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Biology

Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106

Summary

A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.

Abstract

Os adipócitos armazenam energia na forma de triglicerídeos em gotículas lipídicas. Essa energia pode ser mobilizada via lipólise, onde as cadeias laterais dos ácidos graxos são sequencialmente clivadas da espinha dorsal do glicerol, resultando na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Devido à baixa expressão de glicerol quinase em adipócitos brancos, as taxas de recaptação de glicerol são desprezíveis, enquanto a recaptação de ácidos graxos é ditada pela capacidade de ligação de ácidos graxos de componentes do meio, como a albumina. Tanto a liberação de glicerol quanto de ácidos graxos em meios pode ser quantificada por ensaios colorimétricos para determinar a taxa lipolítica. Medindo esses fatores em vários momentos, pode-se determinar a taxa linear de lipólise com alta confiança. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a mensuração da lipólise em adipócitos diferenciados in vitro e tecido adiposo ex vivo de camundongos. Este protocolo também pode ser otimizado para outras linhagens celulares de pré-adipócitos ou tecido adiposo de outros organismos; considerações e parâmetros de otimização são discutidos. Este protocolo foi projetado para ser útil na determinação e comparação da taxa de lipólise de adipócitos entre modelos e tratamentos em camundongos.

Introduction

Os nutrientes em excesso são armazenados no tecido adiposo branco na forma de triglicerídeos no núcleo lipídico neutro das gotículas lipídicas. Os estoques de triglicérides são mobilizados via lipólise, processo pelo qual as cadeias laterais de ácidos graxos são sequencialmente clivadas por lipase triglicérides do tecido adiposo (ATGL), lipase hormônio-sensível (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL), resultando na liberação de ácidos graxos livres (AGL) e da espinha dorsal do glicerol 1,2. A lipólise é ativada pela sinalização de catecolaminas no tecido adiposo. Os terminais nervosos simpáticos liberam localmente catecolaminas, que se ligam aos receptores β-adrenérgicos na membrana plasmática dos adipócitos. Após a ligação do ligante, esses receptores acoplados à proteína G (GPCRs) ativam a adenilil ciclase via Gαs. A ativação subsequente da proteína quinase A (PKA) pelo AMPc resulta na regulação positiva tanto da ATGL quanto da HSL. A fosforilação da perilipina-1 pela PKA causa a dissociação da ABHD5 (também conhecida como CGI-58), que se liga e coativa a ATGL3. O PKA fosforila diretamente a HSL, promovendo sua translocação do citosol para a gota lipídica, onde a interação com a perilipina-1 fosforilada promove ainda mais sua atividade lipase 4,5,6,7. A terceira lipase envolvida na lipólise, a MGL, parece não ser regulada pela sinalização das catecolaminas8. É importante ressaltar que a síntese de triglicérides em adipócitos é mediada pela via de síntese lipídica do glicerol, que não envolve a formação de monoglicerídeos como intermediário; em vez disso, as glicerol-3-fosfato acilo transferases catalisam a formação de ácido lisofosfatídico, que é combinado com outro acil-CoA graxo para formar ácido fosfatídico e, em seguida, isomerizado em diglicerídeos antes da síntese final de triglicérides (Figura 1)9,10,11.

Figure 1
Figura 1: Vias de lipólise e síntese lipídica do glicerol. Topo: Via lipolítica; enzimas mostradas em vermelho: lipase triglicerídica do tecido adiposo (ATGL), lipase sensível ao hormônio (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL). Fundo: via de síntese lipídica do glicerol; enzimas mostradas em verde: diglicerídeos aciltransferase (DGAT), fosfatase do ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAT, também conhecido como LPAATs) e glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT). Lipídios: triglicerídeos (TG), diglicerídeos (DG), monoglicerídeos (MG), ácidos graxos livres (AGL), acil-CoA graxo (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) e ácido fosfatídico (AP). Outros metabólitos: fosfato inorgânico (Pi) e glicerol 3-fosfato (G3P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A adenosina extracelular é outro importante regulador da lipólise, atuando através de GPCRs acoplados a Gs e Gi para impactar a atividade da adenil ciclase. O receptor de adenosina predominante nos adipócitos, ADORA1, inibe a adenilil ciclase e, assim, a lipólise através da ativação de Gi12. Expressa em níveis mais baixos, e principalmente em adipócitos marrons, a ADORA2A ativa a lipólise via sinalizaçãode G s 13. ADORA1 afeta tanto a lipólise basal quanto a resposta aos agonistas adrenérgicos. O efeito da adenosina na lipólise pode ser controlado pela adição de adenosina desaminase para neutralizar a adenosina, assim como o agonista específico ADORA1 fenilisopropiladenosina14,15. A ativação hormonal de GPCRs acopladas a Gq também pode afetar a lipólise via ativação da fosfolipase C e da proteína quinase C16,17,18,19. Sinais inflamatórios também afetam as taxas lipolíticas. A ativação de TLR4 pelo LPS (e outras endotoxinas) aumenta a taxa lipolítica pela ativação da ERK, que fosforila perilipina-1 e HSL20. O TNF-α também ativa a lipólise via ativação de ERK e NF-κB, bem como downregulation transcricional da fosfodiesterase PDE-3B e CIDEC21,22,23. A IL-6 também tem sido associada ao aumento da lipólise dos adipócitos, especialmente no tecido adiposo mesentérico, cuja liberação de AGL afeta a esteatose hepática e a gliconeogênese24,25,26.

A lipólise é suprimida durante o estado alimentado pela insulina. AKT fosforila e ativa PDE-3B para suprimir a sinalização de AMPc e impedir a ativação de PKA27. A insulina também diminui transcricionalmente a ATGL28. A obesidade promove resistência às catecolaminas através de uma variedade de mecanismos, incluindo a diminuição da regulação dos receptores β-adrenérgicos nos adipócitos 29,30,31,32,33. Os adipócitos expressam os três receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 e β-3). Enquanto os receptores adrenérgicos β-1 e β-2 são expressos de forma ubíqua, o receptor adrenérgico β-3 é predominantemente expresso em adipócitos de camundongos34,35. A expressão de Adrb3 é induzida por C/EBPα durante a adipogênese36. O receptor adrenérgico β-3 é altamente expresso em adipócitos maduros. A ativação dos receptores adrenérgicos β-1 e β-2 é autolimitada devido à inibição por feedback pela β-arrestina37. A inibição por feedback do receptor adrenérgico β-3 é mediada por outras vias de sinalização, que reduzema expressão de Adrb33,38,39.

Numerosos compostos podem ser usados para ativar a lipólise dos adipócitos. As catecolaminas são os principais ativadores fisiológicos da lipólise. A noradrenalina (ou noradrenalina) e a epinefrina (ou adrenalina) ativam os três receptores β-adrenérgicos40. A noradrenalina e a adrenalina também afetam a lipólise via ativação da sinalização dos receptores α-adrenérgicos41. Os agonistas dos receptores β-adrenérgicos comumente usados incluem o isoproterenol, que é um agonista não seletivo dos receptores β-adrenérgicos, e os agonistas dos receptores adrenérgicos β-3 CL-316,243 e mirabegron42. Como os adipócitos expressam predominantemente o receptor adrenérgico β-3, utilizamos a CL-316,243 como exemplo. Sua especificidade para o receptor adrenérgico β-3 também o torna um ativador relativamente específico da sinalização de catecolaminas de adipócitos, que também pode ser usado com segurança in vivo. Note-se que a concentração comumente usada de 10 μM CL-316,243 em cultura celular é ordens de magnitude maior do que a dose de ~0,1 μM necessária para atingir uma resposta máxima33. Forskolin contorna o receptor adrenérgico, ativando diretamente adenilil ciclase e sinalização lipolítica a jusante. Existem muito mais ativadores, bem como supressores de lipólise. Ao selecionar um composto para estimular a lipólise, a especificidade do receptor e as vias de sinalização a jusante devem ser cuidadosamente consideradas dentro do planejamento experimental.

A taxa de lipólise no tecido adiposo branco é um importante fator metabólico que afeta a tolerância ao frio e a disponibilidade de nutrientes durante o jejum ou exercício43,44,45,46. O objetivo deste protocolo é medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo, o que facilitará o entendimento do metabolismo dos adipócitos e como ele pode afetar o fenótipo metabólico de vários modelos murinos. Para quantificar a taxa lipolítica, medimos a aparência dos produtos lipolíticos na mídia (i.e., AGL e glicerol). O método baseia-se na liberação de produtos lipolíticos do adipócito para o meio. Como os adipócitos brancos expressam baixos níveis de glicerol quinase, as taxas de recaptação do glicerol são baixas47. Por outro lado, a produção de AGL e glicerol por outras vias metabólicas que não a lipólise também deve ser considerada. Os adipócitos parecem expressar uma fosfatase com atividade contra o glicerol-3 fosfato, possibilitando a produção de glicerol a partir do glicerol-3-fosfato derivado da glicose48,49,50. A glicólise é uma fonte de glicerol-3-fosfato usado para reesterificação de AGL em adipócitos brancos. Quando os níveis de glicose são limitados, a gliceroneogênese requer outras fontes de carbono 3, como lactato e piruvato51. A canalização dos AGL liberados pela lipólise dentro da célula e seu destino metabólico é pouco compreendido; Os AGL liberados pela lipólise devem ser convertidos em acil-CoA graxo, antes de serem reesterificados ou submetidos à β-oxidação. Parece que os AGL liberados pela lipólise provavelmente saem da célula antes de serem retomados e convertidos em acil-CoA gorduroso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Os AGL podem ser sequestrados fora da célula pela albumina. É importante ressaltar que os AGL de cadeia longa são conhecidos por inibir a lipólise se não forem sequestrados pela albumina 63,64,65,66,67. Assim, a otimização da capacidade tampão dos AGL do meio durante o ensaio de lipólise é fundamental. O procedimento aqui descrito é semelhante aos métodos publicados anteriormente para medir a taxa lipolítica em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos e humanos 15,68,69,70,71. Esse protocolo difere pelo uso de amostragem seriada; Ao realizar amostragens seriadas, podemos validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e utilizar múltiplas medidas para calcular a taxa de lipólise, reduzindo assim o erro de medição para aumentar a confiança no valor final calculado. A desvantagem da amostragem seriada é que o ensaio requer mais tempo e reagentes; no entanto, o prazo mais longo reduz o impacto do erro de medição no erro padrão das estimativas da taxa. Além disso, esse protocolo mede tanto a liberação de AGL quanto a de glicerol e considera a relação AGL:liberação de glicerol com o objetivo de atingir uma relação de 3:1, como seria esperado a partir da lipólise completa e liberação de produtos lipolíticos na mídia72.

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Protocol

O uso de todos os animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Weill Cornell Medical College da Cornell University.

1. Preparação de tampões e placas coletoras

  1. Produzir albumina de soro bovino (BSA) a 5% dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol. Mexa suavemente o BSA para dissolver (agitar é contraproducente). Uma vez que a BSA esteja totalmente dissolvida, filtre-esterilize o meio com um filtro de 0,2 μm. Conservar o suporte BSA a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
  2. Fazer concentrações de trabalho de meios de controle e estimulação. Meios de controle: 5% de mídia BSA com controle veicular. Meio de estimulação: meio BSA 5% com CL-316,243 μM 0,5 μM. Faça novos meios de estimulação para cada experimento.
  3. Aquecer o meio a ser utilizado a 37 °C. Rotule uma placa de 96 poços para coleta de mídia.

2. Preparo da amostra

  1. Realizar cultura celular conforme descrito abaixo. Realize todo o trabalho celular em uma capela de fumaça estéril para minimizar a contaminação externa.
    1. Isolar e diferenciar pré-adipócitos primários, como em73,74.
      1. Pré-adipócitos primários em placa de alta densidade, como 1 x 105 células/poço em placa de 24 poços em meio de cultura de 1 mL/poço (15% de soro fetal bovino (SFB) e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina em DMEM/F12).
      2. Após as células atingirem 100% de confluência, diferenciar com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de tiazolidinediona (TZD) em meios de cultura por 3 dias. Em seguida, mude para o meio de cultura com 1 μg/mL de insulina por pelo menos 3 dias para crescer gotículas lipídicas. Utilizar 1 mL/poço de meio na placa de 24 poços.
      3. Troque o meio de cultura (1 ml/poço) com insulina a cada 2 ou 3 dias. As células podem ser mantidas em meio com insulina por até 2 semanas. Use apenas culturas em que as taxas de diferenciação são superiores a 90% e são semelhantes entre os grupos para este ensaio, pois a diferenciação reduzida pode ser mal interpretada como uma redução na taxa lipolítica.
      4. Cultivar as células em meio livre de insulina por 24 h antes da dosagem da lipólise.
        NOTA: A insulina na mídia mantém as gotículas lipídicas, mas também inibe a lipólise. A incubação sem insulina por 24 h permite a ativação lipolítica completa sem perda do volume lipídico das gotículas. Em alguns sistemas, o tempo de cultura sem insulina pode precisar ser encurtado ou prolongado.
    2. Lavar as células com DPBS uma vez para remover o soro residual dos meios de cultura.
      NOTA: Este protocolo não inclui a inanição de soro, que pode ativar a lipólise. A inanição de soro pode ser empregada a critério do pesquisador.
  2. Realizar cultura ex vivo conforme descrito abaixo.
    1. Prepare uma placa de 6 poços, com um poço para cada tecido a ser coletado de cada camundongo. Colocar 4 mL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado.
      NOTA: BSA na mídia de coleta não é necessário.
    2. Preparar uma placa de 48 poços para o ensaio de lipólise, com um orifício para cada repetição. Colocar 400 μL de DMEM à temperatura ambiente em cada poço a ser utilizado. Utilizar dois a quatro poços controle e dois a quatro poços estimulados por tecido por camundongo.
    3. Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia, com um método secundário como pneumotórax bilateral. Utilizou-se um camundongo fêmea C57BL/6J, com 32 g de 7 meses de idade, alimentado com dieta hiperlipídica a 45% por 4 meses.
      NOTA: Este protocolo também pode ser usado para o sexo masculino, bem como outras cepas, dietas e idades.
    4. Borrifar com etanol a 70% e usar tesoura para fazer uma pequena incisão lateral (~ 1 cm) no centro da pele abdominal, afastar a pele apertando cada lado com polegar e indicador e dobrar a pele abdominal inferior para revelar os depósitos subcutâneos posteriores. Localizar e remover o linfonodo inguinal e dissecar o tecido adiposo inguinal imediatamente posterior ao linfonodo inguinal usando pinças.
    5. Para coletar o tecido adiposo gonadal, fazer uma incisão lateral e uma vertical no peritônio para acessar a cavidade peritoneal. Segure o coxim gorduroso gonadal com uma pinça e corte ao longo do útero (ou epidídimo para os machos) para remover o tecido adiposo gonadal. Coloque os depósitos coletados em um prato de 6 poços.
    6. Retire bem o tecido, coloque em um tapete de silicone e corte em pedaços de 5 a 7 mg com tesoura.
    7. Pesar 25 a 30 mg (cinco ou seis pedaços) para cada ensaio bem e colocar em uma placa de ensaio de 48 poços. Coloque o tecido em uma toalha limpa antes de pesar para remover qualquer meio. Pesar o barco de peso após a remoção do tecido e registrar o peso de qualquer resíduo deixado para trás. Limpe o barco de peso entre as amostras e re-tar, se necessário. Use um novo barco de peso para cada tecido.
    8. Depois de pesadas todas as amostras de tecido, colocar a placa de ensaio de 48 poços em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO2 por 15 minutos.

3. Ensaio de lipólise

  1. Executar coleta de mídia. Realizar a transferência do meio e posterior coleta de amostras em um exaustor de fumaça estéril para minimizar a contaminação potencial de fontes externas.
    1. Em t = 0, remova o meio e adicione 400 μL por poço de controle ou meio de estimulação e coloque a placa em uma incubadora de 37 °C e 10% de CO2 . Para cultura de tecidos ex vivo , remover cuidadosamente o meio usando uma pipeta; A sucção nunca deve ser usada.
      NOTA: Alternativamente, prepare uma segunda placa com meios de controle e estimulação, e transfira os tecidos.
    2. Em t = 1, 2, 3 e 4 h, coletar 200 μL de meio, substituir por 200 μL do meio de controle ou estimulação apropriado e retornar a placa de ensaio à incubadora. Conservar a placa de recolha a 4 °C. Para determinar a capacidade de tamponamento FFA da mídia BSA, use uma coleta adicional em 24 h.
      NOTA: Os experimentos podem ser interrompidos aqui, e o meio coletado pode ser armazenado a -20 °C.

4. Ensaio colorimétrico de AGL

  1. Aqueça os reagentes à temperatura ambiente e dissolva um frasco de reagente de cor A com um frasco de solvente A e um frasco de reagente de cor B com um frasco de solvente B. A partir da data de reconstituição, esses reagentes são melhor utilizados dentro de 1 semana. Descarte 1 mês após a reconstituição.
  2. Descongele e misture as amostras.
  3. Crie uma curva padrão FFA. A solução padrão é de 1 mM. Use o seguinte volume com os reagentes para a curva padrão: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (diluição 1:2), 10 μL (diluição 1:4), 10 μL (diluição 1:8) e 10 μL de água para a faixa máxima. Para baixos níveis de AGL, 10 μL de 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0,05 mM podem ser mais aplicáveis.
  4. Pipetar padrões e amostras em uma placa de ensaio de 96 poços. O volume de amostra recomendado é de 10 μL. Inclua três poços com o mesmo volume de meio BSA que as amostras para correção de fundo.
    NOTA: Se as concentrações da amostra se situarem fora do intervalo da curva padrão, repetir o ensaio, ajustando o volume da amostra para 2-25 μL.
  5. Adicionar 150 μL de reagente A a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
  6. Leia a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura A).
  7. Adicionar 75 μL de reagente B a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
  8. Leia novamente a absorbância da placa a 550 nm e 660 nm de referência (Leitura B).

5. