Summary
脂肪細胞におけるトリグリセリド脂肪分解は、遊離脂肪酸およびグリセロールの遊離をもたらす重要な代謝プロセスである。ここでは、マウスの脂肪細胞および ex vivo 脂肪組織における基礎脂肪分解および刺激脂肪分解を測定するための詳細なプロトコルを提供します。
Abstract
脂肪細胞は脂肪滴中にトリグリセリドの形でエネルギーを蓄えます。このエネルギーは脂肪分解 を介して 動員することができ、そこでは脂肪酸側鎖がグリセロール骨格から順次切断され、遊離脂肪酸およびグリセロールの放出をもたらす。白色脂肪細胞におけるグリセロールキナーゼの発現が低いため、グリセロールの再取り込み速度はごくわずかですが、脂肪酸の再取り込みはアルブミンなどの培地成分の脂肪酸結合能力によって決まります。培地へのグリセロールおよび脂肪酸放出の両方を比色アッセイによって定量し、脂肪分解率を決定することができる。これらの因子を複数の時点で測定することにより、脂肪分解の線形速度を高い信頼性で決定できます。ここでは、マウス由来の in vitro 分化脂肪細胞および ex vivo 脂肪組織における脂肪分解の測定のための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、他の脂肪前駆細胞株または他の生物由来の脂肪組織に対しても最適化され得る。考慮事項と最適化パラメーターについて説明します。このプロトコルは、マウスモデルと治療の間の脂肪細胞脂肪分解の速度を決定および比較するのに役立つように設計されています。
Introduction
過剰な栄養素は、脂肪滴の中性脂質コア中のトリグリセリドの形で白色脂肪組織に貯蔵される。トリグリセリド貯蔵は、脂肪組織トリグリセリドリパーゼ(ATGL)、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)、およびモノグリセリドリパーゼ(MGL)によって脂肪酸側鎖が順次切断され、遊離脂肪酸(FFA)およびグリセロール骨格が放出されるプロセスである脂肪分解を介して動員される1,2。脂肪分解は、脂肪組織のカテコールアミンシグナル伝達によって活性化されます。交感神経終末はカテコールアミンを局所的に放出し、カテコールアミンは脂肪細胞原形質膜上のβアドレナリン作動性受容体に結合する。リガンドが結合すると、これらのGタンパク質共役受容体(GPCR)はGαsを介してアデニリルシクラーゼを活性化します。その後のcAMPによるプロテインキナーゼA(PKA)の活性化は、ATGLおよびHSLの両方のアップレギュレーションをもたらす。PKAによるペリリピン-1のリン酸化は、ATGL3に結合して共活性化するABHD5(CGI-58としても知られる)の解離を引き起こす。PKAはHSLを直接リン酸化し、細胞質ゾルから脂肪滴への転座を促進し、リン酸化ペリリピン-1との相互作用によりリパーゼ活性がさらに促進されます4,5,6,7。脂肪分解に関与する3番目のリパーゼであるMGLは、カテコールアミンシグナル伝達によって調節されていないようです8。重要なことに、脂肪細胞におけるトリグリセリド合成は、中間体としてのモノグリセリドの形成を伴わないグリセロール脂質合成経路によって媒介される。代わりに、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼはリゾホスファチジン酸の形成を触媒し、リゾホスファチジン酸は別の脂肪酸アシルCoAと結合してホスファチジン酸を形成し、トリグリセリドの最終合成前にジグリセリドに異性化します(図1)9,10,11。
図1:脂肪分解とグリセロール脂質合成経路。 上:脂肪分解経路;赤で示されている酵素:脂肪組織トリグリセリドリドリパーゼ(ATGL)、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)、およびモノグリセリドリパーゼ(MGL)。下:グリセロール脂質合成経路;緑色で示されている酵素:ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAT、LPAATとしても知られています)、およびグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)。脂質:トリグリセリド(TG)、ジグリセリド(DG)、モノグリセリド(MG)、遊離脂肪酸(FFA)、脂肪酸アシルCoA(FA-CoA)、リゾホスファチジン酸(LPA)、およびホスファチジン酸(PA)。他の代謝産物:無機リン酸(Pi)およびグリセロール3-リン酸(G3P)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細胞外アデノシンは脂肪分解のもう一つの重要な調節因子であり、GsおよびGi結合GPCRを介してアデニルシクラーゼ活性に影響を与えます。脂肪細胞における優勢なアデノシン受容体であるADORA1は、アデニリルシクラーゼを阻害し、したがってGi12の活性化を介して脂肪分解を阻害します。ADORA2Aは、より低いレベルで、主に褐色脂肪細胞で発現し、Gsシグナル伝達を介して脂肪分解を活性化します13。ADORA1は、基礎脂肪分解とアドレナリン作動薬に対する反応の両方に影響を与えます。.脂肪分解に対するアデノシンの効果は、アデノシンを中和するためのアデノシンデアミナーゼ、ならびにADORA1特異的アゴニストフェニルイソプロピルアデノシン14,15を添加することによって制御することができる。Gq結合GPCRのホルモン活性化は、ホスホリパーゼCおよびプロテインキナーゼC 16,17,18,19の活性化を介して脂肪分解にも影響を及ぼし得る。炎症シグナルも脂肪分解率に影響を与えます。LPS(および他のエンドトキシン)によるTLR4活性化は、ペリリピン-1およびHSL20をリン酸化するERKを活性化することにより、脂肪分解率を増加させる。TNF-αはまた、ERKおよびNF-κB活性化、ならびにホスホジエステラーゼPDE-3BおよびCIDEC21,22,23の転写ダウンレギュレーションを介して脂肪分解を活性化します。IL-6はまた、特に腸間膜脂肪組織における脂肪細胞脂肪分解の増加と関連しており、そのFFA放出は肝脂肪症および糖新生に影響を及ぼす24,25,26。
脂肪分解は、インスリンによって摂食状態の間に抑制される。AKTはPDE-3Bをリン酸化して活性化し、cAMPシグナル伝達を抑制し、PKA活性化を阻止します27。インスリンはまた、ATGL28を転写的にダウンレギュレートします。肥満は、脂肪細胞におけるβ-アドレナリン作動性受容体のダウンレギュレーションを含む様々なメカニズムを通じてカテコールアミン耐性を促進する29,30,31,32,33。脂肪細胞は、3つのβアドレナリン作動性受容体(β-1、β-2、およびβ-3)すべてを発現します。β-1およびβ-2アドレナリン受容体が遍在的に発現しているのに対し、β-3アドレナリン受容体は主にマウスの脂肪細胞で発現している34,35。Adrb3の発現は、脂肪生成中にC / EBPαによって誘導されます36。β-3アドレナリン受容体は成熟脂肪細胞で高度に発現しています。β-1およびβ-2アドレナリン作動性受容体の活性化は、β-アレスチン37によるフィードバック阻害による自己制限である。β-3アドレナリン作動性受容体のフィードバック阻害は、Adrb3発現を減少させる他のシグナル伝達経路によって媒介される33、38、39。
脂肪細胞の脂肪分解を活性化するために多数の化合物を使用することができる。カテコールアミンは、脂肪分解の主要な生理活性物質です。ノルエピネフリン(またはノルアドレナリン)およびエピネフリン(またはアドレナリン)は、3つのβアドレナリン受容体すべてを活性化する40。ノルエピネフリンおよびエピネフリンはまた、α-アドレナリン作動性受容体シグナル伝達 の活性化を介して 脂肪分解に影響を及ぼす41。一般的に使用されるβ-アドレナリン受容体アゴニストには、非選択的β-アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール、ならびにβ-3アドレナリン受容体アゴニストCL-316,243およびミラベグロン42が含まれる。脂肪細胞が主にβ-3アドレナリン受容体を発現していることを考えると、ここでは例としてCL-316,243を使用します。β-3アドレナリン受容体に対するその特異性はまた、それを脂肪細胞カテコールアミンシグナル伝達の比較的特異的な活性化因子にし、それはまた、 in vivoで安全に使用することができる。細胞培養で一般的に使用される10 μM CL-316,243の濃度は、最大応答を達成するために必要な~0.1 μMの用量よりも桁違いに高いことに注意してください33。フォルスコリンはアドレナリン作動性受容体をバイパスし、アデニリルシクラーゼと下流の脂肪分解シグナル伝達を直接活性化します。脂肪分解の抑制剤と同様に、より多くの活性化剤があります。脂肪分解を刺激する化合物を選択する際には、受容体特異性と下流のシグナル伝達経路を実験デザイン内で慎重に検討する必要があります。
白色脂肪組織における脂肪分解の速度は、絶食または運動中の耐寒性と栄養素の利用可能性に影響を与える重要な代謝因子です43,44,45,46。このプロトコルの目的は、脂肪細胞と脂肪組織における脂肪分解の速度を測定することであり、脂肪細胞の代謝と、それがさまざまなマウスモデルの代謝表現型にどのように影響するかの理解を容易にします。脂肪分解率を定量化するために、培地中の脂肪分解生成物(すなわち、FFAおよびグリセロール)の出現を測定する。この方法は、脂肪細胞から培地への脂肪分解産物の放出に依存する。白色脂肪細胞は低レベルのグリセロールキナーゼを発現するので、グリセロール再取り込み率は低い47。逆に、脂肪分解以外の代謝経路によるFFAとグリセロールの生成も考慮する必要があります。脂肪細胞は、グリセロール-3リン酸に対する活性を有するホスファターゼを発現するようであり、グルコース48,49,50に由来するグリセロール-3-リン酸からのグリセロールの産生を可能にする。解糖系は、白色脂肪細胞のFFA再エステル化に使用されるグリセロール-3-リン酸の供給源です。グルコースレベルが制限されている場合、血糖新生には乳酸やピルビン酸などの他の3炭素源が必要です51。細胞内の脂肪分解によって放出されるFFAのチャネリングとその代謝運命はよくわかっていません。脂肪分解によって放出されたFFAは、再エステル化またはβ酸化を受ける前に、脂肪アシルCoAに変換する必要があります。脂肪分解によって放出されたFFAは、取り戻されて脂肪アシルCoAに変換される前に細胞から出る可能性が高いようです52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 .FFAはアルブミンによって細胞外に隔離することができます。重要なことに、長鎖FFAは、アルブミン63,64,65,66,67によって隔離されていない場合、脂肪分解をフィードバック阻害することが知られています。したがって、脂肪分解アッセイ中の培地のFFA緩衝能を最適化することは極めて重要である。ここで説明する手順は、マウスおよびヒト由来の脂肪細胞およびex vivo脂肪組織における脂肪分解率を測定するために以前に公開された方法と同様である15、68、69、70、71。このプロトコルは、シリアルサンプリングの使用によって異なります。シリアルサンプリングを行うことで、脂肪分解が線形相で測定されていることを内部で検証し、複数の測定を利用して脂肪分解の速度を計算することで、測定誤差を減らし、最終的な計算値の信頼性を高めることができます。シリアルサンプリングの欠点は、アッセイにより多くの時間と試薬が必要になることです。ただし、時間枠が長いほど、レートの推定値の標準誤差に対する測定誤差の影響が減少します。さらに、このプロトコルは、FFAとグリセロールの両方の放出を測定し、完全な脂肪分解および培地72への脂肪分解生成物の放出から予想されるように、3:1の比率を達成することを目標にFFA:グリセロール放出の比率を考慮します。
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Protocol
すべての動物の使用は、コーネル大学のワイルコーネル医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. バッファーおよび回収プレートの調製
- フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)100 mLに5 gのBSAを溶解して、5%ウシ血清アルブミン(BSA)を作ります。BSAを静かにかき混ぜて溶解します(振とうは逆効果です)。BSAが完全に溶解したら、0.2 μmのフィルターで培地をフィルター滅菌します。BSA培地を4°Cで最長1ヶ月間保管します。
- 制御および刺激媒体の作業濃度を作ります。制御メディア:車両制御付き5%BSAメディア。刺激媒体:0.5 μM CL-316,243を含む5%BSA媒体。実験ごとに新鮮な刺激培地を作ります。
- 使用するメディアを37°Cに温めます。 培地収集用に96ウェルプレートにラベルを付けます。
2. サンプル調製
- 以下のように細胞培養を行う。外部汚染を最小限に抑えるために、滅菌ヒュームフード内のすべてのセル作業を行います。
- 73,74のように、初代前駆脂肪細胞を単離して分化させる。
- 初代脂肪前駆細胞を高密度でプレート化します(1 mL/ウェル培地(15%ウシ胎児血清(FBS)およびDMEM/F12中の1xペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン)の24ウェルプレートに1 x 105 細胞/ウェルなど)。
- 細胞が100%コンフルエントになったら、培養培地中で5 μMデキサメタゾン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、1 μg/mLインスリン、および1 μMチアゾリジンジオン(TZD)で3日間分化させます。その後、1 μg/mLのインスリンを含む培地に少なくとも3日間交換して、脂肪滴を増殖させます。24ウェルプレートに1 mL/ウェルの培地を使用します。
- 培養培地(1 ml /ウェル)を2〜3日ごとにインスリンで交換します。細胞はインスリンを含む培地中で最大2週間維持することができる。分化率の低下は脂肪分解率の低下と誤解される可能性があるため、このアッセイでは分化率が90%を超え、グループ間で類似している培養のみを使用してください。
- 脂肪分解を測定する前に、インスリンフリー培地で細胞を24時間培養します。
注:培地中のインスリンは脂肪滴を維持しますが、脂肪分解も阻害します。インスリンなしで24時間インキュベーションすると、脂肪滴量を失うことなく完全な脂肪分解活性化が可能になります。一部のシステムでは、インスリンなしの培養時間を短縮または延長する必要がある場合があります。
- 細胞をDPBSで一度洗浄し、培地から残留血清を除去します。
注:このプロトコルには、脂肪分解を活性化する可能性のある血清飢餓は含まれていません。血清飢餓は、研究者の裁量で使用することができます。
- 73,74のように、初代前駆脂肪細胞を単離して分化させる。
- 下記のように 生体外 培養を行う。
- 各マウスから採取する組織ごとに1ウェルずつ、6ウェルプレートを準備します。使用する各ウェルに4 mLの室温DMEMを入れます。
注: 収集メディア内の BSA は必要ありません。 - 脂肪分解アッセイ用の48ウェルプレートを準備し、複製ごとに1ウェルを用意します。使用する各ウェルに400 μLの室温DMEMを入れます。マウス1匹あたり組織あたり2〜4個のコントロールウェルと2〜4個の刺激ウェルを使用します。
- マウスを麻酔下で頸部脱臼によって、両側気胸などの二次的な方法で安楽死させる。ここでは、32 gの生後7か月の雌C57BL / 6Jマウスを使用し、45%の高脂肪食を4か月間与えました。
注:このプロトコルは、男性だけでなく、他の株、食事、年齢にも使用できます。 - 70%エタノールをスプレーし、ハサミで腹部の皮膚中央を横方向に小さく(~1cm)切開し、親指と人差し指で両側をつまんで皮膚を引き離し、下腹部の皮膚を折りたたんで後皮下デポを露出させます。鼠径リンパ節を見つけて除去し、鉗子を使用して鼠径リンパ節のすぐ後方の鼠径脂肪組織を鈍く解剖します。
- 性腺脂肪組織を収集するには、腹膜を横方向および垂直方向に切開して腹膜腔にアクセスします。性腺脂肪パッドをピンセットで持ち、子宮(または男性の場合は精巣上体)に沿って切断して性腺脂肪組織を取り除きます。収集したデポを6ウェルプレートに入れます。
- ウェルからティッシュを取り出し、シリコンマットの上に置き、ハサミで5〜7mgの塊に切ります。
- アッセイウェルごとに25〜30 mg(5つまたは6つのチャンク)を計量し、48ウェルアッセイプレートに入れます。計量する前に、清潔なタオルでティッシュを拭き取ってメディアを取り除きます。組織を除去した後、重量ボートの重量を量り、残った残留物の重量を記録します。サンプル間でウェイトボートをきれいに拭き、必要に応じて風袋引きします。組織ごとに新しいウェイトボートを使用してください。
- すべての組織サンプルを秤量したら、48ウェルアッセイプレートを37°C、10%CO2 インキュベーターに15分間入れます。
- 各マウスから採取する組織ごとに1ウェルずつ、6ウェルプレートを準備します。使用する各ウェルに4 mLの室温DMEMを入れます。
3. 脂肪分解アッセイ
- メディアの収集を実行します。培地の移送とその後のサンプル収集を滅菌ヒュームフードで行い、外部ソースからの潜在的な汚染を最小限に抑えます。
- t = 0で、培地を除去し、コントロールまたは刺激培地のウェルあたり400 μLを添加し、アッセイプレートを37°C、10%CO2 インキュベーターに入れます。 ex vivo 組織培養の場合は、ピペットを使用して培地を慎重に除去します。吸引は絶対に使用しないでください。
注:または、制御および刺激媒体を備えた2番目のプレートを準備し、組織を移します。 - t = 1、2、3、および4時間で、200 μLの培地を収集し、200 μLの適切なコントロールまたは刺激培地と交換し、アッセイプレートをインキュベーターに戻します。回収プレートは4°Cで保管してください。 BSA メディアの FFA バッファリング容量を判別するには、24 時間後に追加のコレクションを使用します。
注:実験はここで停止でき、収集した培地は-20°Cで保存できます。
- t = 0で、培地を除去し、コントロールまたは刺激培地のウェルあたり400 μLを添加し、アッセイプレートを37°C、10%CO2 インキュベーターに入れます。 ex vivo 組織培養の場合は、ピペットを使用して培地を慎重に除去します。吸引は絶対に使用しないでください。
4. FFA比色アッセイ
- 試薬を室温に温め、カラー試薬A1本を溶剤A1本、カラー試薬Bボトル1本を溶剤Bボトル1本に溶解します。再構成日から、これらの試薬は1週間以内に使用するのが最適です。再構成後1ヶ月で廃棄する。
- サンプルを解凍して混合します。
- 遊離曲線を作成します。標準溶液は1mMです。最大範囲では、試薬に25 μL、20 μL、15 μL、10 μL、10 μL(1:2希釈)、10 μL(1:4希釈)、10 μL(1:8希釈)、および10 μLの水を使用します。FFAレベルが低い場合は、1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM、および0.05 mMの標準10 μLがより適用できる場合があります。
- ピペット標準物質とサンプルを96ウェルアッセイプレートに入れます。推奨サンプル量は10 μLです。 バックグラウンド補正用のサンプルと同じ量のBSA培地を含む3つのウェルを含めます。
注:サンプル濃度が標準曲線の範囲外にある場合は、サンプル量を2〜25μLに調整してアッセイを繰り返します。 - 150 μLの試薬Aを各ウェルに加え、混合します。気泡の発生を避けてください。細かいゲージの針で泡をポップします。アッセイプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 550 nmおよび660 nmの基準でのプレートの吸光度を読み取ります(読み取りA)。
- 75 μLの試薬Bを各ウェルに加え、混合します。気泡の発生を避けてください。細かいゲージの針で泡をポップします。アッセイプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 550 nmおよび660 nmの基準でプレートの吸光度を再度読み取ります(読み取り値B)。
5.グリセロール比色アッセイ
- 遊離グリセロール試薬を36mLの超純水で再構成し、室温に順応させます。これらの試薬は数週間以内に使用するのが最適です。再構成後2ヶ月で廃棄する。
- サンプルを解凍して混合します。
- グリセロール標準溶液と水ブランクの7点、2倍段階希釈を行うことにより、グリセロール標準曲線を作成します。
注:標準曲線は、2.8 mMグリセロールの25 μLまでは比較的直線的ですが、高濃度では線形ではありません。 - 標準およびサンプルのそれぞれ25 μLを96ウェルアッセイプレートにピペットで入れます。バックグラウンド補正のためにBSA培地に3つのウェルを含めます。
- 175 μLの遊離グリセロール試薬を各ウェルに加え、混合します。気泡の発生を避けてください。細かいゲージの針で泡をポップします。アッセイプレートを37°Cで5分間インキュベートします。
- 540 nmでのプレートの吸光度を読み取ります。
6. 脂肪分解率の計算
- 光学濃度(OD)値から始めます。グリセロールの場合、A540 OD値を直接使用します。以下の式に従ってFFAアッセイのODを計算します。
OD = (読み取り値 B: A 550 - A 660) - (読み取り値 A: A550 - A660) - 検量線を使用して、収集されたサンプルのFFAおよびグリセロールレベルを計算します。標準OD値をy軸にプロットし、x軸にはサンプル量に対する標準濃度を使用します(つまり、10 μLサンプルのプレート上の20 μLの1 mM FFA標準を含むウェルの濃度は2 mMに等しくなります)。線形近似曲線を当てはめる:
y = mx + b - 検量線を目視検査し、アッセイの直線範囲外の点を取り除きます。次の式を使用してサンプル濃度を計算します。
サンプル濃度: x = (外径 - b) ÷ m - 線形アッセイ範囲外のサンプルを調整して再アッセイします。最終サンプル濃度を取得するには、サンプルの濃度からBSA培地のみを含むバックグラウンドウェルの濃度を差し引きます。
- 次の式に従って、各時点で各サンプルによって生成されたFFAとグリセロールのモルを計算します。
ここで、C n =時間t = nにおける濃度。Vt =ウェル内の総体積。Vs =サンプル収集量。Mn=時間t = nで生成されたモル(濃度がmMで容量がmLの場合、出力はμMolです)。
たとえば、さまざまな時点で:
M 1 = C1 × Vt
m 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
又は
M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s - 各サンプルの組織重量をグラム単位で割って組織重量に正規化し、μmol/gの単位を取得します。培養細胞の場合、値はμmol/ウェルとして提示されます。細胞数と分化効率がウェルからウェルに匹敵することを確認してください。
注:増殖または分化効率の違いは結果の解釈を複雑にし、別の正規化方法を必要とします(例:タンパク質への正規化;議論を参照)。 - 各サンプルについて、生成されたμmol/g(y軸)と時間(x軸)の傾きを個別に計算します。
- スプレッドシートでは、これは =SLOPE(known_ys,known_xs) 関数を使用して実行できます。新しいセルに「= SLOPE」と入力します(次に、カーソルを使用してサンプルグリセロールまたはFFA値をμmol / gで強調表示してから、対応する時間値を強調表示します)。
- データの線形性を確認します。R2 値は、サンプルの線形性を決定するための迅速な方法です。スプレッドシートでは、これは手順 6.7.1 で説明したのと同じ方法で =RSQ(known_ys,known_xs) 関数を使用して実行できますが、最初の入力は =RSQ です。R2 値が 0.98 >ていることを確認します。値が小さいほど、線形性からの偏差を示します。これは、測定/サンプリング誤差または直線性の損失に起因する可能性があります。
- 線形性を検定する別の方法は、各サンプルに対して線形回帰を実行し、残差をプロットすることです。統計解析ソフトウェアで、各時点の単一のY値を持つXYテーブルを生成します。単純線形回帰分析を選択し>OKをクリックする前に残差プロットのボックスを選択します。残差プロットが新しいグラフとして表示されます。
- 各サンプルのFFAとグリセロールの生成速度(つまり、傾き[(μmol / g / h]))を個々のデータポイントとして使用して統計分析を実行し、異なる脂肪分解条件が比較されている場合は値をプロットします。脂肪分解率が遺伝子型間で比較されている場合は、技術的な反復として動物ごとに2つまたは3つのサンプルを使用し、サンプルサイズが動物の数と等しくなるように、動物ごとに1つのデータポイントの平均を使用します。
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Representative Results
in vitro分化脂肪細胞の基礎脂肪分解率および刺激脂肪分解率を測定した。鼠径部白色脂肪組織由来の初代前駆脂肪細胞を、5 μMデキサメタゾン、0.5 mM IBMX、1 μg/mLインスリン、および1 μMトログリタゾンで4日間処理し、さらに1 μg/mLインスリンで3日間処理することにより脂肪細胞に分化させた。細胞を、脂肪分解アッセイの前にインスリンを含まない培地中で24時間インキュベートした。時間=0hで、細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、10μM CL−316,243またはビヒクルコントロールのいずれかを含む2%BSAを有するフェノールレッドフリーDMEMを、12ウェルプレートの各ウェルに添加した。時間= 1時間、2時間、3時間、および4時間で、培地の50%を回収し、フェノールレッドフリーDMEM中の2%BSAと交換した。回収した培地中のFFAおよびグリセロールレベルおよびFFAのモルを測定し、培地中に分泌されたグリセロールを各時点で計算した(図2A、B)。FFAおよびグリセロール産生は4時間アッセイで直線的であり、R2値は0.98以上であった。4時間のFFAレベルはわずかに低く、脂肪分解速度が鈍化している可能性があることを示しています。ただし、4時間時点の有無にかかわらず分析しても、計算された脂肪分解率に大きな影響を与えませんでした。誘導脂肪分解率は基礎率よりも有意に高かった(図2C)。脂肪分解刺激は、有意な再取り込みまたは保持なしに完全なトリグリセリド脂肪分解から予想されるように、収集されたすべてのサンプルでほぼ3:1のモル比でFFAとグリセロールの生成をもたらしました(図2D)。しかし、非刺激細胞では、比率は1に近く、グリセロール48,49,50の非脂肪分解源を示唆しています。
図2: in vitro で分化した初代脂肪細胞における脂肪分解率。 脂肪前駆細胞は12ウェルプレートで分化させた。インスリンは、脂肪分解アッセイの24時間前に培地から除去された。時間= 0時間で、細胞を10μM CL-316,243(CL)で刺激するか、またはビヒクル(V)コントロール培地で処理した。各時点までに各ウェルで産生された(A)FFAおよび(B)グリセロールのnmolを経時的にプロットし、線形回帰直線を個々のウェルごとにフィッティングした。(C)遊離脂肪酸の生産率。(d)グリセロール産生率。データはSEM±平均値として表される。 (E)各時点で収集された培地中のFFA:グリセロールのモル比。(C)および(D)の統計分析は、スチューデントのt検定を使用して実行されました。CLの効果はα = 0.05で有意であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細胞培養では、単層の細胞は培地と直接接触しているが、ex vivoで培養された組織では、中央の細胞は培地と接触していない。したがって、ex vivo培養では、FFAは組織内に保持される可能性が高くなります。表面積と体積の比率が低い組織の塊が大きいほど、FFA保持率が高くなり、FFA:グリセロールのモル比が低くなります(図3A)。組織の塊のサイズが小さくなると、放出されるFFA:グリセロールのモル比は3:1に近づきます(図3A)。ただし、組織の塊が小さすぎる場合もあります。脂肪組織の小さな断片を扱うという課題に加えて、脂肪組織の1〜2 mgの塊は脂肪分解率の低下を示し、組織の生存率と機能の低下を示唆しています(図3B、C)。脂肪組織を一貫したサイズと形状の塊に切断するのは面倒で時間がかかりますが、同等で信頼性の高い結果を得る必要があります。脂肪組織の5〜10mgの塊をお勧めしますが、一貫性が最も重要です。脂肪分解速度は、より大きな組織チャンクで再現性よく測定できますが、FFAによる脂肪分解のフィードバック阻害を考慮することが重要です63、64、65、66、67。
図3:FFA放出と脂肪分解速度に対する組織チャンクサイズの影響。 高脂肪食を与えられた雌のC57Bl/6Jマウスからの生殖腺白色脂肪組織を採取し、様々なサイズの塊に切断した。すべてのウェルには合計25〜30 mgの脂肪組織が含まれていました。25 mgウェルの場合、これは組織の1つの塊でした。10 mgウェルにはそれぞれ~10 mgの組織のチャンクが3つあり、5 mgのウェルには5つまたは6つの組織のチャンクが含まれ、2 mgのウェルには13〜16個のチャンクが含まれていました。時間=0時間で、脂肪分解を0.5μM CL−316,243(CL)で刺激するか、または対照ウェルをビヒクル(V)で処理した。1時間、2時間、および3時間後に収集されたサンプルから計算された脂肪分解率は、(A)FFAおよび(B)グリセロールについてプロットされます。(c)FFA:グリセロールのモル比は各ウェルで生産される。データはSEM±平均値として表され、(A)および(B)の統計解析は、ホルム・シダック事後分析を伴う二元配置分散分析を用いて実施され、α=0.05であった。CLの効果はすべてのサンプルで有意でした。CL処理サンプル内では、FFAとグリセロール産生の速度は、10 mgサンプルと5 mgサンプルを除いて、すべてのペアワイズ比較で有意に異なっていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
FFA保持の悪影響は、刺激時にFFAとグリセロールの両方の産生率が低い25 mgの組織チャンクで観察できます(図3B、C)。このフィードバック阻害は、培地のFFA結合能が低すぎる場合(すなわち、培地中に十分なBSAがない場合)にも明らかである。培地中のBSAを0.5%に減少させると、FFA放出は4倍以上減少し、グリセロール放出はほぼ2倍減少した(図4A、B)。簡単な経験則として、培地中のFFAのマイクロモルレベルは、培地中のBSAの割合に近づいてはいけません(すなわち、FFAレベルは、5%BSA培地では5 mM FFA、0.5%BSA培地では0.5 mM未満にとどまるべきです[このレベルでは、FFA:BSAのモル比は20:3です])。BSA培地調製の最大BSA緩衝能をテストするには、24時間刺激されたサンプルから培地を収集し、FFAの濃度を測定します(濃度が高くなるため、サンプル量を減らすか、サンプル希釈することをお勧めします)。24時間刺激後の5%BSA培地のFFA蓄積は約5 mMでしたが、0.5%BSA培地のFFA含有量はわずか0.6 mMでした(図4C)。採取した培地中のFFA濃度を見ると、FFA結合能が0.5%BSA培地では過負荷になっていることがわかる(図4D)。5%BSAメディアのFFAレベルははるかに高いですが、メディアのバッファリング容量を超えることはありません(図4D)。理想的には、培地中のFFA濃度は3:1のFFA:BSAモル比(すなわち、5%[0.75mM]BSA中の2.3mM FFA)未満に保たれるべきである。
図4:不十分なBSAレベルは、見かけの脂肪分解率の低下をもたらします。高脂肪食を給餌した雌のC57Bl/6Jマウスから生殖腺白色脂肪組織を採取し、~5 mgの塊に切断した。合計20〜30mgの脂肪組織を各ウェルに入れた。時間= 0時間で、脂肪分解を0.5 μM CL-316,243(CL)で刺激するか、または対照ウェルを5%BSA培地または0.5%BSAのみを含む培地のいずれかでビヒクル(V)で処理しました。4時間後に収集されたサンプルから計算された脂肪分解率は、(A)FFAおよび(B)グリセロールについてプロットされます。CLの効果はすべてのサンプルで有意でした。CL処理サンプル内では、FFAとグリセロールの両方の産生率は、5%と0.5%のBSA培地条件の間で有意に異なっていました。(C)24時間後の刺激ウェルからの培地中のFFAレベル。 (D)4時間後に収集されたサンプル中のFFAレベル。 (E)DMEMにおける5%BSAの様々な調製の有無にかかわらずFFA標準曲線。光学濃度は、(読み取り値B:A550-A660)-(読み取り値A:A550-A660)として算出される。(F)BSAの有無にかかわらずグリセロール標準曲線。光学濃度は540nm(A540)の吸収剤である。5.6 mMでのOD値は線形ではなかったため、検量線に含まれていませんでした。(G)アッセイ培地中の異なるタイプのBSAを使用した女性の性腺脂肪組織からのFFA放出の速度。±(A)および(B)の統計解析は、ホルム・シダック事後分析による二元配置分散分析を用いて行い、*p値は0.05<。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
BSAのいくつかの製剤にはFFAが含まれていることを指摘することが重要です。BSAの各ロットは、FFA含有量が無視できることを確認するためにテストする必要があります(一部のBSA製剤はFFAフリーとして販売されていることに注意してください)。FFAフリーとして特に販売されていませんが、ここで使用されているBSAには検出可能なFFAは含まれていません。FFAフリーBSA(エクイテックバイオ社、BAH66)、ここでの実験で使用したBSA(シグマ、A9418)、および粗い(より安価な)フラクションV BSA(シグマ、810531)を含むアッセイ培地をテストしました。FFAフリーのBSAとA9418 BSAはどちらもバックグラウンド信号を生成せず、標準曲線の傾きやインターセプトも変化しませんでした。標準曲線は重ね合わせ可能であった(図4E)。BSA DMEMの影響は、グリセロール標準曲線にも観察されなかった(図4F)。一方、フラクションVBSAは、FFAアッセイでバックグラウンドシグナルを生成し、これは0.3 mMのFFA濃度に相当します(図4E)。この背景は標準曲線を上にシフトしましたが、傾きに大きな影響を与えず、背景減算で十分であることを示しています。また、これら3種類のBSAを用いて刺激脂肪分解実験を行ったところ、バックグラウンド減算後、計算された脂肪分解速度はBSA製剤間で異ならないことがわかりました(図4F)。しかしながら、これはしばしば当てはまらず、特に脂肪分解の速度に影響を与えるインスリンまたは他の成分を容易に含むことができる純度の低いBSA調製物ではそうではない。BSAの各ロットは、テストおよび検証され、一貫して使用されるべきです(つまり、異なるロットのBSAでアッセイされたサンプルは比較できません)。BSAの各ロットを検証する際には、BSAとDMEMを添加した完全な標準曲線を実行して、比色アッセイの酵素に干渉するものが含まれていないことを確認する必要があります。
シリアルサンプルを採取し、ボリュームを新しいメディアと交換することで、実験全体を通して培地のFFA負荷を下げることができます。高脂肪食を4ヶ月間与えた雌マウスの性腺脂肪組織の脂肪分解率を測定しました。この実験では、5〜8 mgの組織チャンク(総重量25〜30 mg)を200 μLの5%BSA培地中でインキュベートし、100 μLを回収し、1時間、2時間、3時間、および4時間で交換し、収集された培地中のFFAおよびグリセロールレベルを測定しました。3時間で、培地のFFAレベルは2.3mMの危険ゾーンに達しました(図5A)。脂肪分解のフィードバック阻害は、4時間での培地FFAおよびグリセロールレベルの増加の欠如によって示唆された(図5A、B)。各時点で放出されたFFAとグリセロールのμmolを計算し、線形曲線を当てはめた後、刺激されたサンプルでは脂肪分解率が4時間で低下し始め、R2 値はFFAで0.976、グリセロールで0.983と低いことが明らかです(図5C、D)。残差プロットを見ると、4時間の値が線形トレンドを下回っている(つまり、残差が負である)ことは明らかです(図5E、F)。4時間の時点を除外すると、FFAおよびグリセロールについてR2 値がそれぞれ0.997および0.998以上に増加した。4時間の時点を含めると、計算されたFFAおよびグリセロール放出速度はわずかではあるが有意に低下する(図5G、H)。
図5: 生体外 脂肪組織における線形脂肪分解率の計算。 高脂肪食を給餌した雌のC57Bl/6Jマウスから生殖腺白色脂肪組織を採取し、~5 mgの塊に切断した。合計20〜30mgの脂肪組織を各ウェルに入れた。時間=0時間で、脂肪分解を0.5μM CL−316,243(CL)で刺激するか、または対照ウェルをビヒクル(V)で処理した。培地収集は、1時間、2時間、3時間、および4時間で実施した。 (A)FFAおよび(B)培地中のグリセロールレベル。(C)FFAおよび(D)グリセロール産生量を経時的にプロットした。経時的な(E)FFAおよび(F)グリセロール生成のための残留プレート。(G)FFAおよび(H)グリセロールの放出速度は、4時間時点の有無にかかわらず計算される。(I)女性の性腺脂肪組織におけるFFA放出。メディアのほぼ50%が1時間、2時間、3時間で変化しました。時間の間に、15分の時点は、交換なしでメディアの2.75%を収集しました。±(G)および(H)の統計解析は、ホルム・シダック事後分析による二元配置分散分析を用いて行い、* p 値は0.05<。CLの効果は全てのサンプルで有意であった(p 値<0.05)。CL処理サンプル内では、FFAとグリセロールの両方の産生速度は、4時間時点の有無にかかわらず計算間で有意に異なっていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
以前のプロトコルとは異なり、このプロトコルは複数の時点を利用して脂肪分解率を決定するため、測定誤差が減少し、脂肪分解の線形速度が測定されていることを内部検証できます。各収集ポイントで線形相の脂肪分解を維持するために、培地の50%が収集され、交換されます。直線性が重要であるため、新鮮な培地の添加が各添加で脂肪分解のバーストを引き起こさないようにしたいと考えました。時点間の線形性を検証するために、1時間から3時間までの毎時時点の間で15分ごとに非常に小さなサンプル(2.75%)を置換せずに採取しました。1時間、2時間、および3時間で、通常の50%のサンプル収集が行われ、交換されました。FFA放出の速度は、通常の時点間で線形であり、新鮮な培地を添加するたびに脂肪分解のバーストがなかったことを示しています(図5I)。
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Discussion
ここでは、脂肪細胞およびex vivo脂肪組織における脂肪分解の速度を測定するための基本的なプロトコルを提供します。脂肪分解を定量化するためには、線形相における脂肪分解率を測定することが重要です。シリアルサンプリング技術を使用しており、メディアの大部分が収集され、定期的に新しいメディアに置き換えられます。この半保存的方法は、FFA緩衝能を有する新鮮なBSAの添加を可能にし、フィードバック阻害を遅らせ、線形脂肪分解の持続時間を延長する。この実験デザインは、in vivoでの脂肪組織の血管新生を再現しようと試み、新鮮なアルブミンを送達して放出されたFFA75を結合します。このプロトコルは、in vitroで分化したマウスex vivo白色脂肪組織および鼠径脂肪組織初代前駆脂肪細胞における脂肪分解を測定するために最適化されました。このプロトコルは、茶色やベージュ色の脂肪集積所だけでなく、他の生物の脂肪組織や脂肪生成性の高い不死化細胞株でもうまく機能するように最適化できます。このプロトコルは、ex vivoアッセイのための脂肪組織の収集前のマウスの年齢、性別、および食事の柔軟性を可能にします。絶食などの一部の操作は基礎脂肪分解率に影響を与える可能性がありますが、食事誘発性肥満などの他の介入も刺激された脂肪分解の速度に影響を与えます。
プロトコルは、脂肪分解率が高いか低いかに応じて、実験システムごとに最適化する必要があります。線形性を検証するには、R2値を計算し、残差プロットを確認することをお勧めします。R2の値は1に非常に近いはずです。残差プロットを評価するときは、脂肪分解率が低下し、線形性が失われていることを示しているため、後の時点で負の残差値に注意する必要があります。このような残差プロットの例を図5E,Fに示します。この場合の4時間の時点を排除することは、線形脂肪分解速度のより正確な計算を提供し、R2値を改善する。しかし、速度は複数の時点から計算されるため、比較的頑健であり、そのような時点を含めることは、R2値および計算された脂肪分解速度にわずかな影響しか及ぼさない。脂肪分解率の計算に単一の時点を使用すると、データがより簡単に歪む可能性があります。
データの正規化方法も、サンプル間の相対的な結果に影響を与える可能性があります。ここでは、 ex vivo 組織をin vitro で分化した組織重量と初代前駆脂肪細胞をウェルあたりに正規化することをお勧めします。ただし、これらの正規化手法は、すべての実験システムに適しているとは限りません。重要なことに、増殖速度または分化効率が群間で異なる場合、ウェル当たりの正規化は適切ではない。代替の正規化技術には、タンパク質、脂質、およびDNAが含まれます。正規化の各方法には、それぞれ長所と短所があります。組織重量とウェル正規化はシンプルで簡単です。脂肪細胞サイズの違いは、除脂肪組織が肥満脂肪組織よりもグラムあたり多くの脂肪細胞を含むことを意味する可能性がありますが、分化効率の違いは、ウェルあたりの脂肪細胞の数に違いをもたらす可能性があります。脂質は有機溶媒(2:1クロロホルム:メタノール[v/v]など)で抽出でき、比色試薬を使用してトリグリセリド含有量を測定します。脂質含有量への正規化は伝統的に使用されている方法ではありませんが、脂肪滴は結局のところ、脂肪分解を受けている細胞小器官であり、この正規化方法は脂肪細胞に特異的であり、細胞間で分化率が異なる場合に役立ちます。脂質抽出後、0.1〜0.3N NaOHを使用してタンパク質を抽出することができ、その後、ブラッドフォードまたはBCAタンパク質アッセイ68によってアッセイすることができます。あるいは、サンプルを溶解緩衝液中でホモジナイズし、遠心分離70によって脂質画分を除去することができる。脂質汚染はタンパク質アッセイに干渉することに注意してください。タンパク質を標準化に使用する場合は、アッセイ培地からBSAを除去するために、細胞を広範囲に(少なくとも3回)洗浄する必要があります。時々、分化した脂肪細胞はプレートにうまく接着せず、過剰なBSAを除去するために必要な3回の洗浄に耐えられない。DNAへの正規化は、細胞数への正規化を可能にし、市販のDNA抽出キットを用いて実行し、続いて、遺伝子コピー数の吸光度またはリアルタイムPCR分析によって全DNAを定量することができる。あるいは、プレーティング細胞では、DAPI染色とそれに続くイメージングを使用して核をカウントし、細胞数に正規化することができます。細胞数またはタンパク質を用いて標準化する場合、試料中の非脂肪細胞を考慮することが重要である。脂肪組織には免疫細胞と内皮細胞も含まれています。肥満脂肪組織では、炎症と肥大により、成熟脂肪細胞に由来する核は10個に1個に過ぎません。しかしながら、脂肪細胞は依然として組織の質量および脂質含有量の大部分に寄与している。 in vitro で分化した前駆脂肪細胞の場合、分化効率は成熟脂肪細胞の相対的な割合に影響を与えます。この場合、正規化は複雑になります。理想的には、細胞を脂肪分解アッセイに利用する前に、分化効率を最適化する必要があります。不可能な場合、脂肪滴量が分化脂肪細胞間で類似している場合は、脂質含有量の正規化が推奨されます。分化が等しくない脂肪細胞培養物全体の脂肪分解率を比較すると、駆動因子が実際に脂肪生成である場合、脂肪分解について誤った結論が生じる可能性があります。これはプロトコルの制限です。
長鎖FFAは脂肪分解をフィードバック阻害する63,64,65,66,67。FFAは、メディアに十分に隔離されていない場合に蓄積されます。脂肪分解の測定の最適化に関連するトラブルシューティングの多くは、FFA保持の最小化に関連しています。培地へのFFA:グリセロール放出のモル比を計算することは、FFA保持に関連する問題を特定するのに役立ちます。FFA:グリセロールのモル比が3:1の場合、脂肪分解のすべての生成物が放出され、培地に捕捉されますが、2:1未満の比率は懸念の理由です。ex vivoアッセイの重要な考慮事項は、脂肪組織チャンクのサイズです。組織の塊が大きいほど表面積と体積の比率が低いため、FFAを保持し、結果として脂肪分解率が低下する可能性が高くなります(図4A、B)。これを念頭に置いて、各サンプルの脂肪組織を一貫したサイズと形状のチャンクに切断することが重要です。メディア内の FFA 隔離を容易にするために、放出された FFA を結合するのに十分な BSA がメディアに含まれていることを確認することも重要です。培地のFFA緩衝能は、BSAの濃度を増加させるか、または培地の体積を増加させることによって増加させることができる。収集量または頻度を増やすことも同様に効果的です。脂肪分解率が高いが、FFA:グリセロール比が2:1未満の場合は、収集頻度を30分ごとに増やし、アッセイを2.5時間で停止することをお勧めします。
ここで提供されるプロトコルは、マウスex vivo白色脂肪組織およびin vitroで分化した初代前脂肪細胞に最適化されており、どちらも脂肪分解性が高い。アッセイは、他のシステムで脂肪分解を測定するため、または比較的低い脂肪分解率の違いが特に興味深い場合に最適化する必要があります。例えば、3T3−L1脂肪細胞は、より低い脂肪分解活性を有する32。脂肪分解率が低い場合は、インキュベーション量を減らす必要があります(つまり、24ウェルプレートでウェルあたり400 μLの代わりに、24ウェルプレートで200 μLを使用するか、12ウェルプレートで300 μLを使用し、時点ごとに100〜150 μLを採取する必要があります)。低いFFAおよびグリセロールレベルを正確に測定するには、より大きなサンプル容量が必要であるため、収集量は100μLを下回らないようにする必要があります。サンプルあたり50 μLの培地を使用してグリセロールをアッセイするには、遊離グリセロール試薬を31 mLの水に溶解し、各ウェルで50 μLのサンプルとともに150 μLの試薬を使用する必要があります。FFAレベルは、直線性が維持されている限り、ウェルあたり25 μLのサンプルで測定できます。時刻点を延長して信号を増やすこともできます。白色脂肪細胞以外の細胞からの脂肪分解率をアッセイする場合、細胞代謝の違いを考慮する必要があります。例えば、褐色およびベージュ色の脂肪細胞は、はるかに高いレベルのグリセロールキナーゼを発現し、したがって脂肪分解によってグリセロール放出を保持することができる76,77。これらの代謝的に活性な細胞はまた、放出された脂肪酸を培地に放出することなく異化経路または合成経路に導くことができるかもしれない。特に白色脂肪細胞以外の細胞型において、脂肪分解アッセイの結果を解釈する際には、アッセイ対象の特定の細胞型におけるFFAおよびグリセロールの代謝運命を考慮する必要があります。他の細胞タイプの脂肪分解アッセイは、最適化と検証が必要です。
このプロトコルは、マウスモデルにおける脂肪溶解率の違いを評価するように設計されています。 in vitro で分化した初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞における遺伝子操作または薬理学的治療の細胞自律的効果を調べるための有用なツールです。一方、脂肪組織には、免疫細胞を含む他の細胞型が含まれています。脂肪分解の調節における脂肪組織免疫細胞の影響は、全組織脂肪分解を評価する際に考慮することが重要です。培養脂肪細胞脂肪分解モデルは、免疫細胞の潜在的な複雑な影響を回避し、特定の細胞タイプの徹底的な調査を可能にする可能性があり、脂肪組織外植片は in vivo 環境とのより堅牢な比較を可能にします。さらに、 ex vivo アッセイは、さまざまな脂肪デポにおける脂肪分解率を調査するために使用できます。これらの系において、脂肪分解は、β-アドレナリン受容体アゴニストなどの化合物によって刺激され、したがって、 in vivo マウスモデルに影響を与え得る交感神経緊張の変化は観察されないであろう。脂肪分解の in vivo 測定は、全身のさまざまな組織におけるFFAおよびグリセロールの放出および取り込みのダイナミクスによって複雑になります。任意の時点での血清FFAおよびグリセロールレベルは分泌と取り込みのバランスであり、血清FFAおよびグリセロールレベルの変化が脂肪組織の脂肪分解のみに起因すると推定されるべきではありません。.空腹時誘発性脂肪分解は交感神経緊張の影響を受けますが、血清FFAまたはグリセロールレベルに急速で堅牢な変化を引き起こさないため、空腹時血清レベルのFFAおよびグリセロールの変化を解釈することは困難です。. in vivo 脂肪分解は、CL-316,243などのβ-3アドレナリン受容体アゴニストを使用して刺激することができ、刺激から20分以内に血清FFAおよびグリセロールの増加を検出できます。 in vivo 脂肪分解アッセイには、血清FFAとグリセロールのベースライン測定とビヒクルコントロールの両方を含める必要があります。このようにして、血清FFAおよびグリセロールレベルの刺激特異的変化を決定することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所の助成金R01DK126944によってS.M.R.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well tissue culture treated plate | Corning Inc | 3527 | Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation |
| 48-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353078 | Can be tissue culture treated |
| 6-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353046 | Can be tissue culture treated |
| 96-Well PCR Plate | USA sceintific | 1402-9100 | Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers |
| CO2 incubator | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermofischer | 11054020 | Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate |
| FFA-free Bovine serum albumin | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma Aldrich | G7793 | This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration |
| HR Series NEFA Standard Solution | Fujifilm | 276-76491 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A | Fujifilm | 999-34691 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B | Fujifilm | 991-34891 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Solvent A | Fujifilm | 995-34791 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Solvent B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Microbiological Incubator | Fischer Scientific | S28668 | Any incubator at 37C can be used |
| Nunc MicroWell 96-Well Plates | Thermo Scientific | 269620 | Any optically clear, flat bottom 96-well plate works |
| Silicone Laboratory Benchtop Mat | VWR | 76045-300 | Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended |
| Spectrophotometer/Microplate Reader | Molecular devices | SpectraMax i3x | Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work |
| V Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Wipers | Kimberly-Clark | 41200 | Any high quality paper towel will work |
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