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Biology

in vitroで分化したマウス脂肪組織および初代前駆脂肪細胞における脂肪分解の速度の測定

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65106
,
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine,Weill Cornell Medicine

Summary

脂肪細胞におけるトリグリセリド脂肪分解は、遊離脂肪酸およびグリセロールの遊離をもたらす重要な代謝プロセスである。ここでは、マウスの脂肪細胞および ex vivo 脂肪組織における基礎脂肪分解および刺激脂肪分解を測定するための詳細なプロトコルを提供します。

Abstract

脂肪細胞は脂肪滴中にトリグリセリドの形でエネルギーを蓄えます。このエネルギーは脂肪分解 を介して 動員することができ、そこでは脂肪酸側鎖がグリセロール骨格から順次切断され、遊離脂肪酸およびグリセロールの放出をもたらす。白色脂肪細胞におけるグリセロールキナーゼの発現が低いため、グリセロールの再取り込み速度はごくわずかですが、脂肪酸の再取り込みはアルブミンなどの培地成分の脂肪酸結合能力によって決まります。培地へのグリセロールおよび脂肪酸放出の両方を比色アッセイによって定量し、脂肪分解率を決定することができる。これらの因子を複数の時点で測定することにより、脂肪分解の線形速度を高い信頼性で決定できます。ここでは、マウス由来の in vitro 分化脂肪細胞および ex vivo 脂肪組織における脂肪分解の測定のための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、他の脂肪前駆細胞株または他の生物由来の脂肪組織に対しても最適化され得る。考慮事項と最適化パラメーターについて説明します。このプロトコルは、マウスモデルと治療の間の脂肪細胞脂肪分解の速度を決定および比較するのに役立つように設計されています。

Introduction

過剰な栄養素は、脂肪滴の中性脂質コア中のトリグリセリドの形で白色脂肪組織に貯蔵される。トリグリセリド貯蔵は、脂肪組織トリグリセリドリパーゼ(ATGL)、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)、およびモノグリセリドリパーゼ(MGL)によって脂肪酸側鎖が順次切断され、遊離脂肪酸(FFA)およびグリセロール骨格が放出されるプロセスである脂肪分解を介して動員される1,2。脂肪分解は、脂肪組織のカテコールアミンシグナル伝達によって活性化されます。交感神経終末はカテコールアミンを局所的に放出し、カテコールアミンは脂肪細胞原形質膜上のβアドレナリン作動性受容体に結合する。リガンドが結合すると、これらのGタンパク質共役受容体(GPCR)はGαsを介してアデニリルシクラーゼを活性化します。その後のcAMPによるプロテインキナーゼA(PKA)の活性化は、ATGLおよびHSLの両方のアップレギュレーションをもたらす。PKAによるペリリピン-1のリン酸化は、ATGL3に結合して共活性化するABHD5(CGI-58としても知られる)の解離を引き起こす。PKAはHSLを直接リン酸化し、細胞質ゾルから脂肪滴への転座を促進し、リン酸化ペリリピン-1との相互作用によりリパーゼ活性がさらに促進されます4,5,6,7。脂肪分解に関与する3番目のリパーゼであるMGLは、カテコールアミンシグナル伝達によって調節されていないようです8。重要なことに、脂肪細胞におけるトリグリセリド合成は、中間体としてのモノグリセリドの形成を伴わないグリセロール脂質合成経路によって媒介される。代わりに、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼはリゾホスファチジン酸の形成を触媒し、リゾホスファチジン酸は別の脂肪酸アシルCoAと結合してホスファチジン酸を形成し、トリグリセリドの最終合成前にジグリセリドに異性化します(図1)9,10,11。

