Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Abstract

Adipocyten slaan energie op in de vorm van triglyceriden in lipidedruppeltjes. Deze energie kan worden gemobiliseerd via lipolyse, waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst van de glycerol-ruggengraat, wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Vanwege de lage expressie van glycerolkinase in witte adipocyten zijn de heropnamesnelheden van glycerol verwaarloosbaar, terwijl de heropname van vetzuren wordt bepaald door de vetzuurbindende capaciteit van mediacomponenten zoals albumine. Zowel glycerol als vetzuurafgifte in media kunnen worden gekwantificeerd door colorimetrische assays om de lipolytische snelheid te bepalen. Door deze factoren op meerdere tijdstippen te meten, kan men de lineaire snelheid van lipolyse met hoge betrouwbaarheid bepalen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de meting van lipolyse in in vitro gedifferentieerde adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor andere preadipocytencellijnen of vetweefsel van andere organismen; Overwegingen en optimalisatieparameters worden besproken. Dit protocol is ontworpen om nuttig te zijn bij het bepalen en vergelijken van de snelheid van adipocytenlipolyse tussen muismodellen en behandelingen.

Introduction

Overtollige voedingsstoffen worden opgeslagen in wit vetweefsel in de vorm van triglyceriden in de neutrale lipidekern van lipidedruppels. Triglyceridevoorraden worden gemobiliseerd via lipolyse, een proces waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst door vetweefseltriglyceridilase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL), wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren (FFA's) en de glycerol-ruggengraat 1,2. Lipolyse wordt geactiveerd door catecholaminesignalering in het vetweefsel. Sympathische zenuwuiteinden geven lokaal catecholaminen af, die binden aan β-adrenerge receptoren op het adipocytenplasmamembraan. Bij ligandbinding activeren deze G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) adenylylcyclase via Gαs. Daaropvolgende activering van proteïnekinase A (PKA) door cAMP resulteert in de upregulatie van zowel ATGL als HSL. De fosforylering van perilipine-1 door PKA veroorzaakt de dissociatie van ABHD5 (ook bekend als CGI-58), dat ATGL3 bindt en coactiveert. PKA fosforyleert HSL direct en bevordert de translocatie van het cytosol naar de lipidedruppel, waar interactie met gefosforyleerd perilipine-1 de lipase-activiteit verder bevordert 4,5,6,7. De derde lipase die betrokken is bij lipolyse, MGL, lijkt niet te worden gereguleerd door catecholaminesignalering8. Belangrijk is dat triglyceridensynthese in adipocyten wordt gemedieerd door de glycerollipidesyntheseroute, die niet de vorming van monoglyceriden als tussenproduct met zich meebrengt; in plaats daarvan katalyseren glycerol-3-fosfaat acyltransferasen de vorming van lysofosfatidinezuur, dat wordt gecombineerd met een ander vette acyl-CoA om fosfatidisch zuur te vormen en vervolgens wordt geïsomeriseerd tot diglyceriden vóór de uiteindelijke synthese van triglyceriden (figuur 1) 9,10,11.

Figure 1
Figuur 1: Lipolyse en glycerol lipide synthese routes. Top: Lipolytische route; enzymen in rood: vetweefsel triglyceride lipase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL). Onder: glycerol lipide synthese route; enzymen in het groen: diglyceride acyltransferase (DGAT), fosfatidinezuurfosfatase (PAP), lysofosfatidinezuuracyltransferase (LPAT, ook bekend als LPAATs) en glycerol-3-fosfaatacyltransferase (GPAT). Lipiden: triglyceride (TG), diglyceride (DG), monoglyceride (MG), vrij vetzuur (FFA), vette acyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinezuur (LPA) en fosfatidinezuur (PA). Andere metabolieten: anorganisch fosfaat (Pi) en glycerol 3-fosfaat (G3P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Extracellulaire adenosine is een andere belangrijke regulator van lipolyse, die werkt via G s- en Gi-gekoppelde GPCR's om de adenylcyclase-activiteit te beïnvloeden. De overheersende adenosinereceptor in adipocyten, ADORA1, remt adenylylcyclase en dus lipolyse door de activering van Gi12. Uitgedrukt op lagere niveaus, en voornamelijk in bruine adipocyten, activeert ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 beïnvloedt zowel basale lipolyse als de respons op adrenerge agonisten. Het effect van adenosine op lipolyse kan worden gecontroleerd door adenosinedeaminase toe te voegen om adenosine te neutraliseren, evenals de ADORA1-specifieke agonist fenylisopropyladenosine14,15. Hormonale activering van G q-gekoppelde GPCR's kan ook de lipolyse beïnvloeden via de activering van fosfolipase C en eiwitkinase C16,17,18,19. Ontstekingssignalen hebben ook invloed op de lipolytische snelheden. TLR4-activering door LPS (en andere endotoxinen) verhoogt de lipolytische snelheid door ERK te activeren, dat perilipine-1 en HSL20 fosforyleert. TNF-α activeert ook lipolyse via ERK- en NF-κB-activering, evenals transcriptionele downregulatie van het fosfodiësterase PDE-3B en CIDEC21,22,23. IL-6 is ook in verband gebracht met verhoogde adipocytenlipolyse, vooral in mesenterisch vetweefsel, waarvan de FFA-afgifte van invloed is op leversteatose en gluconeogenese24,25,26.

Lipolyse wordt onderdrukt tijdens de gevoede toestand door insuline. AKT fosforyleert en activeert PDE-3B om cAMP-signalering te onderdrukken en PKA-activering te voorkomen27. Insuline downreguleert ook transcriptioneel ATGL28. Obesitas bevordert catecholamineresistentie door middel van een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder de downregulatie van β-adrenerge receptoren in adipocyten 29,30,31,32,33. Adipocyten brengen alle drie de β-adrenerge receptoren tot expressie (β-1, β-2 en β-3). Terwijl β-1 en β-2 adrenerge receptoren alomtegenwoordig tot expressie komen, wordt de β-3 adrenerge receptor voornamelijk uitgedrukt in adipocyten in muizen34,35. Adrb3-expressie wordt geïnduceerd door C/EBPα tijdens adipogenesis36. De β-3 adrenerge receptor komt sterk tot expressie in volwassen adipocyten. De activering van β-1 en β-2 adrenerge receptoren is zelfbeperkend als gevolg van feedbackremming door β-arrestine37. Feedbackremming van de β-3 adrenerge receptor wordt gemedieerd door andere signaalroutes, die de Adrb3-expressie 33,38,39 verminderen.

Talrijke verbindingen kunnen worden gebruikt om adipocytenlipolyse te activeren. Catecholamines zijn belangrijke fysiologische activatoren van lipolyse. Noradrenaline (of noradrenaline) en epinefrine (of adrenaline) activeren alle drie de β-adrenerge receptoren40. Noradrenaline en epinefrine beïnvloeden ook lipolyse via activering van α-adrenerge receptorsignalering41. Veelgebruikte β-adrenerge receptoragonisten zijn isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, en de β-3 adrenerge receptoragonisten CL-316,243 en mirabegron42. Aangezien adipocyten voornamelijk de β-3 adrenerge receptor tot expressie brengen, gebruiken we hier CL-316,243 als voorbeeld. De specificiteit voor de β-3 adrenerge receptor maakt het ook een relatief specifieke activator van adipocyte catecholamine signalering, die ook veilig in vivo kan worden gebruikt. Merk op dat de veelgebruikte concentratie van 10 μM CL-316,243 in celcultuur ordes van grootte hoger is dan de ~ 0,1 μM dosis die nodig is om een maximale responste bereiken 33. Forskolin omzeilt de adrenerge receptor, direct activeren adenylyl cyclase en downstream lipolytische signalering. Er zijn veel meer activatoren, evenals onderdrukkers van lipolyse. Bij het selecteren van een verbinding om lipolyse te stimuleren, moeten de receptorspecificiteit en downstream signaalroutes zorgvuldig worden overwogen binnen het experimentele ontwerp.

De snelheid van lipolyse in wit vetweefsel is een belangrijke metabolische factor die van invloed is op de koudetolerantie en de beschikbaarheid van voedingsstoffen tijdens vasten of lichaamsbeweging43,44,45,46. Het doel van dit protocol is om de snelheid van lipolyse in adipocyten en vetweefsel te meten, wat het begrip van adipocytenmetabolisme zal vergemakkelijken en hoe dit het metabole fenotype van verschillende muizenmodellen kan beïnvloeden. Om de lipolytische snelheid te kwantificeren, meten we het uiterlijk van lipolytische producten in de media (d.w.z. FFA's en glycerol). De methode is gebaseerd op het vrijkomen van lipolytische producten uit de adipocyt in de media. Aangezien witte adipocyten lage niveaus van glycerolkinase tot expressie brengen, zijn de heropnamepercentages van glycerol laag47. Omgekeerd moet ook de productie van FFA's en glycerol door andere metabole routes dan lipolyse worden overwogen. Adipocyten lijken een fosfatase uit te drukken met activiteit tegen glycerol-3-fosfaat, waardoor de productie van glycerol uit glycerol-3-fosfaat afgeleid van glucose48,49,50 mogelijk is. Glycolyse is een bron van glycerol-3-fosfaat dat wordt gebruikt voor FFA-herverestering in witte adipocyten. Wanneer de glucosespiegels beperkt zijn, vereist glyceroneogenese andere 3-koolstofbronnen, zoals lactaat en pyruvaat51. De kanalisatie van FFA's die vrijkomen door lipolyse in de cel en hun metabolische lot is slecht begrepen; FFA's die vrijkomen door lipolyse moeten worden omgezet in vette acyl-CoA, voordat ze opnieuw worden veresterd of β-oxidatie ondergaan. Het lijkt erop dat FFA's die vrijkomen door lipolyse waarschijnlijk de cel verlaten voordat ze weer worden opgenomen en omgezet in vette acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA's kunnen buiten de cel worden gesekwestreerd door albumine. Belangrijk is dat van FFA's met een lange keten bekend is dat ze de lipolyse remmen als ze niet worden gesekwestreerd door albumine 63,64,65,66,67. Het optimaliseren van de FFA-buffercapaciteit van de media tijdens de lipolyse-assay is dus van cruciaal belang. De hier beschreven procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde methoden om de lipolytische snelheid in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen en mensen te meten 15,68,69,70,71. Dit protocol verschilt door het gebruik van seriële bemonstering; Door seriële bemonstering uit te voeren, kunnen we intern valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en meerdere metingen gebruiken om de snelheid van lipolyse te berekenen, waardoor de meetfout wordt verminderd om het vertrouwen in de uiteindelijke berekende waarde te vergroten. Het nadeel van seriële bemonstering is dat de test meer tijd en reagentia vereist; Het langere tijdsbestek vermindert echter de impact van meetfouten op de standaardfout van de schattingen van het tarief. Bovendien meet dit protocol zowel FFA als glycerolafgifte en beschouwt het de verhouding FFA: glycerolafgifte met als doel een 3: 1-verhouding te bereiken, zoals zou worden verwacht van volledige lipolyse en afgifte van lipolytische producten in de media72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik van alle dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het Weill Cornell Medical College van Cornell University.

1. Voorbereiding van buffers en opvangplaten

  1. Maak 5% runderserumalbumine (BSA) door 5 g BSA op te lossen in 100 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) zonder fenolrood. Roer de BSA voorzichtig om op te lossen (schudden werkt averechts). Zodra de BSA volledig is opgelost, filter-steriliseer de media met een 0,2 μm filter. Bewaar de BSA media bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Maak werkconcentraties van controle- en stimulatiemedia. Besturingsmedia: 5% BSA-media met voertuigbesturing. Stimulatiemedia: 5% BSA-media met 0,5 μM CL-316,243. Maak nieuwe stimulatiemedia voor elk experiment.
  3. Verwarm de te gebruiken media tot 37 °C. Label een plaat met 96 putten voor mediaverzameling.

2. Monstervoorbereiding

  1. Voer celkweek uit zoals hieronder beschreven. Voer alle celwerkzaamheden uit in een steriele zuurkast om besmetting van buitenaf te minimaliseren.
    1. Isoleer en differentieer primaire preadipocyten, zoals in73,74.
      1. Plaat primaire preadipocyten met een hoge dichtheid, zoals 1 x 105 cellen / put in een 24-well plaat in 1 ml / put kweekmedia (15% foetaal runderserum (FBS) en 1x penicilline-streptomycine-glutamine in DMEM / F12).
      2. Nadat de cellen 100% confluentie hebben bereikt, differentiëren met 5 μM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μg / ml insuline en 1 μM thiazolidinedion (TZD) in kweekmedia gedurende 3 dagen. Schakel vervolgens over op kweekmedia met 1 μg / ml insuline gedurende ten minste 3 dagen om lipidedruppels te laten groeien. Gebruik 1 ml/put media in de 24-well plaat.
      3. Vervang de kweekmedia (1 ml/put) met insuline om de 2 of 3 dagen. De cellen kunnen tot 2 weken in media met insuline worden gehouden. Gebruik alleen culturen waarin de differentiatiepercentages meer dan 90% zijn en vergelijkbaar zijn tussen groepen voor deze test, omdat verminderde differentiatie verkeerd kan worden geïnterpreteerd als een verlaging van de lipolytische snelheid.
      4. Kweek de cellen in insulinevrije media gedurende 24 uur voorafgaand aan het meten van lipolyse.
        OPMERKING: Insuline in de media onderhoudt lipidedruppels, maar remt ook lipolyse. Incubatie zonder insuline gedurende 24 uur zorgt voor volledige lipolytische activering zonder verlies van lipidedruppelvolume. In sommige systemen moet de kweektijd zonder insuline mogelijk worden verkort of verlengd.
    2. Was de cellen eenmaal met DPBS om het resterende serum uit de kweekmedia te verwijderen.
      OPMERKING: Dit protocol omvat geen serumuithongering, die lipolyse kan activeren. Serumhonger kan naar goeddunken van de onderzoeker worden gebruikt.
  2. Voer ex vivo cultuur uit zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid een plaat met 6 putten voor, met één put voor elk weefsel dat van elke muis moet worden verzameld. Plaats 4 ml DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put.
      OPMERKING: BSA in de verzamelmedia is niet nodig.
    2. Bereid een plaat met 48 putten voor de lipolysetest, met één put voor elke replicatie. Plaats 400 μL DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put. Gebruik twee tot vier controle- en twee tot vier gestimuleerde putjes per weefsel per muis.
    3. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder anesthesie, met een secundaire methode zoals bilaterale pneumothorax. Hier gebruikten we een 32 g, 7 maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, gevoed met een 45% vetrijk dieet gedurende 4 maanden.
      OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt voor mannen, evenals andere stammen, diëten en leeftijden.
    4. Spray met 70% ethanol en gebruik een schaar om een kleine (~ 1 cm) laterale incisie in het midden van de buikhuid te maken, trek de huid uit elkaar door aan weerszijden met duim en wijsvinger te knijpen en vouw de onderbuikhuid om om de achterste onderhuidse depots te onthullen. Lokaliseer en verwijder de inguinale lymfeklier en ontleed het inguinale vetweefsel onmiddellijk na de inguinale lymfeklier met een tang.
    5. Om het gonadale vetweefsel te verzamelen, maakt u een laterale en een verticale incisie in het peritoneum om toegang te krijgen tot de peritoneale holte. Houd het gonadale vetkussen vast met een pincet en snijd langs de baarmoeder (of bijbal voor mannen) om het gonadale vetweefsel te verwijderen. Plaats de verzamelde depots in een 6-well plaat.
    6. Verwijder het weefsel goed, leg het op een siliconenmat en snijd met een schaar in stukjes van 5 tot 7 mg.
    7. Weeg 25 tot 30 mg (vijf of zes brokken) voor elke test goed af en plaats in een 48-well assay-plaat. Dep de tissue op een schone handdoek voordat u weegt om eventuele media te verwijderen. Weeg het gewicht na verwijdering van het weefsel en noteer het gewicht van eventuele achtergebleven resten. Veeg de gewichtsboot schoon tussen de monsters en reparaer indien nodig. Gebruik een nieuwe gewichtsboot voor elk weefsel.
    8. Zodra alle weefselmonsters zijn gewogen, plaatst u de 48-well assay plate in een 37 °C, 10% CO 2-incubator gedurende 15 minuten.

3. Lipolyse-test

  1. Mediaverzameling uitvoeren. Voer de overdracht van de media en de daaropvolgende monsterverzameling uit in een steriele zuurkast om mogelijke verontreiniging door externe bronnen te minimaliseren.
    1. Bij t = 0 verwijdert u de media en voegt u 400 μL per put controle- of stimulatiemedia toe en plaatst u de plaat in een 37 °C, 10% CO 2-incubator. Voor ex vivo weefselkweek, verwijder media voorzichtig met behulp van een pipet; zuigkracht mag nooit worden gebruikt.
      OPMERKING: U kunt ook een tweede plaat met controle- en stimulatiemedia voorbereiden en de weefsels overbrengen.
    2. Verzamel bij t = 1, 2, 3 en 4 uur 200 μL media, vervang door 200 μL van de juiste controle- of stimulatiemedia en breng de testplaat terug naar de incubator. Bewaar de opvangplaat bij 4 °C. Om de FFA-buffercapaciteit van de BSA-media te bepalen, gebruikt u een extra verzameling na 24 uur.
      OPMERKING: De experimenten kunnen hier worden gestopt en de verzamelde media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

4. FFA colorimetrische assay

  1. Verwarm de reagentia tot kamertemperatuur en los één fles kleurreagens A op met één fles oplosmiddel A en één fles kleurreagens B met één fles oplosmiddel B. Vanaf de datum van reconstitutie kunnen deze reagentia het beste binnen 1 week worden gebruikt. 1 maand na reconstitutie weggooien.
  2. Ontdooi en meng de monsters.
  3. Maak een FFA-standaardcurve. De standaardoplossing is 1 mM. Gebruik het volgende volume met de reagentia voor de standaardcurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 verdunning), 10 μL (1:4 verdunning), 10 μL (1:8 verdunning) en 10 μL water voor maximaal bereik. Voor lage FFA-niveaus kan de standaard 10 μL van 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0,05 mM meer van toepassing zijn.
  4. Pipetstandaarden en monsters in een 96-well assayplaat. Het aanbevolen monstervolume is 10 μL. Neem drie putjes op met hetzelfde volume BSA-media als de monsters voor achtergrondcorrectie.
    OPMERKING: Als de monsterconcentraties buiten het bereik van de standaardcurve vallen, herhaalt u de test en stelt u het monstervolume in op 2-25 μl.
  5. Voeg 150 μL reagens A toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Lees de absorptie van de plaat af bij 550 nm en 660 nm referentie (aflezing A).
  7. Voeg 75 μL reagens B toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  8. Lees de absorptie van de plaat opnieuw af bij 550 nm en 660 nm referentie (Reading B).

5. Glycerol colorimetrische assay

  1. Reconstitueer het vrije glycerolreagens met 36 ml ultrapuur water en acclimatiseer aan kamertemperatuur. Deze reagentia kunnen het beste binnen enkele weken worden gebruikt. 2 maanden na reconstitutie weggooien.
  2. Ontdooi en meng de monsters.
  3. Maak een glycerolstandaardcurve door een zevenpunts, 2-voudige seriële verdunning van de glycerolstandaardoplossing en een waterblanco te maken.
    OPMERKING: De standaardcurve is relatief lineair tot 25 μL van 2,8 mM glycerol, maar niet lineair bij hogere concentraties.
  4. Pipetteer 25 μL elk van de standaard en monsters in de 96-well assay plaat. Voeg drie putten toe aan de BSA-media voor achtergrondcorrectie.
  5. Voeg 175 μL vrij glycerolreagens toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Lees de absorptie van de plaat bij 540 nm.

6. Berekening van de lipolytische snelheid

  1. Begin met optische dichtheidswaarden (OD). Gebruik voor glycerol direct A540 OD-waarden. Bereken de OD van de FFA-test volgens de volgende formule:
    OD = (Lezing B: A 550 - A 660) - (Lezing A: A550 - A 660)
  2. Gebruik de standaardcurve om de FFA- en glycerolniveaus in de verzamelde monsters te berekenen. Zet de standaard OD-waarden uit op de y-as en gebruik op de x-as standaardconcentraties ten opzichte van het monstervolume (d.w.z. de concentratie van de putten met 20 μL van 1 mM FFA-standaard op een plaat met 10 μL-monsters is gelijk aan 2 mM). Pas een lineaire trendlijn aan:
    y = mx + b
  3. Inspecteer de standaardcurve visueel en verwijder alle punten buiten het lineaire bereik van de test. Bereken de monsterconcentraties met behulp van de vergelijking:
    Monsterconcentratie: x = (OD - b) ÷ m
  4. Pas monsters aan en test deze opnieuw die buiten het lineaire testbereik vallen. Om de uiteindelijke monsterconcentratie te verkrijgen, trekt u de concentratie van de achtergrondputten die alleen BSA-media bevatten af van de concentratie van de monsters.
  5. Bereken de mol FFA en glycerol geproduceerd door elk monster op elk tijdstip, volgens de formule:
    Equation 1
    waarbij C n = concentratie op tijdstip t = n; Vt = totaal volume in de put; Vs = volume van de monsterneming; en M n = mol geproduceerd op tijdstip t = n (wanneer de concentraties in mM zijn en de volumes in ml zijn, is de output μMol).
    Voorbeelden, op verschillende tijdstippen:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    of
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normaliseer tot weefselgewicht door het weefselgewicht voor elk monster in grammen te delen om eenheden μmol/g te verkrijgen. Voor gekweekte cellen worden waarden gepresenteerd als μmol/well. Zorg ervoor dat het celaantal en de differentiatie-efficiëntie vergelijkbaar zijn van goed tot goed.
    OPMERKING: Verschillen in proliferatie- of differentiatie-efficiëntie zullen de interpretatie van resultaten bemoeilijken en een andere methode van normalisatie vereisen (bijv. Normalisatie naar eiwit; zie discussie).
  7. Bereken de helling van de geproduceerde μmol/g (y-as) versus tijd (x-as) voor elk monster afzonderlijk.
    1. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =SLOPE(known_ys,known_xs). Typ in een nieuwe cel "=SLOPE" (gebruik vervolgens de cursor om de glycerol- of FFA-waarden van het monster in μmol/g te markeren en vervolgens de bijbehorende tijdwaarden te markeren).
    2. Controleer de lineariteit van de gegevens. R2-waarden zijn een snelle manier om de lineariteit van de monsters te bepalen. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =RSQ(known_ys,known_xs), op dezelfde manier als beschreven in stap 6.7.1, maar de initiële invoer is =RSQ. Zorg ervoor dat de R2-waarden > 0,98 zijn; lagere waarden duiden op afwijking van de lineariteit. Dit kan het gevolg zijn van een meet-/bemonsteringsfout of verlies van lineariteit.
      1. Een andere manier om de lineariteit te testen, is door voor elk monster een lineaire regressie uit te voeren en de residuen uit te zetten. Genereer in statistische analysesoftware een XY-tabel met één Y-waarde voor elk tijdstip. Selecteer Analyseren > Eenvoudige lineaire regressie en selecteer het vakje voor Residuele plot voordat u op OK drukt. De resterende grafiek wordt weergegeven als een nieuwe grafiek.
  8. Gebruik de FFA- en glycerolproductiesnelheid (d.w.z. helling [(μmol/g/h]) voor elk monster als een individueel gegevenspunt om statistische analyse uit te voeren en waarden uit te zetten als verschillende lipolytische omstandigheden worden vergeleken. Als lipolytische snelheden worden vergeleken tussen genotypen, gebruik dan twee of drie monsters per dier als technische replicaties en gebruik het gemiddelde voor één gegevenspunt per dier, zodat de steekproefgrootte gelijk is aan het aantal dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We maten de basale en gestimuleerde lipolytische snelheid van in vitro gedifferentieerde adipocyten. Primaire preadipocyten uit inguinaal wit vetweefsel werden gedifferentieerd in adipocyten door de behandeling van confluente cellen met 5 μM dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insuline en 1 μM troglitazon gedurende 4 dagen, gevolgd door een aanvullende behandeling van 3 dagen met 1 μg/ml insuline. Cellen werden geïncubeerd in media zonder insuline gedurende 24 uur voorafgaand aan de lipolysetest. Op het moment = 0h werden de cellen eenmaal gewassen met PBS, waarna fenolroodvrije DMEM met 2% BSA, met 10 μM CL-316.243 of voertuigcontrole, werd toegevoegd aan elke put van de 12-putplaat. Op tijd = 1 h, 2 h, 3 h en 4 h werd 50% van de media verzameld en vervangen door 2% BSA in fenolroodvrije DMEM. FFA- en glycerolspiegels werden gemeten in de verzamelde media en de moedervlekken van FFA, en glycerol uitgescheiden in media werd berekend op elk tijdstip (figuur 2A, B). FFA en glycerolproductie waren lineair voor de 4-uurstest, met R2-waarden van 0,98 en hoger. De FFA-niveaus van 4 uur waren enigszins laag, wat aangeeft dat de lipolytische snelheden mogelijk zijn vertraagd; Analyse met en zonder het 4-uurstijdstip had echter geen significante invloed op de berekende lipolytische snelheid. Gestimuleerde lipolytische snelheden waren significant hoger dan basale snelheden (figuur 2C). Lipolytische stimulatie resulteerde in de productie van FFA en glycerol met een molaire verhouding van bijna 3:1 in alle verzamelde monsters, zoals te verwachten zou zijn van volledige triglyceridenlipolyse zonder significante heropname of retentie (figuur 2D). In de niet-gestimuleerde cellen lag de verhouding echter dichter bij 1, wat wijst op een niet-lipolytische bron van glycerol48,49,50.

Figure 2
Figuur 2: Lipolytische snelheid in in vitro gedifferentieerde primaire adipocyten. Preadipocyten werden gedifferentieerd in een plaat met 12 putten. Insuline werd 24 uur voorafgaand aan de lipolytische test uit de media verwijderd. Op tijdstip = 0 h werden de cellen gestimuleerd met 10 μM CL-316,243 (CL) of behandeld met vehikel (V) controlemedia. De nmol van (A) FFA en (B) glycerol geproduceerd in elke put per tijdspunt werden in de loop van de tijd uitgezet en een lineaire regressielijn werd aangebracht voor elke individuele put. (C) Productiesnelheid van de FFA. (D) Snelheid van glycerolproductie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (E) Molaire verhouding van FFA: glycerol in de verzamelde media op elk tijdstip. Statistische analyse in (C) en (D) werd uitgevoerd met behulp van de t-test van een student; het effect van CL was significant bij α = 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In celkweek staat de monolaag van cellen in direct contact met de media, terwijl in weefsels die ex vivo worden gekweekt, cellen in het midden niet in contact staan met de media. In ex vivo culturen is de kans dus groter dat FFA's in het weefsel worden vastgehouden. Grotere brokken weefsel, die een lagere oppervlakte-volumeverhouding hebben, vertonen hogere percentages FFA-retentie, wat resulteert in lagere FFA: glycerol molaire verhoudingen (figuur 3A). Met afnemende weefselbrokgrootte nadert de molaire verhouding van FFA: glycerol die vrijkomt 3: 1 (figuur 3A). Weefselbrokken kunnen echter ook te klein zijn. Naast de uitdaging van het werken met kleine stukjes vetweefsel, vertonen 1-2 mg brokken vetweefsel verminderde lipolytische snelheden, wat wijst op een verminderde levensvatbaarheid en functionaliteit van het weefsel (figuur 3B, C). Hoewel het vervelend en tijdrovend is om vetweefsel in brokken van consistente grootte en vorm te snijden, is het vereist om vergelijkbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen. We raden 5 tot 10 mg brokken vetweefsel aan, maar consistentie is het belangrijkst. Lipolytische snelheden kunnen nog steeds reproduceerbaar worden gemeten in grotere weefselbrokken, maar het is belangrijk om rekening te houden met de feedbackremming van lipolyse door FFA's 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figuur 3: Effect van weefselbrokgrootte op FFA-afgifte en lipolytische snelheid. Gonadale witte vetweefsel van een vetrijk dieet gevoed vrouwelijke C57Bl / 6J muis werd verzameld en gesneden in brokken van verschillende grootte. Alle putten bevatten in totaal 25-30 mg vetweefsel; Voor de putjes van 25 mg was dit één stuk weefsel; 10 mg putjes hadden drie brokken weefsel van elk ~ 10 mg, de 5 mg putjes bevatten vijf of zes brokken weefsel en de 2 mg putjes bevatten 13-16 brokken. Op tijdstip = 0 h werd lipolyse gestimuleerd met 0,5 μM CL-316,243 (CL), of werden de controleputten behandeld met vehikel (V). De berekende lipolytische snelheid van monsters verzameld na 1 h, 2 h en 3 h wordt uitgezet voor (A) FFA's en (B) glycerol. (C) Molaire verhouding van FFA:glycerol productie in elke put. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse in (A) en (B) werd uitgevoerd met behulp van een tweerichtings-ANOVA met een Holm-Sidak post-hoc analyse, α = 0,05. Het effect van CL was significant in alle monsters. Binnen de met CL behandelde monsters waren de snelheden van FFA- en glycerolproductie significant verschillend in alle paarsgewijze vergelijkingen, behalve de 10 mg versus 5 mg monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De negatieve impact van FFA-retentie kan worden waargenomen in de 25 mg weefselbrokken, die lagere snelheden van zowel FFA als glycerolproductie vertonen bij stimulatie (figuur 3B, C). Deze feedbackremming is ook duidelijk wanneer de FFA-bindingscapaciteit van de media te laag is (d.w.z. er is niet genoeg BSA in de media). Toen de BSA in de media werd verlaagd tot 0,5%, werd de FFA-afgifte meer dan verviervoudigd en de glycerolafgifte bijna tweevoudig (figuur 4A, B). Als een eenvoudige vuistregel mogen micromolaire niveaus van FFA in de media het percentage BSA in de media niet benaderen (d.w.z. FFA-niveaus moeten onder 5 mM FFA blijven in 5% BSA-media en 0,5 mM in 0,5% BSA-media [op dit niveau is er een 20: 3 molaire verhouding van FFA: BSA]). Om de maximale BSA-buffercapaciteit van de bereiding van BSA-media te testen, verzamelt u media uit een 24-uurs gestimuleerd monster en meet u de concentratie FFA (de concentratie zal hoog zijn, dus een lager monstervolume of monsterverdunning wordt aanbevolen). De FFA-accumulatie in de 5% BSA-media na 24 uur stimulatie was ongeveer 5 mM, terwijl het FFA-gehalte van de 0,5% BSA-media slechts 0,6 mM was (figuur 4C). Kijkend naar de FFA-concentratie in de verzamelde media, is te zien dat de 0,5% BSA media FFA-bindingscapaciteit overbelast is (figuur 4D). Hoewel de FFA-niveaus in de 5% BSA-media veel hoger zijn, overschrijden ze de buffercapaciteit van de media niet (figuur 4D). Idealiter zou de FFA-concentratie in de media onder een 3:1 FFA:BSA molaire verhouding moeten blijven (d.w.z. 2,3 mM FFA in 5% [0,75 mM] BSA).

Figure 4
Figuur 4: Onvoldoende BSA-waarden resulteren in verminderde schijnbare lipolytische snelheden. Gonadale witte vetweefsel van een vetrijk dieet gevoed vrouwelijke C57Bl / 6J muis werd verzameld en gesneden in ~ 5 mg brokken. In totaal werd 20-30 mg vetweefsel in elke put geplaatst. Op tijd = 0 h werd de lipolyse gestimuleerd met 0,5 μM CL-316.243 (CL), of de controleputten werden behandeld met een vehikel (V) in 5% BSA-media of media met slechts 0,5% BSA. De berekende lipolytische snelheid van de monsters die na 4 uur zijn verzameld, wordt uitgezet voor (A) FFA's en (B) glycerol. Het effect van CL was significant in alle monsters. Binnen de CL-behandelde monsters waren de snelheden van zowel FFA- als glycerolproductie significant verschillend tussen de 5% en 0,5% BSA-mediaomstandigheden. (C) FFA-niveaus in de media uit de gestimuleerde putten na 24 uur. (D) FFA-niveaus in de monsters verzameld na 4 h. (E) FFA-standaardcurven met en zonder verschillende preparaten van 5% BSA in DMEM. Optische dichtheid berekend als (Reading B: A 550 - A 660) - (Reading A: A550 - A660). (F) Glycerol standaardcurve met en zonder BSA. De optische dichtheid is absorberend bij 540 nm (A540). OD-waarden bij 5,6 mM waren niet lineair en dus niet opgenomen in de standaardcurve. (G) Snelheid van FFA-afgifte uit vrouwelijk gonataal vetweefsel met behulp van verschillende soorten BSA in de testmedia. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse in (A) en (B) werd uitgevoerd met behulp van een tweerichtings-ANOVA met een Holm-Sidak post hoc analyse, * p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is belangrijk om erop te wijzen dat sommige preparaten van BSA FFA's bevatten. Elke partij BSA moet worden getest om ervoor te zorgen dat het FFA-gehalte verwaarloosbaar is (merk op dat sommige BSA-preparaten als FFA-vrij op de markt worden gebracht). Hoewel niet specifiek op de markt gebracht als FFA-vrij, bevat de BSA die hier wordt gebruikt geen detecteerbare FFA's. We hebben de testmedia getest die FFA-vrij BSA bevatten (Equitech Bio Inc, BAH66), de BSA die hier in experimenten wordt gebruikt (Sigma, A9418) en een ruwere (goedkopere) fractie V BSA (Sigma, 810531). De FFA-vrije BSA en A9418 BSA produceerden beide geen achtergrondsignaal of veranderden de standaard bochthelling of onderschepping; de standaardcurven waren superponeerbaar (figuur 4E). Ook op de glycerolstandaardcurve werd geen impact van de BSA DMEM waargenomen (figuur 4F). De fractie V BSA daarentegen produceerde wel een achtergrondsignaal in de FFA-test, wat neerkwam op een FFA-concentratie van 0,3 mM (figuur 4E). Deze achtergrond verschoof de standaardcurve naar boven, maar had geen significante invloed op de helling, wat aangeeft dat achtergrondaftrek voldoende is. We voerden ook een gestimuleerd lipolyse-experiment uit met behulp van deze drie verschillende soorten BSA en ontdekten dat na aftrekken op de achtergrond de berekende snelheid van lipolyse niet verschilde tussen BSA-formuleringen (figuur 4F). Dit is echter vaak niet het geval, vooral bij minder zuivere BSA-preparaten die gemakkelijk insuline of andere componenten kunnen bevatten die de snelheid van lipolyse beïnvloeden. Elke partij BSA moet worden getest en gevalideerd en consistent worden gebruikt (d.w.z. monsters die zijn getest met verschillende partijen BSA zijn niet vergelijkbaar). Een volledige standaardcurve met de toevoeging van BSA en DMEM moet worden uitgevoerd bij het valideren van elke partij BSA om ervoor te zorgen dat deze niets bevat dat interfereert met de enzymen in de colorimetrische testen.

Het nemen van seriële monsters en het vervangen van het volume door nieuwe media helpt om de FFA-belasting in de media tijdens het experiment te verlagen. We maten lipolytische snelheden in het gonadale vetweefsel van een vrouwelijke muis die gedurende 4 maanden een vetrijk dieet kreeg. In dit experiment werden 5-8 mg weefselbrokken (totaal gewicht van 25-30 mg) geïncubeerd in 200 μL van 5% BSA-media en werd 100 μL verzameld en vervangen na 1 uur, 2 uur, 3 uur en 4 uur. Om 3 uur hadden de FFA-niveaus in de media de gevarenzone van 2,3 mM bereikt (figuur 5A). Feedbackremming van lipolyse werd gesuggereerd door het ontbreken van toename van media FFA- en glycerolspiegels na 4 uur (figuur 5A,B). Na het berekenen van de μmol van FFA en glycerol die op elk tijdstip vrijkomt en een lineaire curve past, is het duidelijk dat de lipolytische snelheid na 4 uur begint te dalen in de gestimuleerde monsters, met R2-waarden zo laag als 0,976 voor FFA en 0,983 voor glycerol (figuur 5C, D). Kijkend naar het restperceel is het duidelijk dat de 4 uur-waarden onder de lineaire trend liggen (d.w.z. de residuen zijn negatief) (figuur 5E,F). Uitsluiting van het 4-uurstijdstip verhoogde de R2-waarden tot 0,997 en 0,998 en hoger voor respectievelijk FFA en glycerol. Opname van het 4-uurstijdstip veroorzaakt een kleine maar significante afname van de berekende FFA- en glycerolafgiftesnelheden (figuur 5G,H).

Figure 5
Figuur 5: Berekening van de lineaire lipolytische snelheid in ex vivo vetweefsel. Gonadale witte vetweefsel van een vetrijk dieet gevoed vrouwelijke C57Bl / 6J muis werd verzameld en gesneden in ~ 5 mg brokken. In totaal werd 20-30 mg vetweefsel in elke put geplaatst. Op tijdstip = 0 h werd de lipolyse gestimuleerd met 0,5 μM CL-316.243 (CL), of werden de controleputten behandeld met vehikel (V). Mediacollecties werden uitgevoerd op 1 h, 2 h, 3 h en 4 h. (A) FFA en (B) glycerol niveaus in de media. (C) FFA en (D) glycerolproductie uitgezet in de tijd. Restplaten voor (E) FFA en (F) glycerol productie in de loop van de tijd. Afgiftesnelheid van (G) FFA en (H) glycerol, berekend met en zonder het tijdstip van 4 uur. (I) FFA-afgifte in vrouwelijk gonataal vetweefsel. Bijna 50% van de media veranderde na 1 uur, 2 uur en 3 uur. Tussen de uren door verzamelden de 15 minuten tijdpunten 2,75% van de media zonder vervanging. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse in (G) en (H) werd uitgevoerd met behulp van een tweerichtings-ANOVA met een Holm-Sidak post-hoc analyse, * p-waarde < 0,05. Het effect van CL was significant in alle monsters (p-waarde < 0,05). Binnen de met CL behandelde monsters waren de snelheden van zowel FFA- als glycerolproductie significant verschillend tussen berekeningen met en zonder het 4-uurstijdpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In tegenstelling tot eerdere protocollen maakt dit protocol gebruik van meerdere tijdstippen om de lipolytische snelheid te bepalen, waardoor meetfouten worden verminderd en interne validatie wordt geboden dat de lineaire snelheid van lipolyse wordt gemeten. Om de lipolyse in de lineaire fase op elk verzamelpunt te behouden, wordt 50% van de media verzameld en vervangen. Omdat lineariteit van cruciaal belang is, wilden we ervoor zorgen dat de toevoeging van verse media bij elke toevoeging geen uitbarsting van lipolyse veroorzaakte. Om de lineariteit tussen tijdpunten te valideren, namen we elke 15 minuten een zeer kleine steekproef (2,75%) tussen de uurtijdpunten van 1 uur tot 3 uur, zonder vervanging. Na 1 uur, 2 uur en 3 uur werd de normale 50% monsterverzameling gemaakt en vervangen. De snelheid van FFA-afgifte was lineair tussen de gebruikelijke tijdspunten, wat aangeeft dat er geen uitbarsting van lipolyse was bij elke toevoeging van verse media (figuur 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier bieden we een basisprotocol voor het meten van de snelheid van lipolyse in adipocyten en ex vivo vetweefsel. Om lipolyse te kwantificeren, is het belangrijk om de lipolytische snelheid in de lineaire fase te meten. We maken gebruik van een seriële bemonsteringstechniek, waarbij een groot deel van de media wordt verzameld en op regelmatige tijdstippen wordt vervangen door verse media. Deze semiconservatieve methode maakt de toevoeging van verse BSA met FFA-buffercapaciteit mogelijk en vertraagt feedbackremming, waardoor de duur van lineaire lipolyse wordt verlengd. Dit experimentele ontwerp probeert de vascularisatie van vetweefsel in vivo samen te vatten, die verse albumine levert om vrijgegeven FFA's75 te binden. Dit protocol werd geoptimaliseerd om lipolyse te meten in murine ex vivo wit vetweefsel en inguinaal vetweefsel primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro. Het protocol kan waarschijnlijk worden geoptimaliseerd om goed te werken in bruine en beige vetdepots, evenals vetweefsel van andere organismen en vereeuwigde cellijnen met een hoog adipogene potentieel. Het protocol zorgt voor flexibiliteit in de leeftijd, het geslacht en het dieet van de muizen voorafgaand aan het verzamelen van vetweefsel voor ex vivo assays. Sommige manipulaties, zoals vasten, kunnen de basale lipolytische snelheid beïnvloeden, terwijl andere interventies zoals door voeding geïnduceerde obesitas ook van invloed zijn op de snelheid van gestimuleerde lipolyse.

Het protocol moet worden geoptimaliseerd voor elk experimenteel systeem, afhankelijk van of de lipolytische snelheden hoger of lager zijn. Om de lineariteit te valideren, raden we aan om de R2-waarden te berekenen en naar de restgrafiek te kijken. De R2-waarden moeten zeer dicht bij 1 liggen. Bij het evalueren van het restperceel moet men uitkijken naar negatieve restwaarden op latere tijdstippen, omdat deze aangeven dat de lipolytische snelheden afnemen en de lineariteit verloren gaat. Voorbeelden van dergelijke resterende waarnemingspunten zijn weergegeven in figuur 5E,F. Het elimineren van de 4-uurstijdpunten in dit geval biedt een nauwkeurigere berekening van de lineaire lipolytische snelheid en verbetert de R2-waarden. Omdat de snelheid echter wordt berekend op basis van meerdere tijdstippen, is deze relatief robuust en heeft het opnemen van een dergelijk tijdstip slechts een kleine invloed op de R2-waarden en de berekende lipolysesnelheid. Als een enkel tijdstip wordt gebruikt om de lipolytische snelheid te berekenen, kunnen de gegevens gemakkelijker worden vertekend.

De manier waarop de gegevens worden genormaliseerd, kan ook van invloed zijn op de relatieve resultaten tussen steekproeven. Hier raden we aan om het ex vivo weefsel te normaliseren tot het weefselgewicht en de primaire preadipocyten in vitro per put te differentiëren. Deze normalisatietechnieken zijn echter mogelijk niet geschikt voor alle experimentele systemen. Belangrijk is dat als de proliferatiesnelheid of differentiatie-efficiëntie verschilt tussen groepen, normalisatie per put niet geschikt is. Alternatieve normalisatietechnieken omvatten eiwitten, lipiden en DNA. Elke methode van normalisatie heeft zijn voor- en nadelen. Weefselgewicht en bronnormalisatie is eenvoudig en duidelijk. Verschillen in adipocytengrootte kunnen betekenen dat mager vetweefsel veel meer adipocyten per gram bevat dan zwaarlijvig vetweefsel, terwijl verschillen in differentiatie-efficiëntie kunnen resulteren in verschillen in het aantal adipocyten per put. Lipiden kunnen worden geëxtraheerd met organische oplosmiddelen (bijv. 2:1 chloroform:methanol [v/v]) en triglyceridengehalte gemeten met een colorimetrisch reagens. Hoewel normalisatie naar lipidegehalte geen traditioneel gebruikte methode is, zijn de lipidedruppels immers het organel dat lipolyse ondergaat, en deze normalisatiemethode is specifiek voor adipocyten, wat nuttig kan zijn wanneer differentiatiesnelheden verschillen tussen cellen. Na lipidenextractie kan 0,1-0,3 N NaOH worden gebruikt om eiwit te extraheren, dat vervolgens kan worden getest door Bradford- of BCA-eiwittest68. Als alternatief kunnen de monsters worden gehomogeniseerd in lysisbuffer en kan de lipidefractie worden verwijderd door centrifugatie70. Merk op dat lipidebesmetting de eiwittests zal verstoren. Als eiwit moet worden gebruikt voor normalisatie, moeten de cellen uitgebreid (ten minste drie keer) worden gewassen om BSA uit de testmedia te verwijderen. Soms hechten gedifferentieerde adipocyten niet goed aan de plaat en verdragen ze niet de drie wasbeurten die nodig zijn om overtollig BSA te verwijderen. Normalisatie naar DNA maakt normalisatie naar celnummer mogelijk en kan worden uitgevoerd met een commerciële DNA-extractiekit, gevolgd door de kwantificering van het totale DNA door absorptie of real-time PCR-analyse van het aantal genkopieën. Als alternatief kan in vergulde cellen DAPI-kleuring gevolgd door beeldvorming worden gebruikt om kernen te tellen en te normaliseren tot celnummer. Bij het normaliseren met behulp van celnummer of eiwit, is het belangrijk om niet-adipocytcellen in het monster te overwegen. Vetweefsel bevat ook immuun- en endotheelcellen; In zwaarlijvig vetweefsel kunnen ontsteking en hypertrofie resulteren in slechts 1 op de 10 kernen afkomstig van volwassen adipocyten. Adipocyten dragen echter nog steeds bij aan het grootste deel van de massa en het lipidengehalte van het weefsel. Voor in vitro gedifferentieerde preadipocyten heeft de differentiatie-efficiëntie invloed op het relatieve percentage rijpe adipocyten; Wanneer dit het geval is, is normalisatie ingewikkeld. Idealiter zou de differentiatie-efficiëntie moeten worden geoptimaliseerd voordat de cellen worden gebruikt voor een lipolyse-assay. Indien dit niet mogelijk is, wordt normalisatie naar lipidegehalte aanbevolen als het lipidedruppelvolume vergelijkbaar is tussen gedifferentieerde adipocyten. Vergelijking van lipolytische snelheden tussen adipocytenculturen met ongelijke differentiatie kan leiden tot onjuiste conclusies over lipolyse wanneer de drijvende factor eigenlijk adipogenesis is; Dit is een beperking van het protocol.

Lange keten FFA's feedback-remmen lipolyse 63,64,65,66,67. FFA's stapelen zich op wanneer ze niet voldoende in de media worden gesekwestreerd. Veel van de probleemoplossing in verband met het optimaliseren van de meting van lipolyse is gerelateerd aan het minimaliseren van FFA-retentie. Het berekenen van de molaire verhouding van FFA: glycerolafgifte in de media helpt bij het identificeren van problemen met betrekking tot FFA-retentie. Als de molaire verhouding 3: 1 is voor FFA: glycerol, dan worden alle producten van lipolyse vrijgegeven en vastgelegd in de media, terwijl een verhouding onder 2: 1 reden tot bezorgdheid is. Een belangrijke overweging voor ex vivo assays is de grootte van het vetweefselstuk. Grotere stukken weefsel hebben een lagere oppervlakte-volumeverhouding en hebben dus meer kans om FFA's te behouden en vertonen als gevolg daarvan verminderde lipolytische snelheden (figuur 4A, B). Met dit in gedachten is het van cruciaal belang om het vetweefsel voor elk monster in brokken van een consistente grootte en vorm te snijden. Om FFA-sekwestratie in de media te vergemakkelijken, is het ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de media voldoende BSA bevatten om de vrijgegeven FFA te binden. De FFA-buffercapaciteit van de media kan worden verhoogd door de concentratie van BSA te verhogen of het volume van media te vergroten. Het is even effectief om het inzamelvolume of de frequentie te verhogen. Als men hoge lipolytische snelheden waarneemt, maar FFA: glycerolverhoudingen lager zijn dan 2: 1, raden we aan de verzamelfrequentie te verhogen tot elke 30 minuten en de test te stoppen bij 2,5 uur.

Het hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd voor muis ex vivo wit vetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro, die beide zeer lipolytisch zijn. De test moet worden geoptimaliseerd om lipolyse in andere systemen te meten, of als verschillen in de relatief lage basale snelheid van lipolyse van bijzonder belang zijn. 3T3-L1 adipocyten hebben bijvoorbeeld een lagere lipolytische activiteit32. Wanneer de lipolytische snelheid laag is, moet het incubatievolume worden verlaagd (d.w.z. in plaats van 400 μL per put in een 24-wellplaat, moet 200 μL in een 24-wellsplaat worden gebruikt, of 300 μL in een 12-wellsplaat en 100-150 μL verzameld per tijdstip. Het verzamelvolume mag niet onder de 100 μl dalen, omdat grotere monstervolumes nodig zijn om lage FFA- en glycerolniveaus nauwkeurig te meten. Om glycerol te testen met 50 μL media per monster, moet het vrije glycerolreagens worden opgelost in 31 ml water en 150 μL reagens worden gebruikt met 50 μL monster in elk putje. FFA-niveaus kunnen worden gemeten met 25 μL monster per put, misschien meer, zolang de lineariteit wordt gehandhaafd. Tijdpunten kunnen ook worden verlengd om het signaal te verhogen. Bij het testen van lipolytische snelheden uit andere cellen dan witte adipocyten, moet rekening worden gehouden met verschillen in cellulair metabolisme. Bruine en beige adipocyten brengen bijvoorbeeld veel hogere niveaus van glycerolkinase tot expressie en kunnen dus de glycerolafgifte behouden door lipolyse76,77. Deze metabolisch actieve cellen kunnen ook in staat zijn om vrijgegeven vetzuren in katabole of synthetische routes te kanaliseren zonder vrij te komen in de media. Het metabole lot van de FFA en glycerol in het specifieke celtype dat wordt getest, moet worden overwogen bij het interpreteren van de resultaten van een lipolyse-assay, vooral in een ander celtype dan witte adipocyten. Lipolyse-assays in andere celtypen moeten worden geoptimaliseerd en gevalideerd.

Dit protocol is ontworpen om verschillen in lipolytische snelheid in muismodellen te evalueren. Primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro zijn een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van celautonome effecten van genetische manipulaties of farmacologische behandelingen in adipocyten. Vetweefsel daarentegen bevat andere celtypen, waaronder immuuncellen. De impact van vetweefselimmuuncellen bij het reguleren van lipolyse is belangrijk om te overwegen bij het beoordelen van lipolyse van het hele weefsel. Gekweekte adipocytenlipolysemodellen kunnen de potentiële complicerende invloed van immuuncellen omzeilen en het grondige onderzoek van de specifieke celtypen mogelijk maken, terwijl vetweefselexplantaten een robuustere vergelijking met de in vivo omgeving mogelijk maken. Bovendien kan de ex vivo assay worden gebruikt om lipolytische snelheden in verschillende vetdepots te onderzoeken. In deze systemen wordt lipolyse gestimuleerd door verbindingen zoals β-adrenerge receptoragonisten, dus eventuele veranderingen in sympathische tonus die van invloed kunnen zijn op het in vivo muismodel zullen niet worden waargenomen. In vivo meting van lipolyse wordt bemoeilijkt door de dynamiek van FFA en glycerolafgifte en -opname in verschillende weefsels door het hele lichaam. Serum-FFA- en glycerolspiegels op een bepaald tijdstip zijn de balans tussen secretie en opname, en er mag niet worden aangenomen dat veranderingen in serum-FFA- en glycerolspiegels uitsluitend toe te schrijven zijn aan lipolyse van vetweefsel. Nuchtere geïnduceerde lipolyse wordt beïnvloed door sympathische tonus, maar produceert geen snelle en robuuste veranderingen in serum-FFA- of glycerolspiegels, waardoor het moeilijk is om veranderingen in nuchtere serumspiegels van FFA en glycerol te interpreteren. In vivo lipolyse kan worden gestimuleerd met behulp van een β-3 adrenerge receptoragonist, zoals CL-316,243, en verhoogde serum FFA en glycerol zijn detecteerbaar binnen 20 minuten na stimulatie. In vivo lipolytische assays moeten zowel nulmetingen van serum-FFA en glycerol omvatten, als een voertuigcontrole; op deze manier kan de stimulatiespecifieke verandering in serum-, FFA- en glycerolspiegels worden bepaald.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidie R01DK126944 aan SMR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 193
Het meten van de snelheid van lipolyse in <em>ex vivo</em> muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter