Mesure du taux de lipolyse dans le tissu adipeux murin ex vivo et les préadipocytes primaires différenciés in vitro

Summary

La lipolyse des triglycérides dans les adipocytes est un processus métabolique important entraînant la libération d’acides gras libres et de glycérol. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour mesurer la lipolyse basale et stimulée dans les adipocytes et le tissu adipeux ex vivo de souris.

Abstract

Les adipocytes stockent l’énergie sous forme de triglycérides dans les gouttelettes lipidiques. Cette énergie peut être mobilisée via la lipolyse, où les chaînes latérales d’acides gras sont clivées séquentiellement à partir du squelette glycérol, ce qui entraîne la libération d’acides gras libres et de glycérol. En raison de la faible expression de la glycérol kinase dans les adipocytes blancs, les taux de recapture du glycérol sont négligeables, tandis que la recapture des acides gras est dictée par la capacité de liaison aux acides gras des composants multimédias tels que l’albumine. La libération de glycérol et d’acides gras dans les milieux peut être quantifiée par des tests colorimétriques pour déterminer le taux lipolytique. En mesurant ces facteurs à plusieurs points temporels, on peut déterminer le taux linéaire de lipolyse avec une grande confiance. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la mesure de la lipolyse dans les adipocytes différenciés in vitro et le tissu adipeux ex vivo de souris. Ce protocole peut également être optimisé pour d’autres lignées cellulaires de préadipocytes ou de tissus adipeux provenant d’autres organismes; Les considérations et les paramètres d’optimisation sont discutés. Ce protocole est conçu pour être utile pour déterminer et comparer le taux de lipolyse adipocytaire entre les modèles murins et les traitements.

Introduction

Les nutriments en excès sont stockés dans le tissu adipeux blanc sous forme de triglycérides dans le noyau lipidique neutre des gouttelettes lipidiques. Les réserves de triglycérides sont mobilisées par lipolyse, un processus par lequel les chaînes latérales d’acides gras sont clivées séquentiellement par la triglycéride lipase du tissu adipeux (ATGL), la lipase hormono-sensible (HSL) et la monoglycéride lipase (MGL), ce qui entraîne la libération d’acides gras libres (FFA) et du squelette glycérol ^1,2. La lipolyse est activée par la signalisation catécholaminaire dans le tissu adipeux. Les terminaisons nerveuses sympathiques libèrent localement des catécholamines, qui se lient aux récepteurs β-adrénergiques de la membrane plasmique adipocytes. Lors de la liaison au ligand, ces récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activent l’adénylyl cyclase via G_αs. L’activation ultérieure de la protéine kinase A (PKA) par l’AMPc entraîne la régulation positive de l’ATGL et de la HSL. La phosphorylation de la périlipine-1 par la PKA provoque la dissociation d’ABHD5 (également connu sous le nom de CGI-58), qui lie et coactive ATGL³. La PKA phosphoryle directement HSL, favorisant sa translocation du cytosol en gouttelette lipidique, où l’interaction avec la périlipine-1 phosphorylée favorise davantage son activité lipase 4,5,6,7. La troisième lipase impliquée dans la lipolyse, MGL, ne semble pas être régulée par la catécholamine^{de signalisation 8}. Il est important de noter que la synthèse des triglycérides dans les adipocytes est médiée par la voie de synthèse des lipides glycérols, qui n’implique pas la formation de monoglycérides en tant qu’intermédiaire; au lieu de cela, les glycérol-3-phosphate acyl transférases catalysent la formation d’acide lysophosphatidique, qui est combiné avec un autre acyl-CoA gras pour former de l’acide phosphatidique, puis isomérisé en diglycérides avant la synthèse finale des triglycérides (Figure 1)9,10,11.

Figure 1 : Voies de lipolyse et de synthèse des lipides glycérols. En haut : Voie lipolytique ; enzymes indiquées en rouge : triglycérides lipase du tissu adipeux (ATGL), lipase hormonosensible (HSL) et monoglycéride lipase (MGL). En bas: voie de synthèse des lipides glycérol; en vert : diglycéride acyltransférase (DGAT), phosphatidique acide phosphatase (PAP), acyltransférase de l’acide lysophosphatidique (LPAT, également connu sous le nom de LPAAT) et glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT). Lipides : triglycérides (TG), diglycérides (DG), monoglycérides (MG), acides gras libres (FFA), acyl-CoA gras (FA-CoA), acide lysophosphatidique (LPA) et acide phosphatidique (PA). Autres métabolites : phosphate inorganique (Pi) et glycérol 3-phosphate (G3P). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’adénosine extracellulaire est un autre régulateur important de la lipolyse, travaillant à travers les RCPG couplés G_s et G_i pour avoir un impact sur l’activité de l’adényl cyclase. Le récepteur prédominant de l’adénosine dans les adipocytes, ADORA1, inhibe l’adénylylcyclase, et donc la lipolyse par l’activation de G_i¹². Exprimé à des niveaux inférieurs, et principalement dans les adipocytes_bruns, ADORA2A active la lipolyse via la signalisation^{G s 13}. ADORA1 affecte à la fois la lipolyse basale et la réponse aux agonistes adrénergiques. L’effet de l’adénosine sur la lipolyse peut être contrôlé en ajoutant de l’adénosine désaminase pour neutraliser l’adénosine, ainsi que l’agoniste spécifique ADORA1 phénylisopropyladénosine^14,15. L’activation hormonale des RCPG couplés G_q peut également affecter la lipolyse via l’activation de la phospholipase C et de la protéine kinase C^16,17,18,19. Les signaux inflammatoires ont également un impact sur les taux lipolytiques. L’activation de TLR4 par le LPS (et d’autres endotoxines) augmente le taux lipolytique en activant ERK, qui phosphoryle la périlipine-1 et la HSL²⁰. Le TNF-α active également la lipolyse via l’activation ERK et NF-κB, ainsi que la régulation transcriptionnelle négative de la phosphodiestérase PDE-3B et CIDEC^21,22,23. L’IL-6 a également été associée à une lipolyse adipocytaire accrue, en particulier dans le tissu adipeux mésentérique, dont la libération d’AGL a un impact sur la stéatose hépatique et la gluconéogenèse^24,25,26.

La lipolyse est supprimée pendant l’état nourri par l’insuline. AKT phosphoryle et active la PDE-3B pour supprimer la signalisation de l’AMPc et empêcher l’activation de la PKA²⁷. L’insuline régule également transcriptionnellement à la baisse ATGL²⁸. L’obésité favorise la résistance aux catécholamines par divers mécanismes, y compris la régulation négative des récepteurs β-adrénergiques dans les adipocytes 29,30,31,32,33. Les adipocytes expriment les trois récepteurs β-adrénergiques (β-1, β-2 et β-3). Alors que les récepteurs adrénergiques β-1 et β-2 sont omniprésents, le récepteur adrénergique β-3 est principalement exprimé dans les adipocytes chez la souris^34,35. L’expression d’Adrb3 est induite par C/EBPα au cours de l’adipogenèse³⁶. Le récepteur adrénergique β-3 est fortement exprimé dans les adipocytes matures. L’activation des récepteurs adrénergiques β-1 et β-2 est spontanément résolutive en raison de l’inhibition de la rétroaction par β-arrestine³⁷. L’inhibition par rétroaction du récepteur adrénergique β-3 est médiée par d’autres voies de signalisation, qui réduisent l’expression d’Adrb3 ^33,38,39.

De nombreux composés peuvent être utilisés pour activer la lipolyse adipocytes. Les catécholamines sont des activateurs physiologiques majeurs de la lipolyse. La noradrénaline (ou noradrénaline) et l’épinéphrine (ou adrénaline) activent les trois récepteurs β-adrénergiques⁴⁰. La noradrénaline et l’épinéphrine affectent également la lipolyse via l’activation de la signalisation du récepteur α-adrénergique⁴¹. Les agonistes des récepteurs β-adrénergiques couramment utilisés comprennent l’isoprotérénol, qui est un agoniste non sélectif des récepteurs β-adrénergiques, et les agonistes des récepteurs adrénergiques β-3 CL-316,243 et mirabegron⁴². Étant donné que les adipocytes expriment principalement le récepteur adrénergique β-3, nous utilisons CL-316,243 comme exemple ici. Sa spécificité pour le récepteur adrénergique β-3 en fait également un activateur relativement spécifique de la signalisation des catécholamines adipocytes, qui peut également être utilisé en toute sécurité in vivo. Il est à noter que la concentration couramment utilisée de 10 μM CL-316,243 en culture cellulaire est supérieure de plusieurs ordres de grandeur à la dose de ~0,1 μM requise pour obtenir une réponse maximale³³. La forskoline contourne le récepteur adrénergique, activant directement l’adénylyl cyclase et la signalisation lipolytique en aval. Il y a beaucoup plus d’activateurs, ainsi que des suppresseurs de lipolyse. Lors de la sélection d’un composé pour stimuler la lipolyse, la spécificité du récepteur et les voies de signalisation en aval doivent être soigneusement prises en compte dans le plan expérimental.

Le taux de lipolyse dans le tissu adipeux blanc est un facteur métabolique important ayant un impact sur la tolérance au froid et la disponibilité des nutriments pendant le jeûne ou l’exercice^43,44,45,46. Le but de ce protocole est de mesurer le taux de lipolyse dans les adipocytes et le tissu adipeux, ce qui facilitera la compréhension du métabolisme des adipocytes et de son impact sur le phénotype métabolique de divers modèles murins. Pour quantifier le taux lipolytique, nous mesurons l’apparition de produits lipolytiques dans les milieux (c.-à-d. AGL et glycérol). La méthode repose sur la libération de produits lipolytiques de l’adipocyte dans le milieu. Étant donné que les adipocytes blancs expriment de faibles niveaux de glycérol kinase, les taux de recapture du glycérol sont faibles⁴⁷. Inversement, la production d’AGL et de glycérol par des voies métaboliques autres que la lipolyse doit également être envisagée. Les adipocytes semblent exprimer une phosphatase avec une activité contre le phosphate de glycérol-3, permettant la production de glycérol à partir du glycérol-3-phosphate dérivé du glucose^48,49,50. La glycolyse est une source de glycérol-3-phosphate utilisée pour la réestérification des AGL dans les adipocytes blancs. Lorsque les niveaux de glucose sont limités, la glycéronéogenèse nécessite d’autres sources de carbone 3, telles que le lactate et le pyruvate⁵¹. La canalisation des AGL libérées par la lipolyse au sein de la cellule et leur devenir métabolique sont mal comprises; Les AGL libérés par la lipolyse doivent être convertis en acyl-CoA gras, avant d’être réestérifiés ou de subir une β-oxydation. Il semble que les AGL libérés par la lipolyse sortent probablement de la cellule avant d’être repris et convertis en acyl-CoA gras 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Les AGL peuvent être séquestrés à l’extérieur de la cellule par l’albumine. Il est important de noter que les AGL à longue chaîne sont connus pour inhiber la lipolyse par rétroaction s’ils ne sont pas séquestrés par l’albumine 63,64,65,66,67. Ainsi, l’optimisation de la capacité tampon FFA du milieu pendant le test de lipolyse est essentielle. La procédure décrite ici est similaire aux méthodes précédemment publiées pour mesurer le taux lipolytique dans les adipocytes et les tissus adipeux ex vivo de souris et d’humains 15,68,69,70,71. Ce protocole diffère par l’utilisation de l’échantillonnage en série; En effectuant un échantillonnage en série, nous pouvons valider en interne que la lipolyse est mesurée dans la phase linéaire et utiliser plusieurs mesures pour calculer le taux de lipolyse, réduisant ainsi l’erreur de mesure pour augmenter la confiance dans la valeur finale calculée. L’inconvénient de l’échantillonnage en série est que le test nécessite plus de temps et de réactifs; Toutefois, la période plus longue réduit l’incidence de l’erreur de mesure sur l’erreur-type des estimations du taux. De plus, ce protocole mesure à la fois la libération de FFA et de glycérol, et considère le rapport de libération de FFA:glycérol dans le but d’atteindre un rapport de 3:1, comme on pourrait s’y attendre d’une lipolyse complète et de la libération de produits lipolytiques dans le milieu⁷².

Protocol

L’utilisation de tous les animaux a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Weill Cornell Medical College de l’Université Cornell. 1. Préparation des tampons et des plaques de collecte Obtenir 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) en dissolvant 5 g de BSA dans 100 mL de milieu Eagle’s modifié (DMEM) de Dulbecco sans rouge de phénol. Remuez doucement le BSA pour le dissoudre (agiter est contre-product…

Representative Results

Nous avons mesuré le taux lipolytique basal et stimulé des adipocytes différenciés in vitro. Les préadipocytes primaires du tissu adipeux blanc inguinal ont été différenciés en adipocytes par le traitement de cellules confluentes avec 5 μM de dexaméthasone, 0,5 mM d’IBMX, 1 μg/mL d’insuline et 1 μM de troglitazone pendant 4 jours, suivi d’un traitement supplémentaire de 3 jours avec 1 μg/mL d’insuline. Les cellules ont été incubées dans des milieux sans insuline pendant 24 heures avant …

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole de base pour mesurer le taux de lipolyse dans les adipocytes et le tissu adipeux ex vivo . Pour quantifier la lipolyse, il est important de mesurer le taux lipolytique dans la phase linéaire. Nous utilisons une technique d’échantillonnage en série, où une grande fraction des milieux est collectée et remplacée par des milieux frais à intervalles réguliers. Cette méthode semi-conservatrice permet l’ajout de BSA frais avec une capacité tampon FFA et retarde l’inhib…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work