Figure 1
図1:脂肪分解とグリセロール脂質合成経路。 上:脂肪分解経路;赤で示されている酵素:脂肪組織トリグリセリドリドリパーゼ(ATGL)、ホルモン感受性リパーゼ(HSL)、およびモノグリセリドリパーゼ(MGL)。下:グリセロール脂質合成経路;緑色で示されている酵素:ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAT、LPAATとしても知られています)、およびグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)。脂質:トリグリセリド(TG)、ジグリセリド(DG)、モノグリセリド(MG)、遊離脂肪酸(FFA)、脂肪酸アシルCoA(FA-CoA)、リゾホスファチジン酸(LPA)、およびホスファチジン酸(PA)。他の代謝産物:無機リン酸(Pi)およびグリセロール3-リン酸(G3P)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞外アデノシンは脂肪分解のもう一つの重要な調節因子であり、GsおよびGi結合GPCRを介してアデニルシクラーゼ活性に影響を与えます。脂肪細胞における優勢なアデノシン受容体であるADORA1は、アデニリルシクラーゼを阻害し、したがってGi12の活性化を介して脂肪分解を阻害します。ADORA2Aは、より低いレベルで、主に褐色脂肪細胞で発現し、Gsシグナル伝達を介して脂肪分解を活性化します13。ADORA1は、基礎脂肪分解とアドレナリン作動薬に対する反応の両方に影響を与えます。.脂肪分解に対するアデノシンの効果は、アデノシンを中和するためのアデノシンデアミナーゼ、ならびにADORA1特異的アゴニストフェニルイソプロピルアデノシン14,15を添加することによって制御することができる。Gq結合GPCRのホルモン活性化は、ホスホリパーゼCおよびプロテインキナーゼC 16,17,18,19の活性化を介して脂肪分解にも影響を及ぼし得る。炎症シグナルも脂肪分解率に影響を与えます。LPS(および他のエンドトキシン)によるTLR4活性化は、ペリリピン-1およびHSL20をリン酸化するERKを活性化することにより、脂肪分解率を増加させる。TNF-αはまた、ERKおよびNF-κB活性化、ならびにホスホジエステラーゼPDE-3BおよびCIDEC21,22,23の転写ダウンレギュレーションを介して脂肪分解を活性化します。IL-6はまた、特に腸間膜脂肪組織における脂肪細胞脂肪分解の増加と関連しており、そのFFA放出は肝脂肪症および糖新生に影響を及ぼす24,25,26。

脂肪分解は、インスリンによって摂食状態の間に抑制される。AKTはPDE-3Bをリン酸化して活性化し、cAMPシグナル伝達を抑制し、PKA活性化を阻止します27。インスリンはまた、ATGL28を転写的にダウンレギュレートします。肥満は、脂肪細胞におけるβ-アドレナリン作動性受容体のダウンレギュレーションを含む様々なメカニズムを通じてカテコールアミン耐性を促進する29,30,31,32,33。脂肪細胞は、3つのβアドレナリン作動性受容体(β-1、β-2、およびβ-3)すべてを発現します。β-1およびβ-2アドレナリン受容体が遍在的に発現しているのに対し、β-3アドレナリン受容体は主にマウスの脂肪細胞で発現している34,35。Adrb3の発現は、脂肪生成中にC / EBPαによって誘導されます36。β-3アドレナリン受容体は成熟脂肪細胞で高度に発現しています。β-1およびβ-2アドレナリン作動性受容体の活性化は、β-アレスチン37によるフィードバック阻害による自己制限である。β-3アドレナリン作動性受容体のフィードバック阻害は、Adrb3発現を減少させる他のシグナル伝達経路によって媒介される33、38、39。

脂肪細胞の脂肪分解を活性化するために多数の化合物を使用することができる。カテコールアミンは、脂肪分解の主要な生理活性物質です。ノルエピネフリン(またはノルアドレナリン)およびエピネフリン(またはアドレナリン)は、3つのβアドレナリン受容体すべてを活性化する40。ノルエピネフリンおよびエピネフリンはまた、α-アドレナリン作動性受容体シグナル伝達 の活性化を介して 脂肪分解に影響を及ぼす41。一般的に使用されるβ-アドレナリン受容体アゴニストには、非選択的β-アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノール、ならびにβ-3アドレナリン受容体アゴニストCL-316,243およびミラベグロン42が含まれる。脂肪細胞が主にβ-3アドレナリン受容体を発現していることを考えると、ここでは例としてCL-316,243を使用します。β-3アドレナリン受容体に対するその特異性はまた、それを脂肪細胞カテコールアミンシグナル伝達の比較的特異的な活性化因子にし、それはまた、 in vivoで安全に使用することができる。細胞培養で一般的に使用される10 μM CL-316,243の濃度は、最大応答を達成するために必要な~0.1 μMの用量よりも桁違いに高いことに注意してください33。フォルスコリンはアドレナリン作動性受容体をバイパスし、アデニリルシクラーゼと下流の脂肪分解シグナル伝達を直接活性化します。脂肪分解の抑制剤と同様に、より多くの活性化剤があります。脂肪分解を刺激する化合物を選択する際には、受容体特異性と下流のシグナル伝達経路を実験デザイン内で慎重に検討する必要があります。

白色脂肪組織における脂肪分解の速度は、絶食または運動中の耐寒性と栄養素の利用可能性に影響を与える重要な代謝因子です43,44,45,46。このプロトコルの目的は、脂肪細胞と脂肪組織における脂肪分解の速度を測定することであり、脂肪細胞の代謝と、それがさまざまなマウスモデルの代謝表現型にどのように影響するかの理解を容易にします。脂肪分解率を定量化するために、培地中の脂肪分解生成物(すなわち、FFAおよびグリセロール)の出現を測定する。この方法は、脂肪細胞から培地への脂肪分解産物の放出に依存する。白色脂肪細胞は低レベルのグリセロールキナーゼを発現するので、グリセロール再取り込み率は低い47。逆に、脂肪分解以外の代謝経路によるFFAとグリセロールの生成も考慮する必要があります。脂肪細胞は、グリセロール-3リン酸に対する活性を有するホスファターゼを発現するようであり、グルコース48,49,50に由来するグリセロール-3-リン酸からのグリセロールの産生を可能にする。解糖系は、白色脂肪細胞のFFA再エステル化に使用されるグリセロール-3-リン酸の供給源です。グルコースレベルが制限されている場合、血糖新生には乳酸やピルビン酸などの他の3炭素源が必要です51。細胞内の脂肪分解によって放出されるFFAのチャネリングとその代謝運命はよくわかっていません。脂肪分解によって放出されたFFAは、再エステル化またはβ酸化を受ける前に、脂肪アシルCoAに変換する必要があります。脂肪分解によって放出されたFFAは、取り戻されて脂肪アシルCoAに変換される前に細胞から出る可能性が高いようです52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 .FFAはアルブミンによって細胞外に隔離することができます。重要なことに、長鎖FFAは、アルブミン63,64,65,66,67によって隔離されていない場合、脂肪分解をフィードバック阻害することが知られています。したがって、脂肪分解アッセイ中の培地のFFA緩衝能を最適化することは極めて重要である。ここで説明する手順は、マウスおよびヒト由来の脂肪細胞およびex vivo脂肪組織における脂肪分解率を測定するために以前に公開された方法と同様である15、68、69、70、71。このプロトコルは、シリアルサンプリングの使用によって異なります。シリアルサンプリングを行うことで、脂肪分解が線形相で測定されていることを内部で検証し、複数の測定を利用して脂肪分解の速度を計算することで、測定誤差を減らし、最終的な計算値の信頼性を高めることができます。シリアルサンプリングの欠点は、アッセイにより多くの時間と試薬が必要になることです。ただし、時間枠が長いほど、レートの推定値の標準誤差に対する測定誤差の影響が減少します。さらに、このプロトコルは、FFAとグリセロールの両方の放出を測定し、完全な脂肪分解および培地72への脂肪分解生成物の放出から予想されるように、3:1の比率を達成することを目標にFFA:グリセロール放出の比率を考慮します。

Protocol

すべての動物の使用は、コーネル大学のワイルコーネル医科大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. バッファーおよび回収プレートの調製 フェノールレッドを含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)100 mLに5 gのBSAを溶解して、5%ウシ血清アルブミン(BSA)を作ります。BSAを静かにかき混ぜて溶解します(振とうは逆効果?…

Representative Results

in vitro分化脂肪細胞の基礎脂肪分解率および刺激脂肪分解率を測定した。鼠径部白色脂肪組織由来の初代前駆脂肪細胞を、5 μMデキサメタゾン、0.5 mM IBMX、1 μg/mLインスリン、および1 μMトログリタゾンで4日間処理し、さらに1 μg/mLインスリンで3日間処理することにより脂肪細胞に分化させた。細胞を、脂肪分解アッセイの前にインスリンを含まない培地中で24時間インキュベートした。…

Discussion

ここでは、脂肪細胞およびex vivo脂肪組織における脂肪分解の速度を測定するための基本的なプロトコルを提供します。脂肪分解を定量化するためには、線形相における脂肪分解率を測定することが重要です。シリアルサンプリング技術を使用しており、メディアの大部分が収集され、定期的に新しいメディアに置き換えられます。この半保存的方法は、FFA緩衝能を有する新鮮なBSAの添…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国国立衛生研究所の助成金R01DK126944によってS.M.R.に支援されました。

Materials

24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work
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References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog–regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3′:5′-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. . Methods in Molecular Biology. , (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).
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