL) или обрабатывали контрольные лунки носителем (V). Сборы средств массовой информации проводились через 1 ч, 2 ч, 3 ч и 4 ч. (А) уровни СЖК и (В) глицерина в средствах массовой информации. (C) FFA и (D) производство глицерина с течением времени. Остаточные пластины для производства (E) FFA и (F) глицерина с течением времени. Скорость высвобождения (G) FFA и (H) глицерина, рассчитанная с 4-часовым временным моментом и без него. (I) Высвобождение СЖК в женской гонадной жировой ткани. Почти 50% носителей менялись через 1 ч, 2 ч и 3 ч. Между часами 15-минутные временные точки собрали 2,75% медиа без замены. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ в (G) и (H) был выполнен с использованием двусторонней ANOVA с последующим анализом Холма-Сидака, * значение p < 0,05. Эффект CL был значимым во всех образцах (значение p < 0,05). В образцах, обработанных CL, скорость производства как СЖК, так и глицерина значительно различалась между расчетами с 4-часовым временным моментом и без него. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В отличие от предыдущих протоколов, этот протокол использует несколько временных точек для определения скорости липолитики, тем самым уменьшая погрешность измерения и обеспечивая внутреннюю проверку того, что измеряется линейная скорость липолиза. Для поддержания липолиза в линейной фазе в каждом пункте сбора собирается и заменяется 50% среды. Поскольку линейность имеет решающее значение, мы хотели убедиться, что добавление свежих сред не вызывало всплеска липолиза при каждом добавлении. Чтобы проверить линейность между временными точками, мы брали очень маленькую выборку (2,75%) каждые 15 минут между часовыми временными точками от 1 ч до 3 ч, без замены. Через 1 ч, 2 ч и 3 ч был произведен и заменен нормальный 50% отбор проб. Скорость высвобождения СЖК была линейной между обычными временными точками, что указывает на то, что при каждом добавлении свежих сред не было всплеска липолиза (рис. 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы приводим базовый протокол для измерения скорости липолиза в адипоцитах и жировой ткани ex vivo . Для количественной оценки липолиза важно измерить скорость липолитики в линейной фазе. Мы используем метод серийного отбора проб, при котором большая часть среды собирается и заменяется свежей средой через равные промежутки времени. Этот полуконсервативный метод позволяет добавлять свежий BSA с буферной способностью FFA и задерживает ингибирование обратной связи, увеличивая продолжительность линейного липолиза. В этом экспериментальном дизайне предпринята попытка повторить васкуляризацию жировой ткани in vivo, которая доставляет свежий альбумин для связывания высвобожденных FFAs75. Этот протокол был оптимизирован для измерения липолиза в мышиной белой жировой ткани ex vivo и паховой жировой ткани, первичных преадипоцитах, дифференцированных in vitro. Протокол, вероятно, может быть оптимизирован для работы с коричневыми и бежевыми жировыми депо, а также с жировой тканью других организмов и иммортализированными клеточными линиями с высоким адипогенным потенциалом. Протокол допускает гибкость в отношении возраста, пола и диеты мышей до сбора жировой ткани для анализов ex vivo . Некоторые манипуляции, такие как голодание, могут влиять на базальную липолитическую скорость, в то время как другие вмешательства, такие как ожирение, вызванное диетой, также влияют на скорость стимулированного липолиза.

Протокол должен быть оптимизирован для каждой экспериментальной системы, в зависимости от того, выше или ниже липолитические показатели. Чтобы проверить линейность, мы рекомендуем вычислить значения R2 и посмотреть на график остатков. Значения R2 должны быть очень близки к 1. При оценке остаточного графика следует обращать внимание на отрицательные остаточные значения в более поздние моменты времени, поскольку они указывают на то, что липолитические показатели снижаются, а линейность теряется. Примеры таких остаточных участков показаны на рисунке 5E,F. Исключение 4-часовых временных точек в этом случае обеспечивает более точный расчет линейной липолитической скорости и улучшает значения R2. Однако, поскольку скорость рассчитывается из нескольких временных точек, она относительно надежна, и включение такой временной точки оказывает лишь небольшое влияние на значения R2 и расчетную скорость липолиза. Если для расчета липолитической скорости используется один момент времени, данные могут быть легко искажены.

Способ нормализации данных также может повлиять на относительные результаты между выборками. Здесь мы рекомендуем нормализовать ткань ex vivo к массе ткани и первичным преадипоцитам, дифференцированным in vitro на лунку. Однако эти методы нормализации могут не подходить для всех экспериментальных систем. Важно отметить, что если скорость пролиферации или эффективность дифференциации различаются между группами, нормализация для каждой скважины нецелесообразна. Альтернативные методы нормализации включают белок, липид и ДНК. Каждый метод нормализации имеет свои преимущества и недостатки. Нормализация массы тканей проста и понятна. Различия в размере адипоцитов могут означать, что мышечная жировая ткань содержит гораздо больше адипоцитов на грамм, чем жировая ткань с ожирением, в то время как различия в эффективности дифференцировки могут привести к различиям в количестве адипоцитов в лунке. Липиды могут быть экстрагированы с помощью органических растворителей (например, хлороформа: метанола [v/v] 2:1) и содержания триглицеридов, измеренного с использованием колориметрического реагента. Хотя нормализация содержания липидов не является традиционно используемым методом, липидные капли, в конце концов, являются органеллой, подвергающейся липолизу, и этот метод нормализации специфичен для адипоцитов, что может быть полезно, когда скорость дифференцировки различается между клетками. После экстракции липидов 0,1-0,3 N NaOH можно использовать для извлечения белка, который затем может быть проанализирован с помощью анализа белка Брэдфорда или BCA68. Альтернативно, образцы могут быть гомогенизированы в лизисном буфере, а липидная фракция удалена центрифугированием70. Обратите внимание, что загрязнение липидами будет мешать анализу белка. Если белок должен быть использован для нормализации, клетки должны быть тщательно промыты (не менее трех раз), чтобы удалить BSA из анализируемой среды. Иногда дифференцированные адипоциты плохо прилипают к пластине и не переносят три промывки, необходимые для удаления избытка BSA. Нормализация к ДНК позволяет нормализовать количество клеток и может быть выполнена с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК с последующей количественной оценкой общей ДНК путем абсорбции или ПЦР-анализа числа копий генов в реальном времени. В качестве альтернативы, в клетках с покрытием окрашивание DAPI с последующей визуализацией может быть использовано для подсчета ядер и нормализации до количества клеток. При нормализации с использованием количества клеток или белка важно учитывать неадипоцитарные клетки в образце. Жировая ткань также содержит иммунные и эндотелиальные клетки; При ожирении жировой ткани воспаление и гипертрофия могут привести к тому, что только 1 из 10 ядер происходит из зрелых адипоцитов. Тем не менее, адипоциты по-прежнему вносят свой вклад в большую часть массы и содержания липидов в ткани. Для дифференцированных преадипоцитов in vitro эффективность дифференцировки влияет на относительный процент зрелых адипоцитов; В этом случае нормализация усложняется. В идеале эффективность дифференцировки должна быть оптимизирована перед использованием клеток для анализа липолиза. Если это невозможно, рекомендуется нормализация содержания липидов, если объем липидных капель одинаков между дифференцированными адипоцитами. Сравнение липолитических показателей в культурах адипоцитов с неодинаковой дифференцировкой может привести к ошибочным выводам о липолизе, когда движущим фактором на самом деле является адипогенез; Это ограничение протокола.

Длинноцепочечные СЖК ингибируют липолизс обратной связью 63,64,65,66,67. FFA накапливаются, когда они недостаточно изолированы в средствах массовой информации. Большая часть устранения неполадок, связанных с оптимизацией измерения липолиза, связана с минимизацией удержания FFA. Расчет молярного отношения высвобождения FFA:глицерина в среду помогает выявить проблемы, связанные с удержанием FFA. Если молярное соотношение составляет 3:1 для FFA:глицерин, то все продукты липолиза высвобождаются и улавливаются в средах, в то время как соотношение ниже 2:1 является поводом для беспокойства. Важным фактором для анализов ex vivo является размер куска жировой ткани. Более крупные куски ткани имеют более низкое отношение площади поверхности к объему и, таким образом, с большей вероятностью сохраняют СЖК и, как следствие, демонстрируют пониженные липолитические показатели (рис. 4A, B). Помня об этом, очень важно разрезать жировую ткань для каждого образца на куски одинакового размера и формы. Чтобы облегчить секвестрацию FFA в средствах массовой информации, также важно убедиться, что среда содержит достаточное количество BSA для связывания высвобожденного FFA. Буферная емкость среды FFA может быть увеличена за счет увеличения концентрации BSA или увеличения объема среды. Не менее эффективно увеличивать объем или частоту сбора. Если наблюдаются высокие липолитические показатели, но соотношение FFA:глицерин ниже 2:1, мы рекомендуем увеличить частоту сбора до каждых 30 минут и прекратить анализ через 2,5 часа.

