Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.
Adipocyten slaan energie op in de vorm van triglyceriden in lipidedruppeltjes. Deze energie kan worden gemobiliseerd via lipolyse, waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst van de glycerol-ruggengraat, wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Vanwege de lage expressie van glycerolkinase in witte adipocyten zijn de heropnamesnelheden van glycerol verwaarloosbaar, terwijl de heropname van vetzuren wordt bepaald door de vetzuurbindende capaciteit van mediacomponenten zoals albumine. Zowel glycerol als vetzuurafgifte in media kunnen worden gekwantificeerd door colorimetrische assays om de lipolytische snelheid te bepalen. Door deze factoren op meerdere tijdstippen te meten, kan men de lineaire snelheid van lipolyse met hoge betrouwbaarheid bepalen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de meting van lipolyse in in vitro gedifferentieerde adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor andere preadipocytencellijnen of vetweefsel van andere organismen; Overwegingen en optimalisatieparameters worden besproken. Dit protocol is ontworpen om nuttig te zijn bij het bepalen en vergelijken van de snelheid van adipocytenlipolyse tussen muismodellen en behandelingen.
Overtollige voedingsstoffen worden opgeslagen in wit vetweefsel in de vorm van triglyceriden in de neutrale lipidekern van lipidedruppels. Triglyceridevoorraden worden gemobiliseerd via lipolyse, een proces waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst door vetweefseltriglyceridilase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL), wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren (FFA’s) en de glycerol-ruggengraat 1,2. Lipolyse wordt geactiveerd door catecholaminesignalering in het vetweefsel. Sympathische zenuwuiteinden geven lokaal catecholaminen af, die binden aan β-adrenerge receptoren op het adipocytenplasmamembraan. Bij ligandbinding activeren deze G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR’s) adenylylcyclase via Gαs. Daaropvolgende activering van proteïnekinase A (PKA) door cAMP resulteert in de upregulatie van zowel ATGL als HSL. De fosforylering van perilipine-1 door PKA veroorzaakt de dissociatie van ABHD5 (ook bekend als CGI-58), dat ATGL3 bindt en coactiveert. PKA fosforyleert HSL direct en bevordert de translocatie van het cytosol naar de lipidedruppel, waar interactie met gefosforyleerd perilipine-1 de lipase-activiteit verder bevordert 4,5,6,7. De derde lipase die betrokken is bij lipolyse, MGL, lijkt niet te worden gereguleerd door catecholaminesignalering8. Belangrijk is dat triglyceridensynthese in adipocyten wordt gemedieerd door de glycerollipidesyntheseroute, die niet de vorming van monoglyceriden als tussenproduct met zich meebrengt; in plaats daarvan katalyseren glycerol-3-fosfaat acyltransferasen de vorming van lysofosfatidinezuur, dat wordt gecombineerd met een ander vette acyl-CoA om fosfatidisch zuur te vormen en vervolgens wordt geïsomeriseerd tot diglyceriden vóór de uiteindelijke synthese van triglyceriden (figuur 1) 9,10,11.
Figuur 1: Lipolyse en glycerol lipide synthese routes. Top: Lipolytische route; enzymen in rood: vetweefsel triglyceride lipase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL). Onder: glycerol lipide synthese route; enzymen in het groen: diglyceride acyltransferase (DGAT), fosfatidinezuurfosfatase (PAP), lysofosfatidinezuuracyltransferase (LPAT, ook bekend als LPAATs) en glycerol-3-fosfaatacyltransferase (GPAT). Lipiden: triglyceride (TG), diglyceride (DG), monoglyceride (MG), vrij vetzuur (FFA), vette acyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinezuur (LPA) en fosfatidinezuur (PA). Andere metabolieten: anorganisch fosfaat (Pi) en glycerol 3-fosfaat (G3P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Extracellulaire adenosine is een andere belangrijke regulator van lipolyse, die werkt via G s- en Gi-gekoppelde GPCR’s om de adenylcyclase-activiteit te beïnvloeden. De overheersende adenosinereceptor in adipocyten, ADORA1, remt adenylylcyclase en dus lipolyse door de activering van Gi12. Uitgedrukt op lagere niveaus, en voornamelijk in bruine adipocyten, activeert ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 beïnvloedt zowel basale lipolyse als de respons op adrenerge agonisten. Het effect van adenosine op lipolyse kan worden gecontroleerd door adenosinedeaminase toe te voegen om adenosine te neutraliseren, evenals de ADORA1-specifieke agonist fenylisopropyladenosine14,15. Hormonale activering van G q-gekoppelde GPCR’s kan ook de lipolyse beïnvloeden via de activering van fosfolipase C en eiwitkinase C16,17,18,19. Ontstekingssignalen hebben ook invloed op de lipolytische snelheden. TLR4-activering door LPS (en andere endotoxinen) verhoogt de lipolytische snelheid door ERK te activeren, dat perilipine-1 en HSL20 fosforyleert. TNF-α activeert ook lipolyse via ERK- en NF-κB-activering, evenals transcriptionele downregulatie van het fosfodiësterase PDE-3B en CIDEC21,22,23. IL-6 is ook in verband gebracht met verhoogde adipocytenlipolyse, vooral in mesenterisch vetweefsel, waarvan de FFA-afgifte van invloed is op leversteatose en gluconeogenese24,25,26.
Lipolyse wordt onderdrukt tijdens de gevoede toestand door insuline. AKT fosforyleert en activeert PDE-3B om cAMP-signalering te onderdrukken en PKA-activering te voorkomen27. Insuline downreguleert ook transcriptioneel ATGL28. Obesitas bevordert catecholamineresistentie door middel van een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder de downregulatie van β-adrenerge receptoren in adipocyten 29,30,31,32,33. Adipocyten brengen alle drie de β-adrenerge receptoren tot expressie (β-1, β-2 en β-3). Terwijl β-1 en β-2 adrenerge receptoren alomtegenwoordig tot expressie komen, wordt de β-3 adrenerge receptor voornamelijk uitgedrukt in adipocyten in muizen34,35. Adrb3-expressie wordt geïnduceerd door C/EBPα tijdens adipogenesis36. De β-3 adrenerge receptor komt sterk tot expressie in volwassen adipocyten. De activering van β-1 en β-2 adrenerge receptoren is zelfbeperkend als gevolg van feedbackremming door β-arrestine37. Feedbackremming van de β-3 adrenerge receptor wordt gemedieerd door andere signaalroutes, die de Adrb3-expressie 33,38,39 verminderen.
Talrijke verbindingen kunnen worden gebruikt om adipocytenlipolyse te activeren. Catecholamines zijn belangrijke fysiologische activatoren van lipolyse. Noradrenaline (of noradrenaline) en epinefrine (of adrenaline) activeren alle drie de β-adrenerge receptoren40. Noradrenaline en epinefrine beïnvloeden ook lipolyse via activering van α-adrenerge receptorsignalering41. Veelgebruikte β-adrenerge receptoragonisten zijn isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, en de β-3 adrenerge receptoragonisten CL-316,243 en mirabegron42. Aangezien adipocyten voornamelijk de β-3 adrenerge receptor tot expressie brengen, gebruiken we hier CL-316,243 als voorbeeld. De specificiteit voor de β-3 adrenerge receptor maakt het ook een relatief specifieke activator van adipocyte catecholamine signalering, die ook veilig in vivo kan worden gebruikt. Merk op dat de veelgebruikte concentratie van 10 μM CL-316,243 in celcultuur ordes van grootte hoger is dan de ~ 0,1 μM dosis die nodig is om een maximale responste bereiken 33. Forskolin omzeilt de adrenerge receptor, direct activeren adenylyl cyclase en downstream lipolytische signalering. Er zijn veel meer activatoren, evenals onderdrukkers van lipolyse. Bij het selecteren van een verbinding om lipolyse te stimuleren, moeten de receptorspecificiteit en downstream signaalroutes zorgvuldig worden overwogen binnen het experimentele ontwerp.
De snelheid van lipolyse in wit vetweefsel is een belangrijke metabolische factor die van invloed is op de koudetolerantie en de beschikbaarheid van voedingsstoffen tijdens vasten of lichaamsbeweging43,44,45,46. Het doel van dit protocol is om de snelheid van lipolyse in adipocyten en vetweefsel te meten, wat het begrip van adipocytenmetabolisme zal vergemakkelijken en hoe dit het metabole fenotype van verschillende muizenmodellen kan beïnvloeden. Om de lipolytische snelheid te kwantificeren, meten we het uiterlijk van lipolytische producten in de media (d.w.z. FFA’s en glycerol). De methode is gebaseerd op het vrijkomen van lipolytische producten uit de adipocyt in de media. Aangezien witte adipocyten lage niveaus van glycerolkinase tot expressie brengen, zijn de heropnamepercentages van glycerol laag47. Omgekeerd moet ook de productie van FFA’s en glycerol door andere metabole routes dan lipolyse worden overwogen. Adipocyten lijken een fosfatase uit te drukken met activiteit tegen glycerol-3-fosfaat, waardoor de productie van glycerol uit glycerol-3-fosfaat afgeleid van glucose48,49,50 mogelijk is. Glycolyse is een bron van glycerol-3-fosfaat dat wordt gebruikt voor FFA-herverestering in witte adipocyten. Wanneer de glucosespiegels beperkt zijn, vereist glyceroneogenese andere 3-koolstofbronnen, zoals lactaat en pyruvaat51. De kanalisatie van FFA’s die vrijkomen door lipolyse in de cel en hun metabolische lot is slecht begrepen; FFA’s die vrijkomen door lipolyse moeten worden omgezet in vette acyl-CoA, voordat ze opnieuw worden veresterd of β-oxidatie ondergaan. Het lijkt erop dat FFA’s die vrijkomen door lipolyse waarschijnlijk de cel verlaten voordat ze weer worden opgenomen en omgezet in vette acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA’s kunnen buiten de cel worden gesekwestreerd door albumine. Belangrijk is dat van FFA’s met een lange keten bekend is dat ze de lipolyse remmen als ze niet worden gesekwestreerd door albumine 63,64,65,66,67. Het optimaliseren van de FFA-buffercapaciteit van de media tijdens de lipolyse-assay is dus van cruciaal belang. De hier beschreven procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde methoden om de lipolytische snelheid in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen en mensen te meten 15,68,69,70,71. Dit protocol verschilt door het gebruik van seriële bemonstering; Door seriële bemonstering uit te voeren, kunnen we intern valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en meerdere metingen gebruiken om de snelheid van lipolyse te berekenen, waardoor de meetfout wordt verminderd om het vertrouwen in de uiteindelijke berekende waarde te vergroten. Het nadeel van seriële bemonstering is dat de test meer tijd en reagentia vereist; Het langere tijdsbestek vermindert echter de impact van meetfouten op de standaardfout van de schattingen van het tarief. Bovendien meet dit protocol zowel FFA als glycerolafgifte en beschouwt het de verhouding FFA: glycerolafgifte met als doel een 3: 1-verhouding te bereiken, zoals zou worden verwacht van volledige lipolyse en afgifte van lipolytische producten in de media72.
Hier bieden we een basisprotocol voor het meten van de snelheid van lipolyse in adipocyten en ex vivo vetweefsel. Om lipolyse te kwantificeren, is het belangrijk om de lipolytische snelheid in de lineaire fase te meten. We maken gebruik van een seriële bemonsteringstechniek, waarbij een groot deel van de media wordt verzameld en op regelmatige tijdstippen wordt vervangen door verse media. Deze semiconservatieve methode maakt de toevoeging van verse BSA met FFA-buffercapaciteit mogelijk en vertraagt feedbackremm…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidie R01DK126944 aan SMR.
24-Well tissue culture treated plate | Corning Inc | 3527 | Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation |
48-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353078 | Can be tissue culture treated |
6-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353046 | Can be tissue culture treated |
96-Well PCR Plate | USA sceintific | 1402-9100 | Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis |
CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers |
CO2 incubator | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work |
DMEM, low glucose, no phenol red | Thermofischer | 11054020 | Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate |
FFA-free Bovine serum albumin | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
Glycerol Standard Solution | Sigma Aldrich | G7793 | This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration |
HR Series NEFA Standard Solution | Fujifilm | 276-76491 | |
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A | Fujifilm | 999-34691 | |
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B | Fujifilm | 991-34891 | |
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A | Fujifilm | 995-34791 | |
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B | Fujifilm | 993-35191 | |
Microbiological Incubator | Fischer Scientific | S28668 | Any incubator at 37C can be used |
Nunc MicroWell 96-Well Plates | Thermo Scientific | 269620 | Any optically clear, flat bottom 96-well plate works |
Silicone Laboratory Benchtop Mat | VWR | 76045-300 | Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended |
Spectrophotometer/Microplate Reader | Molecular devices | SpectraMax i3x | Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work |
V Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 810531 | |
WypAll X70 Wipers | Kimberly-Clark | 41200 | Any high quality paper towel will work |