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Biology

Mesure du taux de lipolyse dans le tissu adipeux murin ex vivo et les préadipocytes primaires différenciés in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

La lipolyse des triglycérides dans les adipocytes est un processus métabolique important entraînant la libération d’acides gras libres et de glycérol. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour mesurer la lipolyse basale et stimulée dans les adipocytes et le tissu adipeux ex vivo de souris.

Abstract

Les adipocytes stockent l’énergie sous forme de triglycérides dans les gouttelettes lipidiques. Cette énergie peut être mobilisée via la lipolyse, où les chaînes latérales d’acides gras sont clivées séquentiellement à partir du squelette glycérol, ce qui entraîne la libération d’acides gras libres et de glycérol. En raison de la faible expression de la glycérol kinase dans les adipocytes blancs, les taux de recapture du glycérol sont négligeables, tandis que la recapture des acides gras est dictée par la capacité de liaison aux acides gras des composants multimédias tels que l’albumine. La libération de glycérol et d’acides gras dans les milieux peut être quantifiée par des tests colorimétriques pour déterminer le taux lipolytique. En mesurant ces facteurs à plusieurs points temporels, on peut déterminer le taux linéaire de lipolyse avec une grande confiance. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la mesure de la lipolyse dans les adipocytes différenciés in vitro et le tissu adipeux ex vivo de souris. Ce protocole peut également être optimisé pour d’autres lignées cellulaires de préadipocytes ou de tissus adipeux provenant d’autres organismes; Les considérations et les paramètres d’optimisation sont discutés. Ce protocole est conçu pour être utile pour déterminer et comparer le taux de lipolyse adipocytaire entre les modèles murins et les traitements.

Introduction

Les nutriments en excès sont stockés dans le tissu adipeux blanc sous forme de triglycérides dans le noyau lipidique neutre des gouttelettes lipidiques. Les réserves de triglycérides sont mobilisées par lipolyse, un processus par lequel les chaînes latérales d’acides gras sont clivées séquentiellement par la triglycéride lipase du tissu adipeux (ATGL), la lipase hormono-sensible (HSL) et la monoglycéride lipase (MGL), ce qui entraîne la libération d’acides gras libres (FFA) et du squelette glycérol 1,2. La lipolyse est activée par la signalisation catécholaminaire dans le tissu adipeux. Les terminaisons nerveuses sympathiques libèrent localement des catécholamines, qui se lient aux récepteurs β-adrénergiques de la membrane plasmique adipocytes. Lors de la liaison au ligand, ces récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activent l’adénylyl cyclase via Gαs. L’activation ultérieure de la protéine kinase A (PKA) par l’AMPc entraîne la régulation positive de l’ATGL et de la HSL. La phosphorylation de la périlipine-1 par la PKA provoque la dissociation d’ABHD5 (également connu sous le nom de CGI-58), qui lie et coactive ATGL3. La PKA phosphoryle directement HSL, favorisant sa translocation du cytosol en gouttelette lipidique, où l’interaction avec la périlipine-1 phosphorylée favorise davantage son activité lipase 4,5,6,7. La troisième lipase impliquée dans la lipolyse, MGL, ne semble pas être régulée par la catécholaminede signalisation 8. Il est important de noter que la synthèse des triglycérides dans les adipocytes est médiée par la voie de synthèse des lipides glycérols, qui n’implique pas la formation de monoglycérides en tant qu’intermédiaire; au lieu de cela, les glycérol-3-phosphate acyl transférases catalysent la formation d’acide lysophosphatidique, qui est combiné avec un autre acyl-CoA gras pour former de l’acide phosphatidique, puis isomérisé en diglycérides avant la synthèse finale des triglycérides (Figure 1)9,10,11.

Figure 1
Figure 1 : Voies de lipolyse et de synthèse des lipides glycérols. En haut : Voie lipolytique ; enzymes indiquées en rouge : triglycérides lipase du tissu adipeux (ATGL), lipase hormonosensible (HSL) et monoglycéride lipase (MGL). En bas: voie de synthèse des lipides glycérol; en vert : diglycéride acyltransférase (DGAT), phosphatidique acide phosphatase (PAP), acyltransférase de l’acide lysophosphatidique (LPAT, également connu sous le nom de LPAAT) et glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT). Lipides : triglycérides (TG), diglycérides (DG), monoglycérides (MG), acides gras libres (FFA), acyl-CoA gras (FA-CoA), acide lysophosphatidique (LPA) et acide phosphatidique (PA). Autres métabolites : phosphate inorganique (Pi) et glycérol 3-phosphate (G3P). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’adénosine extracellulaire est un autre régulateur important de la lipolyse, travaillant à travers les RCPG couplés Gs et Gi pour avoir un impact sur l’activité de l’adényl cyclase. Le récepteur prédominant de l’adénosine dans les adipocytes, ADORA1, inhibe l’adénylylcyclase, et donc la lipolyse par l’activation de Gi12. Exprimé à des niveaux inférieurs, et principalement dans les adipocytesbruns, ADORA2A active la lipolyse via la signalisationG s 13. ADORA1 affecte à la fois la lipolyse basale et la réponse aux agonistes adrénergiques. L’effet de l’adénosine sur la lipolyse peut être contrôlé en ajoutant de l’adénosine désaminase pour neutraliser l’adénosine, ainsi que l’agoniste spécifique ADORA1 phénylisopropyladénosine14,15. L’activation hormonale des RCPG couplés Gq peut également affecter la lipolyse via l’activation de la phospholipase C et de la protéine kinase C16,17,18,19. Les signaux inflammatoires ont également un impact sur les taux lipolytiques. L’activation de TLR4 par le LPS (et d’autres endotoxines) augmente le taux lipolytique en activant ERK, qui phosphoryle la périlipine-1 et la HSL20. Le TNF-α active également la lipolyse via l’activation ERK et NF-κB, ainsi que la régulation transcriptionnelle négative de la phosphodiestérase PDE-3B et CIDEC21,22,23. L’IL-6 a également été associée à une lipolyse adipocytaire accrue, en particulier dans le tissu adipeux mésentérique, dont la libération d’AGL a un impact sur la stéatose hépatique et la gluconéogenèse24,25,26.

La lipolyse est supprimée pendant l’état nourri par l’insuline. AKT phosphoryle et active la PDE-3B pour supprimer la signalisation de l’AMPc et empêcher l’activation de la PKA27. L’insuline régule également transcriptionnellement à la baisse ATGL28. L’obésité favorise la résistance aux catécholamines par divers mécanismes, y compris la régulation négative des récepteurs β-adrénergiques dans les adipocytes 29,30,31,32,33. Les adipocytes expriment les trois récepteurs β-adrénergiques (β-1, β-2 et β-3). Alors que les récepteurs adrénergiques β-1 et β-2 sont omniprésents, le récepteur adrénergique β-3 est principalement exprimé dans les adipocytes chez la souris34,35. L’expression d’Adrb3 est induite par C/EBPα au cours de l’adipogenèse36. Le récepteur adrénergique β-3 est fortement exprimé dans les adipocytes matures. L’activation des récepteurs adrénergiques β-1 et β-2 est spontanément résolutive en raison de l’inhibition de la rétroaction par β-arrestine37. L’inhibition par rétroaction du récepteur adrénergique β-3 est médiée par d’autres voies de signalisation, qui réduisent l’expression d’Adrb3 33,38,39.

De nombreux composés peuvent être utilisés pour activer la lipolyse adipocytes. Les catécholamines sont des activateurs physiologiques majeurs de la lipolyse. La noradrénaline (ou noradrénaline) et l’épinéphrine (ou adrénaline) activent les trois récepteurs β-adrénergiques40. La noradrénaline et l’épinéphrine affectent également la lipolyse via l’activation de la signalisation du récepteur α-adrénergique41. Les agonistes des récepteurs β-adrénergiques couramment utilisés comprennent l’isoprotérénol, qui est un agoniste non sélectif des récepteurs β-adrénergiques, et les agonistes des récepteurs adrénergiques β-3 CL-316,243 et mirabegron42. Étant donné que les adipocytes expriment principalement le récepteur adrénergique β-3, nous utilisons CL-316,243 comme exemple ici. Sa spécificité pour le récepteur adrénergique β-3 en fait également un activateur relativement spécifique de la signalisation des catécholamines adipocytes, qui peut également être utilisé en toute sécurité in vivo. Il est à noter que la concentration couramment utilisée de 10 μM CL-316,243 en culture cellulaire est supérieure de plusieurs ordres de grandeur à la dose de ~0,1 μM requise pour obtenir une réponse maximale33. La forskoline contourne le récepteur adrénergique, activant directement l’adénylyl cyclase et la signalisation lipolytique en aval. Il y a beaucoup plus d’activateurs, ainsi que des suppresseurs de lipolyse. Lors de la sélection d’un composé pour stimuler la lipolyse, la spécificité du récepteur et les voies de signalisation en aval doivent être soigneusement prises en compte dans le plan expérimental.

Le taux de lipolyse dans le tissu adipeux blanc est un facteur métabolique important ayant un impact sur la tolérance au froid et la disponibilité des nutriments pendant le jeûne ou l’exercice43,44,45,46. Le but de ce protocole est de mesurer le taux de lipolyse dans les adipocytes et le tissu adipeux, ce qui facilitera la compréhension du métabolisme des adipocytes et de son impact sur le phénotype métabolique de divers modèles murins. Pour quantifier le taux lipolytique, nous mesurons l’apparition de produits lipolytiques dans les milieux (c.-à-d. AGL et glycérol). La méthode repose sur la libération de produits lipolytiques de l’adipocyte dans le milieu. Étant donné que les adipocytes blancs expriment de faibles niveaux de glycérol kinase, les taux de recapture du glycérol sont faibles47. Inversement, la production d’AGL et de glycérol par des voies métaboliques autres que la lipolyse doit également être envisagée. Les adipocytes semblent exprimer une phosphatase avec une activité contre le phosphate de glycérol-3, permettant la production de glycérol à partir du glycérol-3-phosphate dérivé du glucose48,49,50. La glycolyse est une source de glycérol-3-phosphate utilisée pour la réestérification des AGL dans les adipocytes blancs. Lorsque les niveaux de glucose sont limités, la glycéronéogenèse nécessite d’autres sources de carbone 3, telles que le lactate et le pyruvate51. La canalisation des AGL libérées par la lipolyse au sein de la cellule et leur devenir métabolique sont mal comprises; Les AGL libérés par la lipolyse doivent être convertis en acyl-CoA gras, avant d’être réestérifiés ou de subir une β-oxydation. Il semble que les AGL libérés par la lipolyse sortent probablement de la cellule avant d’être repris et convertis en acyl-CoA gras 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Les AGL peuvent être séquestrés à l’extérieur de la cellule par l’albumine. Il est important de noter que les AGL à longue chaîne sont connus pour inhiber la lipolyse par rétroaction s’ils ne sont pas séquestrés par l’albumine 63,64,65,66,67. Ainsi, l’optimisation de la capacité tampon FFA du milieu pendant le test de lipolyse est essentielle. La procédure décrite ici est similaire aux méthodes précédemment publiées pour mesurer le taux lipolytique dans les adipocytes et les tissus adipeux ex vivo de souris et d’humains 15,68,69,70,71. Ce protocole diffère par l’utilisation de l’échantillonnage en série; En effectuant un échantillonnage en série, nous pouvons valider en interne que la lipolyse est mesurée dans la phase linéaire et utiliser plusieurs mesures pour calculer le taux de lipolyse, réduisant ainsi l’erreur de mesure pour augmenter la confiance dans la valeur finale calculée. L’inconvénient de l’échantillonnage en série est que le test nécessite plus de temps et de réactifs; Toutefois, la période plus longue réduit l’incidence de l’erreur de mesure sur l’erreur-type des estimations du taux. De plus, ce protocole mesure à la fois la libération de FFA et de glycérol, et considère le rapport de libération de FFA:glycérol dans le but d’atteindre un rapport de 3:1, comme on pourrait s’y attendre d’une lipolyse complète et de la libération de produits lipolytiques dans le milieu72.

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Protocol

L’utilisation de tous les animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Weill Cornell Medical College de l’Université Cornell.

1. Préparation des tampons et des plaques de collecte

  1. Obtenir 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) en dissolvant 5 g de BSA dans 100 mL de milieu Eagle’s modifié (DMEM) de Dulbecco sans rouge de phénol. Remuez doucement le BSA pour le dissoudre (agiter est contre-productif). Une fois le BSA complètement dissous, stériliser le média avec un filtre de 0,2 μm. Conservez le média BSA à 4 °C jusqu’à 1 mois.
  2. Faire des concentrations de travail des milieux de contrôle et de stimulation. Média de contrôle: 5% de média BSA avec contrôle du véhicule. Milieux de stimulation : milieu BSA à 5 % avec 0,5 μM CL-316 243. Fabriquez de nouveaux milieux de stimulation pour chaque expérience.
  3. Réchauffer le média à utiliser à 37 °C. Étiquetez une plaque de 96 puits pour la collecte des médias.

2. Préparation des échantillons

  1. Effectuer la culture cellulaire comme décrit ci-dessous. Entreprendre tous les travaux cellulaires dans une hotte stérile afin de minimiser la contamination extérieure.
    1. Isoler et différencier les préadipocytes primaires, comme dans73,74.
      1. Plaquer les préadipocytes primaires à haute densité, par exemple 1 x 105 cellules/puits dans une plaque de 24 puits dans 1 mL/milieu de culture de puits (15 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1x pénicilline-streptomycine-glutamine dans DMEM/F12).
      2. Une fois que les cellules ont atteint 100% de confluence, différencier avec 5 μM de dexaméthasone, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 1 μg/mL d’insuline et 1 μM de thiazolidinedione (TZD) dans des milieux de culture pendant 3 jours. Ensuite, passez à des milieux de culture avec 1 μg/mL d’insuline pendant au moins 3 jours pour faire croître les gouttelettes lipidiques. Utilisez 1 mL/puits de média dans la plaque de 24 puits.
      3. Changez le milieu de culture (1 ml/puits) avec de l’insuline tous les 2 ou 3 jours. Les cellules peuvent être maintenues dans des milieux avec de l’insuline jusqu’à 2 semaines. N’utiliser que des cultures dans lesquelles les taux de différenciation sont supérieurs à 90% et sont similaires entre les groupes pour ce test, car une différenciation réduite pourrait être interprétée à tort comme une réduction du taux lipolytique.
      4. Culture des cellules dans un milieu exempt d’insuline pendant 24 heures avant de mesurer la lipolyse.
        REMARQUE: L’insuline dans le milieu maintient les gouttelettes lipidiques, mais inhibe également la lipolyse. L’incubation sans insuline pendant 24 h permet une activation lipolytique complète sans perte de volume de gouttelettes lipidiques. Dans certains systèmes, le temps de culture sans insuline peut devoir être raccourci ou prolongé.
    2. Lavez les cellules avec DPBS une fois pour éliminer le sérum résiduel du milieu de culture.
      REMARQUE: Ce protocole n’inclut pas la famine sérique, qui peut activer la lipolyse. La famine sérique peut être utilisée à la discrétion du chercheur.
  2. Effectuer une culture ex vivo comme décrit ci-dessous.
    1. Préparez une plaque à 6 puits, avec un puits pour chaque tissu à prélever sur chaque souris. Placez 4 mL de DMEM à température ambiante dans chaque puits à utiliser.
      REMARQUE: BSA dans le support de collection n’est pas nécessaire.
    2. Préparer une plaque de 48 puits pour le test de lipolyse, avec un puits pour chaque répétition. Placer 400 μL de DMEM à température ambiante dans chaque puits à utiliser. Utilisez deux à quatre puits témoins et deux à quatre puits stimulés par tissu et par souris.
    3. Euthanasier la souris par luxation cervicale sous anesthésie, avec une méthode secondaire telle que le pneumothorax bilatéral. Ici, nous avons utilisé une souris C57BL/6J femelle de 32 g, âgée de 7 mois, nourrie avec un régime riche en graisses à 45% pendant 4 mois.
      REMARQUE: Ce protocole peut également être utilisé pour les hommes, ainsi que pour d’autres souches, régimes et âges.
    4. Vaporiser avec de l’éthanol à 70% et utiliser des ciseaux pour faire une petite incision latérale (~ 1 cm) au centre de la peau abdominale, écarter la peau en pinçant chaque côté avec le pouce et l’index et plier la peau abdominale inférieure pour révéler les dépôts sous-cutanés postérieurs. Localisez et enlevez le ganglion lymphatique inguinal et disséquez le tissu adipeux inguinal immédiatement postérieur au ganglion lymphatique inguinal à l’aide d’une pince.
    5. Pour recueillir le tissu adipeux gonadique, faites une incision latérale et verticale dans le péritoine pour accéder à la cavité péritonéale. Tenez le coussinet adipeux gonadique avec une pince à épiler et coupez le long de l’utérus (ou épididyme pour les hommes) pour enlever le tissu adipeux gonadique. Placez les dépôts collectés dans une plaque à 6 puits.
    6. Retirez le tissu du puits, placez-le sur un tapis de silicone et coupez-le en morceaux de 5 à 7 mg avec des ciseaux.
    7. Peser 25 à 30 mg (cinq ou six morceaux) pour chaque puits de dosage et placer dans une plaque d’essai de 48 puits. Épongez le mouchoir sur une serviette propre avant de peser pour enlever tout support. Peser le bateau de poids après le retrait du tissu et noter le poids de tout résidu laissé derrière. Essuyez le bateau de poids entre les échantillons et re-tarez si nécessaire. Utilisez un nouveau bateau de musculation pour chaque tissu.
    8. Une fois que tous les échantillons de tissus ont été pesés, placer la plaque de dosage à 48 puits dans un incubateur à 37 °C, 10% de CO2 pendant 15 min.

3. Dosage de la lipolyse

  1. Effectuer la collecte des médias. Entreprendre le transfert du milieu et le prélèvement subséquent des échantillons dans une hotte stérile afin de réduire au minimum la contamination potentielle provenant de sources extérieures.
    1. À t = 0, retirer le milieu et ajouter 400 μL par puits de milieu témoin ou de stimulation, puis placer la plaque dans un incubateur à 37 °C, 10 % de CO2 . Pour la culture tissulaire ex vivo , retirer délicatement le milieu à l’aide d’une pipette; L’aspiration ne doit jamais être utilisée.
      REMARQUE: Vous pouvez également préparer une deuxième plaque avec des milieux de contrôle et de stimulation et transférer les tissus.
    2. À t = 1, 2, 3 et 4 h, prélever 200 μL de milieu, remplacer par 200 μL du milieu témoin ou de stimulation approprié et remettre la plaque d’essai dans l’incubateur. Conserver la plaque de collecte à 4 °C. Pour déterminer la capacité tampon FFA du média BSA, utilisez une collecte supplémentaire à 24 h.
      REMARQUE: Les expériences peuvent être arrêtées ici et les milieux collectés peuvent être stockés à -20 ° C.

4. Dosage colorimétrique FFA

  1. Réchauffer les réactifs à température ambiante et dissoudre un flacon de réactif de couleur A avec un flacon de solvant A et un flacon de réactif de couleur B avec un flacon de solvant B. À partir de la date de reconstitution, il est préférable d’utiliser ces réactifs dans un délai de 1 semaine. Jeter 1 mois après la reconstitution.
  2. Décongeler et mélanger les échantillons.
  3. Créez une courbe standard FFA. La solution étalon est de 1 mM. Utilisez le volume suivant avec les réactifs pour la courbe étalon : 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (dilution 1:2), 10 μL (dilution 1:4), 10 μL (dilution 1:8) et 10 μL d’eau pour une plage maximale. Pour les faibles niveaux de FFA, 10 μL de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM et 0,05 mM standard peuvent être plus applicables.
  4. Étalons de pipette et échantillons dans une plaque d’essai de 96 puits. Le volume d’échantillon recommandé est de 10 μL. Inclure trois puits avec le même volume de milieux BSA que les échantillons pour la correction de fond.
    REMARQUE : Si les concentrations de l’échantillon se situent en dehors de la plage de la courbe standard, répéter l’essai, en ajustant le volume de l’échantillon à 2-25 μL.
  5. Ajouter 150 μL de réactif A à chaque puits et mélanger. Évitez de générer des bulles. Faites éclater les bulles avec une aiguille de calibre fin. Incuber la plaque de dosage à 37 °C pendant 5 min.
  6. Lire l’absorbance de la plaque à 550 nm et 660 nm de référence (lecture A).
  7. Ajouter 75 μL de réactif B à chaque puits et mélanger. Évitez de générer des bulles. Faites éclater les bulles avec une aiguille de calibre fin. Incuber la plaque de dosage à 37 °C pendant 5 min.
  8. Relisez l’absorbance de la plaque à 550 nm et 660 nm de référence (lecture B).

5. Dosage colorimétrique du glycérol

  1. Reconstituer le réactif glycérol libre avec 36 mL d’eau ultrapure et s’acclimater à température ambiante. Il est préférable d’utiliser ces réactifs en quelques semaines. Jeter 2 mois après la reconstitution.
  2. Décongeler et mélanger les échantillons.
  3. Créez une courbe étalon de glycérol en effectuant une dilution en série de sept points, 2 fois, de la solution étalon de glycérol et d’un blanc d’eau.
    NOTE: La courbe standard est relativement linéaire jusqu’à 25 μL de glycérol 2,8 mM, mais pas linéaire à des concentrations plus élevées.
  4. Pipeter 25 μL chacun de l’étalon et des échantillons dans la plaque d’essai à 96 puits. Inclure trois puits avec le média BSA pour la correction de fond.
  5. Ajouter 175 μL de réactif glycérol libre à chaque puits et mélanger. Évitez de générer des bulles. Faites éclater les bulles avec une aiguille de calibre fin. Incuber la plaque de dosage à 37 °C pendant 5 min.
  6. Lire l’absorbance de la plaque à 540 nm.

6. Calcul du taux lipolytique

  1. Commencez par les valeurs de densité optique (OD). Pour le glycérol, utilisez directement des valeurs A540 OD. Calculer la DO du dosage FFA selon la formule suivante :
    OD = (Lecture B: A 550 - A 660) - (Lecture A: A550 - A 660)
  2. Utilisez la courbe standard pour calculer les niveaux de FFA et de glycérol dans les échantillons prélevés. Tracer les valeurs standard de DO sur l’axe des y, et sur l’axe des x, utiliser les concentrations standard par rapport au volume de l’échantillon (c.-à-d. la concentration des puits avec 20 μL de 1 mM d’AGL standard sur une plaque avec des échantillons de 10 μL est égale à 2 mM). Ajuster une courbe de tendance linéaire :
    y = mx + b
  3. Inspectez visuellement la courbe standard et retirez tous les points en dehors de la plage linéaire du test. Calculez les concentrations de l’échantillon à l’aide de l’équation suivante :
    Concentration dans l’échantillon: x = (DO - b) ÷ m
  4. Ajuster et réanalyser les échantillons situés en dehors de la plage d’essai linéaire. Pour obtenir la concentration finale de l’échantillon, soustrayez de la concentration des échantillons la concentration des puits de fond ne contenant que des milieux BSA.
  5. Calculer les moles de FFA et de glycérol produites par chaque échantillon à chaque point temporel, selon la formule:
    Equation 1
    où C n = concentration au temps t = n ; Vt = volume total dans le puits; Vs = volume de prélèvement de l’échantillon; et M n = moles produites au temps t = n (lorsque les concentrations sont en mM et les volumes en mL, la production est en μMol).
    Par exemple, à différents moments :
    M 1 = C1 ×V t
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    ou
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normaliser le poids des tissus en divisant par le poids tissulaire de chaque échantillon en grammes pour obtenir des unités de μmol/g. Pour les cellules en culture, les valeurs sont présentées en μmol/puits. S’assurer que le nombre de cellules et l’efficacité de différenciation sont comparables d’un puits à l’autre.
    REMARQUE : Les différences dans l’efficacité de la prolifération ou de la différenciation compliqueront l’interprétation des résultats et nécessiteront une autre méthode de normalisation (p. ex., normalisation en protéines; voir la discussion).
  7. Calculer la pente du μmol/g produit (axe des y) en fonction du temps (axe des x) pour chaque échantillon individuellement.
    1. Dans une feuille de calcul, cela peut être fait en utilisant la fonction =SLOPE(known_ys,known_xs). Dans une nouvelle cellule, tapez « =SLOPE » (utilisez ensuite le curseur pour mettre en surbrillance les valeurs de glycérol ou de FFA de l’échantillon en μmol/g, puis pour mettre en surbrillance les valeurs de temps correspondantes).
    2. Vérifiez la linéarité des données. Les valeurs R2 sont un moyen rapide de déterminer la linéarité des échantillons. Dans une feuille de calcul, cela peut être fait à l’aide de la fonction =RSQ(known_ys,known_xs), de la même manière que décrite à l’étape 6.7.1, mais l’entrée initiale est =RSQ. S’assurer que les valeurs de R2 sont > 0,98; Des valeurs plus faibles indiquent un écart par rapport à la linéarité. Cela peut résulter d’une erreur de mesure/échantillonnage ou d’une perte de linéarité.
      1. Une autre façon de tester la linéarité consiste à effectuer une régression linéaire pour chaque échantillon et à tracer les résidus. Dans un logiciel d’analyse statistique, générez une table XY avec une seule valeur Y pour chaque point de temps. Sélectionnez Analyser > Régression linéaire simple et cochez la case Tracé résiduel avant d’appuyer sur OK. Le graphique résiduel apparaîtra sous la forme d’un nouveau graphique.
  8. Utiliser la FFA et le taux de production de glycérol (c.-à-d. pente [(μmol/g/h]) pour chaque échantillon comme point de données individuel pour effectuer une analyse statistique et tracer les valeurs si différentes conditions lipolytiques sont comparées. Si les taux lipolytiques sont comparés entre les génotypes, utiliser deux ou trois échantillons par animal comme répliques techniques et utiliser la moyenne pour un point de données par animal, de sorte que la taille de l’échantillon soit égale au nombre d’animaux.

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Representative Results

Nous avons mesuré le taux lipolytique basal et stimulé des adipocytes différenciés in vitro. Les préadipocytes primaires du tissu adipeux blanc inguinal ont été différenciés en adipocytes par le traitement de cellules confluentes avec 5 μM de dexaméthasone, 0,5 mM d’IBMX, 1 μg/mL d’insuline et 1 μM de troglitazone pendant 4 jours, suivi d’un traitement supplémentaire de 3 jours avec 1 μg/mL d’insuline. Les cellules ont été incubées dans des milieux sans insuline pendant 24 heures avant le test de lipolyse. Au temps = 0h, les cellules ont été lavées une fois avec du PBS, puis du DMEM sans rouge de phénol avec 2% de BSA, contenant soit 10 μM CL-316,243, soit du contrôle du véhicule, a été ajouté à chaque puits de la plaque de 12 puits. Au temps = 1 h, 2 h, 3 h et 4 h, 50 % du milieu a été recueilli et remplacé par 2 % de BSA dans du DMEM sans phénol rouge. Les concentrations de FFA et de glycérol ont été mesurées dans les milieux collectés et les moles de FFA, et le glycérol sécrété dans les milieux a été calculé à chaque point temporel (figure 2A, B). La production d’AGL et de glycérol était linéaire pour le test de 4 heures, avec des valeurs de R2 de 0,98 et plus. Les niveaux de FFA sur 4 h étaient légèrement faibles, ce qui indique que les taux lipolytiques ont peut-être ralenti; Cependant, l’analyse avec et sans le point temporel de 4 h n’a pas eu d’impact significatif sur le taux lipolytique calculé. Les taux lipolytiques stimulés étaient significativement plus élevés que les taux basaux (Figure 2C). La stimulation lipolytique a entraîné la production de FFA et de glycérol à un rapport molaire proche de 3:1 dans tous les échantillons prélevés, comme on pouvait s’y attendre d’une lipolyse complète des triglycérides sans recapture ou rétention significative (Figure 2D). Cependant, dans les cellules non stimulées, le rapport était plus proche de 1, suggérant une source non lipolytique de glycérol48,49,50.

Figure 2
Figure 2 : Taux lipolytique dans les adipocytes primaires différenciés in vitro. Les préadipocytes ont été différenciés dans une plaque de 12 puits. L’insuline a été retirée du milieu 24 heures avant le test lipolytique. Au temps = 0 h, les cellules ont été stimulées avec 10 μM CL-316,243 (CL) ou traitées avec des milieux témoins de véhicule (V). Les nmol de (A) FFA et (B) glycérol produits dans chaque puits à chaque point temporel ont été tracés au fil du temps, et une droite de régression linéaire a été ajustée pour chaque puits individuel. c) Taux de production de FFA. (D) Taux de production de glycérol. Les données sont représentées sous forme de rapport molaire moyen ± SEM. (E) de FFA:glycérol dans les milieux collectés à chaque point temporel. L’analyse statistique en (C) et (D) a été effectuée à l’aide du test t d’un étudiant; l’effet de la CL était significatif à α = 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans la culture cellulaire, la monocouche de cellules est en contact direct avec le milieu, tandis que dans les tissus cultivés ex vivo, les cellules du centre ne sont pas en contact avec le milieu. Ainsi, dans les cultures ex vivo, les AGL sont plus susceptibles d’être retenus dans le tissu. Les plus gros morceaux de tissu, qui ont un rapport surface/volume plus faible, présentent des taux plus élevés de rétention d’AGL, ce qui entraîne des rapports molaires FFA:glycérol plus faibles (Figure 3A). Avec la diminution de la taille des morceaux de tissu, le rapport molaire de FFA:glycérol libéré approche 3:1 (Figure 3A). Cependant, les morceaux de tissu peuvent aussi être trop petits. En plus du défi de travailler avec de minuscules morceaux de tissu adipeux, des morceaux de tissu adipeux de 1 à 2 mg présentent des taux lipolytiques réduits, ce qui suggère une viabilité et une fonctionnalité réduites du tissu (Figure 3B, C). Bien qu’il soit fastidieux et long de couper le tissu adipeux en morceaux de taille et de forme constantes, il est nécessaire d’obtenir des résultats comparables et fiables. Nous recommandons 5 à 10 mg de morceaux de tissu adipeux, mais la consistance est la plus importante. Les taux lipolytiques peuvent encore être mesurés de manière reproductible dans des morceaux de tissu plus gros, cependant, il est important de considérer la rétro-inhibition de la lipolyse par les AGL 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figure 3 : Effet de la taille des morceaux de tissu sur la libération d’AGL et le taux lipolytique. Le tissu adipeux blanc gonadique provenant d’un régime riche en graisses nourri avec des souris femelles C57Bl / 6J a été recueilli et coupé en morceaux de taille variable. Tous les puits contenaient 25 à 30 mg de tissu adipeux au total; Pour les puits de 25 mg, il s’agissait d’un morceau de tissu; Les puits de 10 mg avaient trois morceaux de tissu chacun de ~ 10 mg, les puits de 5 mg contenaient cinq ou six morceaux de tissu et les puits de 2 mg contenaient 13-16 morceaux. Au temps = 0 h, la lipolyse a été stimulée avec 0,5 μM CL-316,243 (CL), ou les puits témoins ont été traités avec un véhicule (V). Le taux lipolytique calculé à partir d’échantillons prélevés après 1 h, 2 h et 3 h est tracé pour (A) les AGL et (B) le glycérol. (C) Rapport molaire de production de FFA/glycérol dans chaque puits. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. L’analyse statistique en (A) et (B) a été effectuée à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle avec une analyse post-hoc de Holm-Sidak, α = 0,05. L’effet de la CL était significatif dans tous les échantillons. Dans les échantillons traités au CL, les taux de production de FFA et de glycérol étaient significativement différents dans toutes les comparaisons par paires, à l’exception des échantillons de 10 mg par rapport aux échantillons de 5 mg. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’impact négatif de la rétention de FFA peut être observé dans les morceaux de tissu de 25 mg, qui présentent des taux plus faibles de production d’AGL et de glycérol lors de la stimulation (Figure 3B, C). Cette inhibition de rétroaction est également apparente lorsque la capacité de liaison FFA des médias est trop faible (c.-à-d. qu’il n’y a pas assez de BSA dans les médias). Lorsque la BSA dans le milieu a été réduite à 0,5%, la libération de FFA a été réduite de plus de quatre fois et la libération de glycérol a presque doublé (Figure 4A,B). En règle générale, les niveaux micromolaires de FFA dans les milieux ne devraient pas approcher le pourcentage de BSA dans les milieux (c.-à-d. que les niveaux de FFA devraient rester inférieurs à 5 mM FFA dans les milieux BSA à 5 % et à 0,5 mM dans les milieux BSA à 0,5 % [à ce niveau, il y a un rapport molaire de 20:3 de FFA:BSA]). Pour tester la capacité tampon maximale de BSA de la préparation des milieux BSA, prélever le milieu d’un échantillon stimulé pendant 24 heures et mesurer la concentration de FFA (la concentration sera élevée, de sorte qu’un volume d’échantillon inférieur ou une dilution de l’échantillon est recommandé). L’accumulation de FFA dans le milieu BSA à 5 % après stimulation de 24 h était d’environ 5 mM, tandis que la teneur en AGL dans le milieu BSA à 0,5 % n’était que de 0,6 mM (Figure 4C). Si l’on considère la concentration de FFA dans les milieux collectés, on constate que la capacité de liaison FFA des milieux BSA à 0,5 % est surchargée (Figure 4D). Bien que les niveaux de FFA dans les milieux BSA à 5 % soient beaucoup plus élevés, ils ne dépassent pas la capacité tampon du média (Figure 4D). Idéalement, la concentration de FFA dans le milieu devrait rester inférieure à un rapport molaire FFA:BSA de 3:1 (c.-à-d. 2,3 mM de FFA dans 5 % [0,75 mM] de BSA).

Figure 4
Figure 4 : Des niveaux insuffisants de BSA entraînent une réduction des taux lipolytiques apparents. Le tissu adipeux blanc gonadique d’un régime riche en graisses nourri avec des souris femelles C57Bl / 6J a été recueilli et coupé en morceaux de ~ 5 mg. Un total de 20 à 30 mg de tissu adipeux a été placé dans chaque puits. Au temps = 0 h, la lipolyse a été stimulée avec 0,5 μM CL-316,243 (CL), ou les puits témoins ont été traités avec du véhicule (V) dans un milieu BSA à 5% ou un milieu contenant seulement 0,5% de BSA. Le taux lipolytique calculé à partir des échantillons prélevés après 4 h est tracé pour (A) les AGL et (B) le glycérol. L’effet de la CL était significatif dans tous les échantillons. Dans les échantillons traités au CL, les taux de production de FFA et de glycérol étaient significativement différents entre les conditions de milieu BSA de 5 % et de 0,5 %. (C) Niveaux de FFA dans les milieux des puits stimulés après 24 h. (D) Niveaux de FFA dans les échantillons prélevés à 4 h. (E) Courbes étalons FFA avec et sans préparations diverses de BSA à 5 % dans le DMEM. Densité optique calculée comme suit : (Lecture B : A 550 - A 660) - (Lecture A: A 550 - A660). (F) Courbe étalon de glycérol avec et sans BSA. La densité optique est absorbante à 540 nm (A540). Les valeurs de DO à 5,6 mM n’étaient pas linéaires et n’étaient donc pas incluses dans la courbe standard. (G) Taux de libération d’AGL par le tissu adipeux gonadipeux féminin en utilisant différents types de BSA dans les milieux d’essai. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. L’analyse statistique en (A) et (B) a été réalisée à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle avec une analyse post hoc de Holm-Sidak, * valeur p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Il est important de souligner que certaines préparations de BSA contiennent des AGF. Chaque lot de BSA doit être testé pour s’assurer que la teneur en AGL est négligeable (notez que certaines préparations BSA sont commercialisées comme étant exemptes de FFA). Bien qu’il ne soit pas spécifiquement commercialisé comme étant exempt de FFA, le BSA utilisé ici ne contient pas de FFA détectables. Nous avons testé les milieux de dosage contenant du BSA sans FFA (Equitech Bio Inc, BAH66), le BSA utilisé dans les expériences ici (Sigma, A9418) et une fraction plus brute (moins coûteuse) V BSA (Sigma, 810531). Le BSA sans FFA et le BSA A9418 n’ont tous deux produit aucun signal de fond ni modifié la pente de courbe standard ou l’interception; les courbes standard étaient superposables (figure 4E). Aucun impact du DMEM BSA n’a été observé non plus sur la courbe étalon du glycérol (Figure 4F). La fraction V BSA, en revanche, a produit un signal de fond dans le test FFA, ce qui équivaut à une concentration de FFA de 0,3 mM (figure 4E). Ce bruit de fond a déplacé la courbe standard vers le haut, mais n’a pas eu d’impact significatif sur la pente, ce qui indique que la soustraction de fond est suffisante. Nous avons également effectué une expérience de lipolyse stimulée en utilisant ces trois différents types de BSA, et avons constaté qu’après soustraction de fond, le taux calculé de lipolyse ne différait pas entre les formulations de BSA (Figure 4F). Cependant, ce n’est souvent pas le cas, en particulier avec des préparations BSA moins pures qui peuvent facilement contenir de l’insuline ou d’autres composants qui ont un impact sur le taux de lipolyse. Chaque lot de BSA doit être testé et validé, et utilisé de façon uniforme (c.-à-d. que les échantillons analysés avec différents lots de BSA ne sont pas comparables). Une courbe standard complète avec l’ajout de BSA et de DMEM doit être effectuée lors de la validation de chaque lot de BSA pour s’assurer qu’il ne contient rien qui interfère avec les enzymes dans les essais colorimétriques.

La prise d’échantillons en série et le remplacement du volume par des supports frais permettent de réduire la charge FFA dans le support tout au long de l’expérience. Nous avons mesuré les taux lipolytiques dans le tissu adipeux gonadique d’une souris femelle nourrie avec un régime riche en graisses pendant 4 mois. Dans cette expérience, des morceaux de tissu de 5 à 8 mg (poids total de 25 à 30 mg) ont été incubés dans 200 μL de milieu BSA à 5%, et 100 μL ont été collectés et remplacés à 1 h, 2 h, 3 h et 4 h. Les niveaux de FFA et de glycérol dans les milieux collectés ont été mesurés. A 3 h, les niveaux de FFA dans le milieu avaient atteint la zone dangereuse de 2,3 mM (figure 5A). La rétro-inhibition de la lipolyse a été suggérée par l’absence d’augmentation des taux de FFA et de glycérol dans les milieux à 4 h (Figure 5A,B). Après avoir calculé le μmol de FFA et de glycérol libéré à chaque point temporel et ajusté une courbe linéaire, il est évident que le taux lipolytique commence à diminuer à 4 h dans les échantillons stimulés, avec des valeursR2 aussi basses que 0,976 pour FFA et 0,983 pour le glycérol (Figure 5C,D). Si l’on examine le graphique résiduel, il est clair que les valeurs sur 4 h sont inférieures à la tendance linéaire (c.-à-d. que les résidus sont négatifs) (figure 5E,F). L’exclusion du point temporel de 4 h a augmenté les valeurs de R2 à 0,997 et 0,998 et plus pour l’AFL et le glycérol, respectivement. L’inclusion du point temporel de 4 h entraîne une diminution faible mais significative des taux calculés de libération de FFA et de glycérol (Figure 5G,H).

Figure 5
Figure 5 : Calcul du taux lipolytique linéaire dans le tissu adipeux ex vivo. Le tissu adipeux blanc gonadique d’un régime riche en graisses nourri avec des souris femelles C57Bl / 6J a été recueilli et coupé en morceaux de ~ 5 mg. Un total de 20 à 30 mg de tissu adipeux a été placé dans chaque puits. Au temps = 0 h, la lipolyse a été stimulée avec 0,5 μM CL-316,243 (CL), ou les puits témoins ont été traités avec un véhicule (V). Des collectes de milieux ont été effectuées à 1 h, 2 h, 3 h et 4 h. (A) FFA et (B) niveaux de glycérol dans les milieux. (C) FFA et (D) production de glycérol tracée dans le temps. Plaques résiduelles pour la production de (E) FFA et (F) de glycérol au fil du temps. Taux de libération de (G) FFA et (H) glycérol, calculé avec et sans le point temporel de 4 heures. (I) Libération d’AGL dans le tissu adipeux gonadique féminin. Près de 50 % des supports ont changé à 1 h, 2 h et 3 h. Entre les heures, les points temporels de 15 minutes ont collecté 2,75% des médias sans remplacement. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SEM. L’analyse statistique en (G) et (H) a été réalisée à l’aide d’une ANOVA bidirectionnelle avec une analyse post-hoc de Holm-Sidak, * valeur p < 0,05. L’effet de la CL était significatif dans tous les échantillons (valeur p < 0,05). Dans les échantillons traités au CL, les taux de production de FFA et de glycérol étaient significativement différents entre les calculs avec et sans le point temporel de 4 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Contrairement aux protocoles précédents, ce protocole utilise plusieurs points temporels pour déterminer le taux lipolytique, réduisant ainsi l’erreur de mesure et fournissant une validation interne que le taux linéaire de lipolyse est mesuré. Pour maintenir la lipolyse dans la phase linéaire à chaque point de collecte, 50% des supports sont collectés et remplacés. Puisque la linéarité est essentielle, nous voulions nous assurer que l’ajout de nouveaux médias ne causait pas une explosion de lipolyse à chaque ajout. Pour valider la linéarité entre les points temporels, nous avons prélevé un très petit échantillon (2,75%) toutes les 15 minutes entre les points horaires de 1 h à 3 h, sans remplacement. À 1 h, 2 h et 3 h, le prélèvement normal de 50 % de l’échantillon a été effectué et remplacé. Le taux de libération d’AGL était linéaire entre les points temporels habituels, ce qui indique qu’il n’y a pas eu d’éclatement de lipolyse à chaque ajout de milieux frais (figure 5I).

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Discussion

Ici, nous fournissons un protocole de base pour mesurer le taux de lipolyse dans les adipocytes et le tissu adipeux ex vivo . Pour quantifier la lipolyse, il est important de mesurer le taux lipolytique dans la phase linéaire. Nous utilisons une technique d’échantillonnage en série, où une grande fraction des milieux est collectée et remplacée par des milieux frais à intervalles réguliers. Cette méthode semi-conservatrice permet l’ajout de BSA frais avec une capacité tampon FFA et retarde l’inhibition de la rétroaction, prolongeant ainsi la durée de la lipolyse linéaire. Ce plan expérimental tente de récapituler la vascularisation du tissu adipeux in vivo, qui délivre de l’albumine fraîche pour lier les FFA75 libérés. Ce protocole a été optimisé pour mesurer la lipolyse dans les préadipocytes primaires du tissu adipeux blanc ex vivo murin et du tissu adipeux inguinal différenciés in vitro. Le protocole peut probablement être optimisé pour bien fonctionner dans les dépôts adipeux bruns et beiges, ainsi que dans les tissus adipeux d’autres organismes et les lignées cellulaires immortalisées à fort potentiel adipogénique. Le protocole permet une flexibilité dans l’âge, le sexe et le régime alimentaire des souris avant la collecte de tissu adipeux pour des essais ex vivo . Certaines manipulations, telles que le jeûne, peuvent avoir un impact sur le taux lipolytique basal, tandis que d’autres interventions telles que l’obésité induite par l’alimentation ont également un impact sur le taux de lipolyse stimulée.

Le protocole doit être optimisé pour chaque système expérimental, selon que les taux lipolytiques sont supérieurs ou inférieurs. Pour valider la linéarité, nous recommandons de calculer les valeurs R2 et de regarder le graphique des résidus. Les valeurs de R2 doivent être très proches de 1. Lors de l’évaluation du graphique résiduel, il faut être à l’affût des valeurs résiduelles négatives à des moments ultérieurs, car elles indiquent que les taux lipolytiques diminuent et que la linéarité est perdue. Des exemples de ces placettes résiduelles sont présentés à la figure 5E,F. L’élimination des points de temps de 4 h dans ce cas fournit un calcul plus précis du taux lipolytique linéaire et améliore les valeurs R2. Cependant, étant donné que le taux est calculé à partir de plusieurs points temporels, il est relativement robuste, et l’inclusion d’un tel point de temps n’a qu’un faible impact sur les valeurs R2 et le taux de lipolyse calculé. Si un seul point temporel est utilisé pour calculer le taux lipolytique, les données peuvent être plus facilement faussées.

La façon dont les données sont normalisées peut également avoir une incidence sur les résultats relatifs entre les échantillons. Ici, nous recommandons de normaliser le tissu ex vivo au poids du tissu et aux préadipocytes primaires différenciés in vitro par puits. Cependant, ces techniques de normalisation peuvent ne pas convenir à tous les systèmes expérimentaux. Il est important de noter que si le taux de prolifération ou l’efficacité de différenciation diffère d’un groupe à l’autre, la normalisation par puits n’est pas appropriée. Les techniques de normalisation alternatives comprennent les protéines, les lipides et l’ADN. Chaque méthode de normalisation a ses avantages et ses inconvénients. Le poids des tissus et la normalisation des puits sont simples et directs. Les différences de taille des adipocytes peuvent signifier que le tissu adipeux maigre contient beaucoup plus d’adipocytes par gramme que le tissu adipeux obèse, tandis que les différences d’efficacité de différenciation peuvent entraîner des différences dans le nombre d’adipocytes par puits. Les lipides peuvent être extraits avec des solvants organiques (p. ex., 2:1 chloroforme:méthanol [v/v]) et la teneur en triglycérides mesurée à l’aide d’un réactif colorimétrique. Bien que la normalisation de la teneur en lipides ne soit pas une méthode traditionnellement utilisée, les gouttelettes lipidiques sont, après tout, l’organite subissant la lipolyse, et cette méthode de normalisation est spécifique aux adipocytes, ce qui peut être utile lorsque les taux de différenciation diffèrent entre les cellules. Après extraction lipidique, 0,1-0,3 N NaOH peut être utilisé pour extraire la protéine, qui peut ensuite être dosée par Bradford ou BCA dosageprotéique 68. Alternativement, les échantillons peuvent être homogénéisés dans un tampon de lyse, et la fraction lipidique éliminée par centrifugation70. Notez que la contamination lipidique interférera avec les tests protéiques. Si la protéine doit être utilisée pour la normalisation, les cellules doivent être lavées abondamment (au moins trois fois) pour éliminer le BSA du milieu de dosage. Parfois, les adipocytes différenciés n’adhèrent pas bien à la plaque et ne tolèrent pas les trois lavages nécessaires pour éliminer l’excès de BSA. La normalisation à l’ADN permet la normalisation au nombre de cellules, et peut être effectuée avec un kit d’extraction d’ADN commercial, suivie de la quantification de l’ADN total par absorbance ou analyse PCR en temps réel du nombre de copies de gènes. Alternativement, dans les cellules plaquées, la coloration DAPI suivie d’une imagerie peut être utilisée pour compter les noyaux et normaliser le nombre de cellules. Lors de la normalisation à l’aide du nombre de cellules ou de protéines, il est important de tenir compte des cellules non adipocytaires dans l’échantillon. Le tissu adipeux contient également des cellules immunitaires et endothéliales; Dans le tissu adipeux obèse, l’inflammation et l’hypertrophie peuvent entraîner aussi peu que 1 noyau sur 10 provenant d’adipocytes matures. Cependant, les adipocytes contribuent toujours à la majorité de la masse et de la teneur en lipides du tissu. Pour les préadipocytes différenciés in vitro , l’efficacité de la différenciation a un impact sur le pourcentage relatif d’adipocytes matures; Lorsque c’est le cas, la normalisation est compliquée. Idéalement, l’efficacité de la différenciation devrait être optimisée avant d’utiliser les cellules pour un test de lipolyse. Si cela n’est pas possible, la normalisation de la teneur en lipides est recommandée si le volume de gouttelettes lipidiques est similaire entre les adipocytes différenciés. La comparaison des taux lipolytiques entre les cultures adipocytaires avec une différenciation inégale peut conduire à des conclusions erronées sur la lipolyse alors que le facteur déterminant est en fait l’adipogenèse; Il s’agit d’une limitation du protocole.

Les FFA à longue chaîne inhibent la lipolyse 63,64,65,66,67. Les AGL s’accumulent lorsqu’elles ne sont pas suffisamment séquestrées dans les médias. Une grande partie du dépannage associé à l’optimisation de la mesure de la lipolyse est liée à la minimisation de la rétention d’AGL. Le calcul du rapport molaire de la libération de FFA:glycérol dans le milieu aide à identifier les problèmes liés à la rétention des AGL. Si le rapport molaire est de 3: 1 pour FFA: glycérol, alors tous les produits de la lipolyse sont libérés et capturés dans les milieux, tandis qu’un rapport inférieur à 2: 1 est un motif de préoccupation. Une considération importante pour les essais ex vivo est la taille du morceau de tissu adipeux. Les plus gros morceaux de tissu ont un rapport surface/volume plus faible, et sont donc plus susceptibles de retenir les AGL et de présenter des taux lipolytiques réduits en conséquence (Figure 4A,B). En gardant cela à l’esprit, il est essentiel de couper le tissu adipeux de chaque échantillon en morceaux d’une taille et d’une forme cohérentes. Pour faciliter la séquestration des FFA dans les milieux, il est également important de s’assurer que les supports contiennent suffisamment de BSA pour lier les FFA libérés. La capacité tampon FFA des milieux peut être augmentée en augmentant la concentration de BSA ou en augmentant le volume des milieux. Il est tout aussi efficace d’augmenter le volume ou la fréquence de collecte. Si l’on observe des taux lipolytiques élevés, mais des rapports FFA:glycérol inférieurs à 2:1, nous recommandons d’augmenter la fréquence de collecte à toutes les 30 minutes et d’arrêter le test à 2,5 h.

Le protocole fourni ici est optimisé pour le tissu adipeux blanc ex vivo de souris et les préadipocytes primaires différenciés in vitro, qui sont tous deux hautement lipolytiques. Le test doit être optimisé pour mesurer la lipolyse dans d’autres systèmes, ou si les différences dans le taux basal relativement faible de lipolyse sont particulièrement intéressantes. Par exemple, les adipocytes 3T3-L1 ont une activité lipolytique plus faible32. Lorsque le taux lipolytique est faible, le volume d’incubation devrait être diminué (c.-à-d. au lieu de 400 μL par puits dans une plaque de 24 puits, 200 μL dans une plaque de 24 puits devraient être utilisés, ou 300 μL dans une plaque de 12 puits, et 100-150 μL recueillis par point temporel. Le volume de prélèvement ne doit pas descendre en dessous de 100 μL, car des volumes d’échantillons plus importants sont nécessaires pour mesurer avec précision les faibles niveaux de FFA et de glycérol. Pour doser le glycérol en utilisant 50 μL de milieu par échantillon, le réactif glycérol libre doit être dissous dans 31 mL d’eau et 150 μL de réactif utilisé avec 50 μL d’échantillon dans chaque puits. Les niveaux de FFA peuvent être mesurés avec 25 μL d’échantillon par puits, peut-être plus, tant que la linéarité est maintenue. Les points temporels peuvent également être étendus pour augmenter le signal. Lors de l’analyse des taux lipolytiques de cellules autres que les adipocytes blancs, les différences dans le métabolisme cellulaire doivent être prises en compte. Par exemple, les adipocytes bruns et beiges expriment des niveaux beaucoup plus élevés de glycérol kinase, et sont donc capables de retenir la libération de glycérol par lipolyse76,77. Ces cellules métaboliquement actives peuvent également être en mesure de canaliser les acides gras libérés dans des voies cataboliques ou synthétiques sans libération dans le milieu. Le devenir métabolique de la FFA et du glycérol dans le type cellulaire spécifique soumis à l’essai doit être pris en compte lors de l’interprétation des résultats d’un test de lipolyse, en particulier dans un type cellulaire autre que les adipocytes blancs. Les tests de lipolyse dans d’autres types de cellules doivent être optimisés et validés.

Ce protocole est conçu pour évaluer les différences de taux lipolytique dans les modèles murins. Les préadipocytes primaires différenciés in vitro sont un outil utile pour étudier les effets autonomes cellulaires des manipulations génétiques ou des traitements pharmacologiques dans les adipocytes. Le tissu adipeux, d’autre part, contient d’autres types de cellules, y compris les cellules immunitaires. L’impact des cellules immunitaires du tissu adipeux dans la régulation de la lipolyse est important à considérer lors de l’évaluation de la lipolyse des tissus entiers. Les modèles de lipolyse adipocytaire en culture peuvent contourner l’influence de complication potentielle des cellules immunitaires et permettre l’étude approfondie des types de cellules spécifiques, tandis que les explants de tissu adipeux permettent une comparaison plus robuste avec l’environnement in vivo . De plus, le test ex vivo peut être utilisé pour étudier les taux lipolytiques dans divers dépôts adipeux. Dans ces systèmes, la lipolyse est stimulée par des composés tels que les agonistes des récepteurs β-adrénergiques, de sorte que tout changement de tonus sympathique pouvant avoir un impact sur le modèle murin in vivo ne sera pas observé. La mesure in vivo de la lipolyse est compliquée par la dynamique de la libération et de l’absorption de l’AGL et du glycérol dans divers tissus du corps. Les taux sériques d’AGL et de glycérol à un moment donné constituent l’équilibre entre la sécrétion et l’absorption, et il ne faut pas présumer que les changements dans les taux sériques de FFA et de glycérol sont attribuables uniquement à la lipolyse du tissu adipeux. La lipolyse induite par le jeûne est influencée par le tonus sympathique, mais ne produit pas de changements rapides et robustes dans les taux sériques de FFA ou de glycérol, ce qui rend difficile l’interprétation des changements dans les taux sériques à jeun de FFA et de glycérol. La lipolyse in vivo peut être stimulée à l’aide d’un agoniste des récepteurs adrénergiques β-3, tel que CL-316,243, et une augmentation de l’AGL sérique et du glycérol est détectable dans les 20 minutes suivant la stimulation. Les essais lipolytiques in vivo devraient comprendre à la fois des mesures de base de l’AGL sérique et du glycérol, ainsi qu’un témoin du véhicule; de cette façon, le changement spécifique à la stimulation des taux sériques de FFA et de glycérol peut être déterminé.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention R01DK126944 des National Institutes of Health des États-Unis à S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

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References

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Mesure du taux de lipolyse dans le tissu adipeux <em>murin ex vivo</em> et les préadipocytes primaires différenciés <em>in vitro</em>
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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

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