Представленный здесь протокол оптимизирован для белой жировой ткани мыши ex vivo и первичных преадипоцитов, дифференцированных in vitro, оба из которых являются высоколиполитическими. Анализ должен быть оптимизирован для измерения липолиза в других системах или если различия в относительно низкой базальной скорости липолиза представляют особый интерес. Например, адипоциты 3T3-L1 обладают более низкой липолитической активностью32. Когда скорость липолитики низкая, инкубационный объем следует уменьшить (т. е. вместо 400 мкл на лунку в 24-луночном планшете следует использовать 200 мкл в 24-луночном планшете или 300 мкл в 12-луночном планшете и 100-150 мкл собранного за определенный момент времени). Объем сбора не должен опускаться ниже 100 мкл, так как для точного измерения низких уровней СЖК и глицерина требуются большие объемы образцов. Для анализа глицерина с использованием 50 мкл среды на пробу свободный глицериновый реагент следует растворить в 31 мл воды, а 150 мкл реагента использовать с 50 мкл образца в каждой лунке. Уровни FFA могут быть измерены с 25 мкл образца на скважину, возможно, больше, при условии сохранения линейности. Временные точки также могут быть расширены для увеличения сигнала. При анализе липолитических показателей из клеток, отличных от белых адипоцитов, следует учитывать различия в клеточном метаболизме. Например, коричневые и бежевые адипоциты экспрессируют гораздо более высокие уровни глицеринкиназы и, таким образом, способны удерживать высвобождение глицерина путем липолиза76,77. Эти метаболически активные клетки также могут направлять высвобожденные жирные кислоты в катаболические или синтетические пути без высвобождения в среду. Метаболическая судьба СЖК и глицерина в конкретном анализируемом типе клеток должна учитываться при интерпретации результатов анализа липолиза, особенно в типе клеток, отличном от белых адипоцитов. Анализы липолиза в других типах клеток должны быть оптимизированы и проверены.

Этот протокол предназначен для оценки различий в скорости липолитиков на мышиных моделях. Первичные преадипоциты, дифференцированные in vitro , являются полезным инструментом для исследования клеточных автономных эффектов генетических манипуляций или фармакологических методов лечения адипоцитов. Жировая ткань, с другой стороны, содержит другие типы клеток, включая иммунные клетки. Влияние иммунных клеток жировой ткани на регуляцию липолиза важно учитывать при оценке липолиза всей ткани. Культивируемые модели липолиза адипоцитов могут обойти потенциальное осложняющее влияние иммунных клеток и обеспечить тщательное исследование конкретных типов клеток, в то время как эксплантаты жировой ткани позволяют проводить более надежное сравнение со средой in vivo . Кроме того, анализ ex vivo может быть использован для исследования липолитических показателей в различных жировых депо. В этих системах липолиз стимулируется такими соединениями, как агонисты β-адренорецепторов, таким образом, любые изменения симпатического тонуса, которые могут повлиять на мышиную модель in vivo , не будут наблюдаться. Измерение липолиза in vivo осложняется динамикой высвобождения и поглощения СЖК и глицерина различными тканями по всему организму. Уровни СЖК и глицерина в сыворотке крови в любой момент времени представляют собой баланс секреции и поглощения, и не следует предполагать, что изменения уровня СЖК и глицерина в сыворотке крови связаны исключительно с липолизом жировой ткани. На липолиз, вызванный голоданием, влияет симпатический тонус, но он не вызывает быстрых и устойчивых изменений уровня СЖК или глицерина в сыворотке крови, что затрудняет интерпретацию изменений уровней СЖК и глицерина в сыворотке натощак. Липолиз in vivo можно стимулировать с помощью агониста адренорецепторов β-3, такого как CL-316,243, а повышенный уровень СЖК и глицерина в сыворотке крови обнаруживается в течение 20 минут после стимуляции. Липолитические анализы in vivo должны включать как исходные измерения сывороточного СЖК и глицерина, так и контроль носителя; таким образом, можно определить специфическое для стимуляции изменение уровня СЖК и глицерина в сыворотке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения США R01DK126944 для S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193
Измерение скорости липолиза в мышиной жировой ткани ex <em>vivo</em> и первичных преадипоцитах, дифференцированных <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter