A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Abstract

Adipocyten slaan energie op in de vorm van triglyceriden in lipidedruppeltjes. Deze energie kan worden gemobiliseerd via lipolyse, waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst van de glycerol-ruggengraat, wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Vanwege de lage expressie van glycerolkinase in witte adipocyten zijn de heropnamesnelheden van glycerol verwaarloosbaar, terwijl de heropname van vetzuren wordt bepaald door de vetzuurbindende capaciteit van mediacomponenten zoals albumine. Zowel glycerol als vetzuurafgifte in media kunnen worden gekwantificeerd door colorimetrische assays om de lipolytische snelheid te bepalen. Door deze factoren op meerdere tijdstippen te meten, kan men de lineaire snelheid van lipolyse met hoge betrouwbaarheid bepalen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de meting van lipolyse in in vitro gedifferentieerde adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor andere preadipocytencellijnen of vetweefsel van andere organismen; Overwegingen en optimalisatieparameters worden besproken. Dit protocol is ontworpen om nuttig te zijn bij het bepalen en vergelijken van de snelheid van adipocytenlipolyse tussen muismodellen en behandelingen.

Introduction

Overtollige voedingsstoffen worden opgeslagen in wit vetweefsel in de vorm van triglyceriden in de neutrale lipidekern van lipidedruppels. Triglyceridevoorraden worden gemobiliseerd via lipolyse, een proces waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst door vetweefseltriglyceridilase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL), wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren (FFA’s) en de glycerol-ruggengraat ^1,2. Lipolyse wordt geactiveerd door catecholaminesignalering in het vetweefsel. Sympathische zenuwuiteinden geven lokaal catecholaminen af, die binden aan β-adrenerge receptoren op het adipocytenplasmamembraan. Bij ligandbinding activeren deze G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR’s) adenylylcyclase via G_αs. Daaropvolgende activering van proteïnekinase A (PKA) door cAMP resulteert in de upregulatie van zowel ATGL als HSL. De fosforylering van perilipine-1 door PKA veroorzaakt de dissociatie van ABHD5 (ook bekend als CGI-58), dat ATGL³ bindt en coactiveert. PKA fosforyleert HSL direct en bevordert de translocatie van het cytosol naar de lipidedruppel, waar interactie met gefosforyleerd perilipine-1 de lipase-activiteit verder bevordert 4,5,6,7. De derde lipase die betrokken is bij lipolyse, MGL, lijkt niet te worden gereguleerd door catecholaminesignalering⁸. Belangrijk is dat triglyceridensynthese in adipocyten wordt gemedieerd door de glycerollipidesyntheseroute, die niet de vorming van monoglyceriden als tussenproduct met zich meebrengt; in plaats daarvan katalyseren glycerol-3-fosfaat acyltransferasen de vorming van lysofosfatidinezuur, dat wordt gecombineerd met een ander vette acyl-CoA om fosfatidisch zuur te vormen en vervolgens wordt geïsomeriseerd tot diglyceriden vóór de uiteindelijke synthese van triglyceriden (figuur 1) 9,10,11.

Figuur 1: Lipolyse en glycerol lipide synthese routes. Top: Lipolytische route; enzymen in rood: vetweefsel triglyceride lipase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL). Onder: glycerol lipide synthese route; enzymen in het groen: diglyceride acyltransferase (DGAT), fosfatidinezuurfosfatase (PAP), lysofosfatidinezuuracyltransferase (LPAT, ook bekend als LPAATs) en glycerol-3-fosfaatacyltransferase (GPAT). Lipiden: triglyceride (TG), diglyceride (DG), monoglyceride (MG), vrij vetzuur (FFA), vette acyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinezuur (LPA) en fosfatidinezuur (PA). Andere metabolieten: anorganisch fosfaat (Pi) en glycerol 3-fosfaat (G3P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Extracellulaire adenosine is een andere belangrijke regulator van lipolyse, die werkt via G s- en G_i-gekoppelde GPCR’s om de adenylcyclase-activiteit te beïnvloeden. De overheersende adenosinereceptor in adipocyten, ADORA1, remt adenylylcyclase en dus lipolyse door de activering van G_i¹². Uitgedrukt op lagere niveaus, en voornamelijk in bruine adipocyten, activeert ADORA2A lipolyse via G_s signalering¹³. ADORA1 beïnvloedt zowel basale lipolyse als de respons op adrenerge agonisten. Het effect van adenosine op lipolyse kan worden gecontroleerd door adenosinedeaminase toe te voegen om adenosine te neutraliseren, evenals de ADORA1-specifieke agonist fenylisopropyladenosine^14,15. Hormonale activering van G q-gekoppelde GPCR’s kan ook de lipolyse beïnvloeden via de activering van fosfolipase C en eiwitkinase C^16,17,18,19. Ontstekingssignalen hebben ook invloed op de lipolytische snelheden. TLR4-activering door LPS (en andere endotoxinen) verhoogt de lipolytische snelheid door ERK te activeren, dat perilipine-1 en HSL²⁰ fosforyleert. TNF-α activeert ook lipolyse via ERK- en NF-κB-activering, evenals transcriptionele downregulatie van het fosfodiësterase PDE-3B en CIDEC^21,22,23. IL-6 is ook in verband gebracht met verhoogde adipocytenlipolyse, vooral in mesenterisch vetweefsel, waarvan de FFA-afgifte van invloed is op leversteatose en gluconeogenese^24,25,26.

Lipolyse wordt onderdrukt tijdens de gevoede toestand door insuline. AKT fosforyleert en activeert PDE-3B om cAMP-signalering te onderdrukken en PKA-activering te voorkomen²⁷. Insuline downreguleert ook transcriptioneel ATGL²⁸. Obesitas bevordert catecholamineresistentie door middel van een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder de downregulatie van β-adrenerge receptoren in adipocyten 29,30,31,32,33. Adipocyten brengen alle drie de β-adrenerge receptoren tot expressie (β-1, β-2 en β-3). Terwijl β-1 en β-2 adrenerge receptoren alomtegenwoordig tot expressie komen, wordt de β-3 adrenerge receptor voornamelijk uitgedrukt in adipocyten in muizen^34,35. Adrb3-expressie wordt geïnduceerd door C/EBPα tijdens adipogenesis³⁶. De β-3 adrenerge receptor komt sterk tot expressie in volwassen adipocyten. De activering van β-1 en β-2 adrenerge receptoren is zelfbeperkend als gevolg van feedbackremming door β-arrestine³⁷. Feedbackremming van de β-3 adrenerge receptor wordt gemedieerd door andere signaalroutes, die de Adrb3-expressie 33,38,39 verminderen.

Talrijke verbindingen kunnen worden gebruikt om adipocytenlipolyse te activeren. Catecholamines zijn belangrijke fysiologische activatoren van lipolyse. Noradrenaline (of noradrenaline) en epinefrine (of adrenaline) activeren alle drie de β-adrenerge receptoren⁴⁰. Noradrenaline en epinefrine beïnvloeden ook lipolyse via activering van α-adrenerge receptorsignalering⁴¹. Veelgebruikte β-adrenerge receptoragonisten zijn isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, en de β-3 adrenerge receptoragonisten CL-316,243 en mirabegron⁴². Aangezien adipocyten voornamelijk de β-3 adrenerge receptor tot expressie brengen, gebruiken we hier CL-316,243 als voorbeeld. De specificiteit voor de β-3 adrenerge receptor maakt het ook een relatief specifieke activator van adipocyte catecholamine signalering, die ook veilig in vivo kan worden gebruikt. Merk op dat de veelgebruikte concentratie van 10 μM CL-316,243 in celcultuur ordes van grootte hoger is dan de ~ 0,1 μM dosis die nodig is om een maximale respons^{te bereiken 33}. Forskolin omzeilt de adrenerge receptor, direct activeren adenylyl cyclase en downstream lipolytische signalering. Er zijn veel meer activatoren, evenals onderdrukkers van lipolyse. Bij het selecteren van een verbinding om lipolyse te stimuleren, moeten de receptorspecificiteit en downstream signaalroutes zorgvuldig worden overwogen binnen het experimentele ontwerp.

De snelheid van lipolyse in wit vetweefsel is een belangrijke metabolische factor die van invloed is op de koudetolerantie en de beschikbaarheid van voedingsstoffen tijdens vasten of lichaamsbeweging^43,44,45,46. Het doel van dit protocol is om de snelheid van lipolyse in adipocyten en vetweefsel te meten, wat het begrip van adipocytenmetabolisme zal vergemakkelijken en hoe dit het metabole fenotype van verschillende muizenmodellen kan beïnvloeden. Om de lipolytische snelheid te kwantificeren, meten we het uiterlijk van lipolytische producten in de media (d.w.z. FFA’s en glycerol). De methode is gebaseerd op het vrijkomen van lipolytische producten uit de adipocyt in de media. Aangezien witte adipocyten lage niveaus van glycerolkinase tot expressie brengen, zijn de heropnamepercentages van glycerol laag⁴⁷. Omgekeerd moet ook de productie van FFA’s en glycerol door andere metabole routes dan lipolyse worden overwogen. Adipocyten lijken een fosfatase uit te drukken met activiteit tegen glycerol-3-fosfaat, waardoor de productie van glycerol uit glycerol-3-fosfaat afgeleid van glucose^48,49,50 mogelijk is. Glycolyse is een bron van glycerol-3-fosfaat dat wordt gebruikt voor FFA-herverestering in witte adipocyten. Wanneer de glucosespiegels beperkt zijn, vereist glyceroneogenese andere 3-koolstofbronnen, zoals lactaat en pyruvaat⁵¹. De kanalisatie van FFA’s die vrijkomen door lipolyse in de cel en hun metabolische lot is slecht begrepen; FFA’s die vrijkomen door lipolyse moeten worden omgezet in vette acyl-CoA, voordat ze opnieuw worden veresterd of β-oxidatie ondergaan. Het lijkt erop dat FFA’s die vrijkomen door lipolyse waarschijnlijk de cel verlaten voordat ze weer worden opgenomen en omgezet in vette acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA’s kunnen buiten de cel worden gesekwestreerd door albumine. Belangrijk is dat van FFA’s met een lange keten bekend is dat ze de lipolyse remmen als ze niet worden gesekwestreerd door albumine 63,64,65,66,67. Het optimaliseren van de FFA-buffercapaciteit van de media tijdens de lipolyse-assay is dus van cruciaal belang. De hier beschreven procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde methoden om de lipolytische snelheid in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen en mensen te meten 15,68,69,70,71. Dit protocol verschilt door het gebruik van seriële bemonstering; Door seriële bemonstering uit te voeren, kunnen we intern valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en meerdere metingen gebruiken om de snelheid van lipolyse te berekenen, waardoor de meetfout wordt verminderd om het vertrouwen in de uiteindelijke berekende waarde te vergroten. Het nadeel van seriële bemonstering is dat de test meer tijd en reagentia vereist; Het langere tijdsbestek vermindert echter de impact van meetfouten op de standaardfout van de schattingen van het tarief. Bovendien meet dit protocol zowel FFA als glycerolafgifte en beschouwt het de verhouding FFA: glycerolafgifte met als doel een 3: 1-verhouding te bereiken, zoals zou worden verwacht van volledige lipolyse en afgifte van lipolytische producten in de media⁷².

Protocol

Het gebruik van alle dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het Weill Cornell Medical College van Cornell University.

1. Voorbereiding van buffers en opvangplaten

1. Maak 5% runderserumalbumine (BSA) door 5 g BSA op te lossen in 100 ml Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) zonder fenolrood. Roer de BSA voorzichtig om op te lossen (schudden werkt averechts). Zodra de BSA volledig is opgelost, filter-steriliseer de media met een 0,2 μm filter. Bewaar de BSA media bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
2. Maak werkconcentraties van controle- en stimulatiemedia. Besturingsmedia: 5% BSA-media met voertuigbesturing. Stimulatiemedia: 5% BSA-media met 0,5 μM CL-316,243. Maak nieuwe stimulatiemedia voor elk experiment.
3. Verwarm de te gebruiken media tot 37 °C. Label een plaat met 96 putten voor mediaverzameling.

2. Monstervoorbereiding

1. Voer celkweek uit zoals hieronder beschreven. Voer alle celwerkzaamheden uit in een steriele zuurkast om besmetting van buitenaf te minimaliseren.
   1. Isoleer en differentieer primaire preadipocyten, zoals in^73,74.
      1. Plaat primaire preadipocyten met een hoge dichtheid, zoals 1 x 10⁵ cellen / put in een 24-well plaat in 1 ml / put kweekmedia (15% foetaal runderserum (FBS) en 1x penicilline-streptomycine-glutamine in DMEM / F12).
      2. Nadat de cellen 100% confluentie hebben bereikt, differentiëren met 5 μM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μg / ml insuline en 1 μM thiazolidinedion (TZD) in kweekmedia gedurende 3 dagen. Schakel vervolgens over op kweekmedia met 1 μg / ml insuline gedurende ten minste 3 dagen om lipidedruppels te laten groeien. Gebruik 1 ml/put media in de 24-well plaat.
      3. Vervang de kweekmedia (1 ml/put) met insuline om de 2 of 3 dagen. De cellen kunnen tot 2 weken in media met insuline worden gehouden. Gebruik alleen culturen waarin de differentiatiepercentages meer dan 90% zijn en vergelijkbaar zijn tussen groepen voor deze test, omdat verminderde differentiatie verkeerd kan worden geïnterpreteerd als een verlaging van de lipolytische snelheid.
      4. Kweek de cellen in insulinevrije media gedurende 24 uur voorafgaand aan het meten van lipolyse.
         OPMERKING: Insuline in de media onderhoudt lipidedruppels, maar remt ook lipolyse. Incubatie zonder insuline gedurende 24 uur zorgt voor volledige lipolytische activering zonder verlies van lipidedruppelvolume. In sommige systemen moet de kweektijd zonder insuline mogelijk worden verkort of verlengd.
   2. Was de cellen eenmaal met DPBS om het resterende serum uit de kweekmedia te verwijderen.
      OPMERKING: Dit protocol omvat geen serumuithongering, die lipolyse kan activeren. Serumhonger kan naar goeddunken van de onderzoeker worden gebruikt.
2. Voer ex vivo cultuur uit zoals hieronder beschreven.
   1. Bereid een plaat met 6 putten voor, met één put voor elk weefsel dat van elke muis moet worden verzameld. Plaats 4 ml DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put.
      OPMERKING: BSA in de verzamelmedia is niet nodig.
   2. Bereid een plaat met 48 putten voor de lipolysetest, met één put voor elke replicatie. Plaats 400 μL DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put. Gebruik twee tot vier controle- en twee tot vier gestimuleerde putjes per weefsel per muis.
   3. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder anesthesie, met een secundaire methode zoals bilaterale pneumothorax. Hier gebruikten we een 32 g, 7 maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, gevoed met een 45% vetrijk dieet gedurende 4 maanden.
      OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt voor mannen, evenals andere stammen, diëten en leeftijden.
   4. Spray met 70% ethanol en gebruik een schaar om een kleine (~ 1 cm) laterale incisie in het midden van de buikhuid te maken, trek de huid uit elkaar door aan weerszijden met duim en wijsvinger te knijpen en vouw de onderbuikhuid om om de achterste onderhuidse depots te onthullen. Lokaliseer en verwijder de inguinale lymfeklier en ontleed het inguinale vetweefsel onmiddellijk na de inguinale lymfeklier met een tang.
   5. Om het gonadale vetweefsel te verzamelen, maakt u een laterale en een verticale incisie in het peritoneum om toegang te krijgen tot de peritoneale holte. Houd het gonadale vetkussen vast met een pincet en snijd langs de baarmoeder (of bijbal voor mannen) om het gonadale vetweefsel te verwijderen. Plaats de verzamelde depots in een 6-well plaat.
   6. Verwijder het weefsel goed, leg het op een siliconenmat en snijd met een schaar in stukjes van 5 tot 7 mg.
   7. Weeg 25 tot 30 mg (vijf of zes brokken) voor elke test goed af en plaats in een 48-well assay-plaat. Dep de tissue op een schone handdoek voordat u weegt om eventuele media te verwijderen. Weeg het gewicht na verwijdering van het weefsel en noteer het gewicht van eventuele achtergebleven resten. Veeg de gewichtsboot schoon tussen de monsters en reparaer indien nodig. Gebruik een nieuwe gewichtsboot voor elk weefsel.
   8. Zodra alle weefselmonsters zijn gewogen, plaatst u de 48-well assay plate in een 37 °C, 10% CO 2-incubator gedurende 15 minuten.

3. Lipolyse-test

1. Mediaverzameling uitvoeren. Voer de overdracht van de media en de daaropvolgende monsterverzameling uit in een steriele zuurkast om mogelijke verontreiniging door externe bronnen te minimaliseren.
   1. Bij t = 0 verwijdert u de media en voegt u 400 μL per put controle- of stimulatiemedia toe en plaatst u de plaat in een 37 °C, 10% CO 2-incubator. Voor ex vivo weefselkweek, verwijder media voorzichtig met behulp van een pipet; zuigkracht mag nooit worden gebruikt.
      OPMERKING: U kunt ook een tweede plaat met controle- en stimulatiemedia voorbereiden en de weefsels overbrengen.
   2. Verzamel bij t = 1, 2, 3 en 4 uur 200 μL media, vervang door 200 μL van de juiste controle- of stimulatiemedia en breng de testplaat terug naar de incubator. Bewaar de opvangplaat bij 4 °C. Om de FFA-buffercapaciteit van de BSA-media te bepalen, gebruikt u een extra verzameling na 24 uur.
      OPMERKING: De experimenten kunnen hier worden gestopt en de verzamelde media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

4. FFA colorimetrische assay

1. Verwarm de reagentia tot kamertemperatuur en los één fles kleurreagens A op met één fles oplosmiddel A en één fles kleurreagens B met één fles oplosmiddel B. Vanaf de datum van reconstitutie kunnen deze reagentia het beste binnen 1 week worden gebruikt. 1 maand na reconstitutie weggooien.
2. Ontdooi en meng de monsters.
3. Maak een FFA-standaardcurve. De standaardoplossing is 1 mM. Gebruik het volgende volume met de reagentia voor de standaardcurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 verdunning), 10 μL (1:4 verdunning), 10 μL (1:8 verdunning) en 10 μL water voor maximaal bereik. Voor lage FFA-niveaus kan de standaard 10 μL van 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0,05 mM meer van toepassing zijn.
4. Pipetstandaarden en monsters in een 96-well assayplaat. Het aanbevolen monstervolume is 10 μL. Neem drie putjes op met hetzelfde volume BSA-media als de monsters voor achtergrondcorrectie.
   OPMERKING: Als de monsterconcentraties buiten het bereik van de standaardcurve vallen, herhaalt u de test en stelt u het monstervolume in op 2-25 μl.
5. Voeg 150 μL reagens A toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
6. Lees de absorptie van de plaat af bij 550 nm en 660 nm referentie (aflezing A).
7. Voeg 75 μL reagens B toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
8. Lees de absorptie van de plaat opnieuw af bij 550 nm en 660 nm referentie (Reading B).

5. Glycerol colorimetrische assay

1. Reconstitueer het vrije glycerolreagens met 36 ml ultrapuur water en acclimatiseer aan kamertemperatuur. Deze reagentia kunnen het beste binnen enkele weken worden gebruikt. 2 maanden na reconstitutie weggooien.
2. Ontdooi en meng de monsters.
3. Maak een glycerolstandaardcurve door een zevenpunts, 2-voudige seriële verdunning van de glycerolstandaardoplossing en een waterblanco te maken.
   OPMERKING: De standaardcurve is relatief lineair tot 25 μL van 2,8 mM glycerol, maar niet lineair bij hogere concentraties.
4. Pipetteer 25 μL elk van de standaard en monsters in de 96-well assay plaat. Voeg drie putten toe aan de BSA-media voor achtergrondcorrectie.
5. Voeg 175 μL vrij glycerolreagens toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
6. Lees de absorptie van de plaat bij 540 nm.

6. Berekening van de lipolytische snelheid

1. Begin met optische dichtheidswaarden (OD). Gebruik voor glycerol direct A₅₄₀ OD-waarden. Bereken de OD van de FFA-test volgens de volgende formule:
   OD = (Lezing B: A 550 – A 660) – (Lezing A: A₅₅₀ – A ₆₆₀)
2. Gebruik de standaardcurve om de FFA- en glycerolniveaus in de verzamelde monsters te berekenen. Zet de standaard OD-waarden uit op de y-as en gebruik op de x-as standaardconcentraties ten opzichte van het monstervolume (d.w.z. de concentratie van de putten met 20 μL van 1 mM FFA-standaard op een plaat met 10 μL-monsters is gelijk aan 2 mM). Pas een lineaire trendlijn aan:
   y = mx + b
3. Inspecteer de standaardcurve visueel en verwijder alle punten buiten het lineaire bereik van de test. Bereken de monsterconcentraties met behulp van de vergelijking:
   Monsterconcentratie: x = (OD – b) ÷ m
4. Pas monsters aan en test deze opnieuw die buiten het lineaire testbereik vallen. Om de uiteindelijke monsterconcentratie te verkrijgen, trekt u de concentratie van de achtergrondputten die alleen BSA-media bevatten af van de concentratie van de monsters.
5. Bereken de mol FFA en glycerol geproduceerd door elk monster op elk tijdstip, volgens de formule:
   
   waarbij C n = concentratie op tijdstip t = n; V_t = totaal volume in de put; V_s = volume van de monsterneming; en M n = mol geproduceerd op tijdstip t = n (wanneer de concentraties in mM zijn en de volumes in ml zijn, is de output μMol).
   Voorbeelden, op verschillende tijdstippen:
   M 1 = C₁ × V_t
   M 4 = C₄ × V_t + (C₁ + C₂+ C₃)V_s
   of
   M 4 = C₄ × V_t + C₃ × V s + C₂ × V s + C₁ ×V _s
6. Normaliseer tot weefselgewicht door het weefselgewicht voor elk monster in grammen te delen om eenheden μmol/g te verkrijgen. Voor gekweekte cellen worden waarden gepresenteerd als μmol/well. Zorg ervoor dat het celaantal en de differentiatie-efficiëntie vergelijkbaar zijn van goed tot goed.
   OPMERKING: Verschillen in proliferatie- of differentiatie-efficiëntie zullen de interpretatie van resultaten bemoeilijken en een andere methode van normalisatie vereisen (bijv. Normalisatie naar eiwit; zie discussie).
7. Bereken de helling van de geproduceerde μmol/g (y-as) versus tijd (x-as) voor elk monster afzonderlijk.
   1. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =SLOPE(known_ys,known_xs). Typ in een nieuwe cel “=SLOPE” (gebruik vervolgens de cursor om de glycerol- of FFA-waarden van het monster in μmol/g te markeren en vervolgens de bijbehorende tijdwaarden te markeren).
   2. Controleer de lineariteit van de gegevens. R^2-waarden zijn een snelle manier om de lineariteit van de monsters te bepalen. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =RSQ(known_ys,known_xs), op dezelfde manier als beschreven in stap 6.7.1, maar de initiële invoer is =RSQ. Zorg ervoor dat de R^2-waarden > 0,98 zijn; lagere waarden duiden op afwijking van de lineariteit. Dit kan het gevolg zijn van een meet-/bemonsteringsfout of verlies van lineariteit.
      1. Een andere manier om de lineariteit te testen, is door voor elk monster een lineaire regressie uit te voeren en de residuen uit te zetten. Genereer in statistische analysesoftware een XY-tabel met één Y-waarde voor elk tijdstip. Selecteer Analyseren > Eenvoudige lineaire regressie en selecteer het vakje voor Residuele plot voordat u op OK drukt. De resterende grafiek wordt weergegeven als een nieuwe grafiek.
8. Gebruik de FFA- en glycerolproductiesnelheid (d.w.z. helling [(μmol/g/h]) voor elk monster als een individueel gegevenspunt om statistische analyse uit te voeren en waarden uit te zetten als verschillende lipolytische omstandigheden worden vergeleken. Als lipolytische snelheden worden vergeleken tussen genotypen, gebruik dan twee of drie monsters per dier als technische replicaties en gebruik het gemiddelde voor één gegevenspunt per dier, zodat de steekproefgrootte gelijk is aan het aantal dieren.

Representative Results

Discussion

Hier bieden we een basisprotocol voor het meten van de snelheid van lipolyse in adipocyten en ex vivo vetweefsel. Om lipolyse te kwantificeren, is het belangrijk om de lipolytische snelheid in de lineaire fase te meten. We maken gebruik van een seriële bemonsteringstechniek, waarbij een groot deel van de media wordt verzameld en op regelmatige tijdstippen wordt vervangen door verse media. Deze semiconservatieve methode maakt de toevoeging van verse BSA met FFA-buffercapaciteit mogelijk en vertraagt feedbackremming, waardoor de duur van lineaire lipolyse wordt verlengd. Dit experimentele ontwerp probeert de vascularisatie van vetweefsel in vivo samen te vatten, die verse albumine levert om vrijgegeven FFA’s⁷⁵ te binden. Dit protocol werd geoptimaliseerd om lipolyse te meten in murine ex vivo wit vetweefsel en inguinaal vetweefsel primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro. Het protocol kan waarschijnlijk worden geoptimaliseerd om goed te werken in bruine en beige vetdepots, evenals vetweefsel van andere organismen en vereeuwigde cellijnen met een hoog adipogene potentieel. Het protocol zorgt voor flexibiliteit in de leeftijd, het geslacht en het dieet van de muizen voorafgaand aan het verzamelen van vetweefsel voor ex vivo assays. Sommige manipulaties, zoals vasten, kunnen de basale lipolytische snelheid beïnvloeden, terwijl andere interventies zoals door voeding geïnduceerde obesitas ook van invloed zijn op de snelheid van gestimuleerde lipolyse.

Het protocol moet worden geoptimaliseerd voor elk experimenteel systeem, afhankelijk van of de lipolytische snelheden hoger of lager zijn. Om de lineariteit te valideren, raden we aan om de R^2-waarden te berekenen en naar de restgrafiek te kijken. De R^2-waarden moeten zeer dicht bij 1 liggen. Bij het evalueren van het restperceel moet men uitkijken naar negatieve restwaarden op latere tijdstippen, omdat deze aangeven dat de lipolytische snelheden afnemen en de lineariteit verloren gaat. Voorbeelden van dergelijke resterende waarnemingspunten zijn weergegeven in figuur 5E,F. Het elimineren van de 4-uurstijdpunten in dit geval biedt een nauwkeurigere berekening van de lineaire lipolytische snelheid en verbetert de R^2-waarden. Omdat de snelheid echter wordt berekend op basis van meerdere tijdstippen, is deze relatief robuust en heeft het opnemen van een dergelijk tijdstip slechts een kleine invloed op de R^2-waarden en de berekende lipolysesnelheid. Als een enkel tijdstip wordt gebruikt om de lipolytische snelheid te berekenen, kunnen de gegevens gemakkelijker worden vertekend.

De manier waarop de gegevens worden genormaliseerd, kan ook van invloed zijn op de relatieve resultaten tussen steekproeven. Hier raden we aan om het ex vivo weefsel te normaliseren tot het weefselgewicht en de primaire preadipocyten in vitro per put te differentiëren. Deze normalisatietechnieken zijn echter mogelijk niet geschikt voor alle experimentele systemen. Belangrijk is dat als de proliferatiesnelheid of differentiatie-efficiëntie verschilt tussen groepen, normalisatie per put niet geschikt is. Alternatieve normalisatietechnieken omvatten eiwitten, lipiden en DNA. Elke methode van normalisatie heeft zijn voor- en nadelen. Weefselgewicht en bronnormalisatie is eenvoudig en duidelijk. Verschillen in adipocytengrootte kunnen betekenen dat mager vetweefsel veel meer adipocyten per gram bevat dan zwaarlijvig vetweefsel, terwijl verschillen in differentiatie-efficiëntie kunnen resulteren in verschillen in het aantal adipocyten per put. Lipiden kunnen worden geëxtraheerd met organische oplosmiddelen (bijv. 2:1 chloroform:methanol [v/v]) en triglyceridengehalte gemeten met een colorimetrisch reagens. Hoewel normalisatie naar lipidegehalte geen traditioneel gebruikte methode is, zijn de lipidedruppels immers het organel dat lipolyse ondergaat, en deze normalisatiemethode is specifiek voor adipocyten, wat nuttig kan zijn wanneer differentiatiesnelheden verschillen tussen cellen. Na lipidenextractie kan 0,1-0,3 N NaOH worden gebruikt om eiwit te extraheren, dat vervolgens kan worden getest door Bradford- of BCA-eiwittest⁶⁸. Als alternatief kunnen de monsters worden gehomogeniseerd in lysisbuffer en kan de lipidefractie worden verwijderd door centrifugatie⁷⁰. Merk op dat lipidebesmetting de eiwittests zal verstoren. Als eiwit moet worden gebruikt voor normalisatie, moeten de cellen uitgebreid (ten minste drie keer) worden gewassen om BSA uit de testmedia te verwijderen. Soms hechten gedifferentieerde adipocyten niet goed aan de plaat en verdragen ze niet de drie wasbeurten die nodig zijn om overtollig BSA te verwijderen. Normalisatie naar DNA maakt normalisatie naar celnummer mogelijk en kan worden uitgevoerd met een commerciële DNA-extractiekit, gevolgd door de kwantificering van het totale DNA door absorptie of real-time PCR-analyse van het aantal genkopieën. Als alternatief kan in vergulde cellen DAPI-kleuring gevolgd door beeldvorming worden gebruikt om kernen te tellen en te normaliseren tot celnummer. Bij het normaliseren met behulp van celnummer of eiwit, is het belangrijk om niet-adipocytcellen in het monster te overwegen. Vetweefsel bevat ook immuun- en endotheelcellen; In zwaarlijvig vetweefsel kunnen ontsteking en hypertrofie resulteren in slechts 1 op de 10 kernen afkomstig van volwassen adipocyten. Adipocyten dragen echter nog steeds bij aan het grootste deel van de massa en het lipidengehalte van het weefsel. Voor in vitro gedifferentieerde preadipocyten heeft de differentiatie-efficiëntie invloed op het relatieve percentage rijpe adipocyten; Wanneer dit het geval is, is normalisatie ingewikkeld. Idealiter zou de differentiatie-efficiëntie moeten worden geoptimaliseerd voordat de cellen worden gebruikt voor een lipolyse-assay. Indien dit niet mogelijk is, wordt normalisatie naar lipidegehalte aanbevolen als het lipidedruppelvolume vergelijkbaar is tussen gedifferentieerde adipocyten. Vergelijking van lipolytische snelheden tussen adipocytenculturen met ongelijke differentiatie kan leiden tot onjuiste conclusies over lipolyse wanneer de drijvende factor eigenlijk adipogenesis is; Dit is een beperking van het protocol.

Lange keten FFA’s feedback-remmen lipolyse 63,64,65,66,67. FFA’s stapelen zich op wanneer ze niet voldoende in de media worden gesekwestreerd. Veel van de probleemoplossing in verband met het optimaliseren van de meting van lipolyse is gerelateerd aan het minimaliseren van FFA-retentie. Het berekenen van de molaire verhouding van FFA: glycerolafgifte in de media helpt bij het identificeren van problemen met betrekking tot FFA-retentie. Als de molaire verhouding 3: 1 is voor FFA: glycerol, dan worden alle producten van lipolyse vrijgegeven en vastgelegd in de media, terwijl een verhouding onder 2: 1 reden tot bezorgdheid is. Een belangrijke overweging voor ex vivo assays is de grootte van het vetweefselstuk. Grotere stukken weefsel hebben een lagere oppervlakte-volumeverhouding en hebben dus meer kans om FFA’s te behouden en vertonen als gevolg daarvan verminderde lipolytische snelheden (figuur 4A, B). Met dit in gedachten is het van cruciaal belang om het vetweefsel voor elk monster in brokken van een consistente grootte en vorm te snijden. Om FFA-sekwestratie in de media te vergemakkelijken, is het ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de media voldoende BSA bevatten om de vrijgegeven FFA te binden. De FFA-buffercapaciteit van de media kan worden verhoogd door de concentratie van BSA te verhogen of het volume van media te vergroten. Het is even effectief om het inzamelvolume of de frequentie te verhogen. Als men hoge lipolytische snelheden waarneemt, maar FFA: glycerolverhoudingen lager zijn dan 2: 1, raden we aan de verzamelfrequentie te verhogen tot elke 30 minuten en de test te stoppen bij 2,5 uur.

Het hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor muis ex vivo wit vetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro, die beide zeer lipolytisch zijn. De test moet worden geoptimaliseerd om lipolyse in andere systemen te meten, of als verschillen in de relatief lage basale snelheid van lipolyse van bijzonder belang zijn. 3T3-L1 adipocyten hebben bijvoorbeeld een lagere lipolytische activiteit³². Wanneer de lipolytische snelheid laag is, moet het incubatievolume worden verlaagd (d.w.z. in plaats van 400 μL per put in een 24-wellplaat, moet 200 μL in een 24-wellsplaat worden gebruikt, of 300 μL in een 12-wellsplaat en 100-150 μL verzameld per tijdstip. Het verzamelvolume mag niet onder de 100 μl dalen, omdat grotere monstervolumes nodig zijn om lage FFA- en glycerolniveaus nauwkeurig te meten. Om glycerol te testen met 50 μL media per monster, moet het vrije glycerolreagens worden opgelost in 31 ml water en 150 μL reagens worden gebruikt met 50 μL monster in elk putje. FFA-niveaus kunnen worden gemeten met 25 μL monster per put, misschien meer, zolang de lineariteit wordt gehandhaafd. Tijdpunten kunnen ook worden verlengd om het signaal te verhogen. Bij het testen van lipolytische snelheden uit andere cellen dan witte adipocyten, moet rekening worden gehouden met verschillen in cellulair metabolisme. Bruine en beige adipocyten brengen bijvoorbeeld veel hogere niveaus van glycerolkinase tot expressie en kunnen dus de glycerolafgifte behouden door lipolyse^76,77. Deze metabolisch actieve cellen kunnen ook in staat zijn om vrijgegeven vetzuren in katabole of synthetische routes te kanaliseren zonder vrij te komen in de media. Het metabole lot van de FFA en glycerol in het specifieke celtype dat wordt getest, moet worden overwogen bij het interpreteren van de resultaten van een lipolyse-assay, vooral in een ander celtype dan witte adipocyten. Lipolyse-assays in andere celtypen moeten worden geoptimaliseerd en gevalideerd.

Dit protocol is ontworpen om verschillen in lipolytische snelheid in muismodellen te evalueren. Primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro zijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van celautonome effecten van genetische manipulaties of farmacologische behandelingen in adipocyten. Vetweefsel daarentegen bevat andere celtypen, waaronder immuuncellen. De impact van vetweefselimmuuncellen bij het reguleren van lipolyse is belangrijk om te overwegen bij het beoordelen van lipolyse van het hele weefsel. Gekweekte adipocytenlipolysemodellen kunnen de potentiële complicerende invloed van immuuncellen omzeilen en het grondige onderzoek van de specifieke celtypen mogelijk maken, terwijl vetweefselexplantaten een robuustere vergelijking met de in vivo omgeving mogelijk maken. Bovendien kan de ex vivo assay worden gebruikt om lipolytische snelheden in verschillende vetdepots te onderzoeken. In deze systemen wordt lipolyse gestimuleerd door verbindingen zoals β-adrenerge receptoragonisten, dus eventuele veranderingen in sympathische tonus die van invloed kunnen zijn op het in vivo muismodel zullen niet worden waargenomen. In vivo meting van lipolyse wordt bemoeilijkt door de dynamiek van FFA en glycerolafgifte en -opname in verschillende weefsels door het hele lichaam. Serum-FFA- en glycerolspiegels op een bepaald tijdstip zijn de balans tussen secretie en opname, en er mag niet worden aangenomen dat veranderingen in serum-FFA- en glycerolspiegels uitsluitend toe te schrijven zijn aan lipolyse van vetweefsel. Nuchtere geïnduceerde lipolyse wordt beïnvloed door sympathische tonus, maar produceert geen snelle en robuuste veranderingen in serum-FFA- of glycerolspiegels, waardoor het moeilijk is om veranderingen in nuchtere serumspiegels van FFA en glycerol te interpreteren. In vivo lipolyse kan worden gestimuleerd met behulp van een β-3 adrenerge receptoragonist, zoals CL-316,243, en verhoogde serum FFA en glycerol zijn detecteerbaar binnen 20 minuten na stimulatie. In vivo lipolytische assays moeten zowel nulmetingen van serum-FFA en glycerol omvatten, als een voertuigcontrole; op deze manier kan de stimulatiespecifieke verandering in serum-, FFA- en glycerolspiegels worden bepaald.

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc, 	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793 	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A 	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B 	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x 	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work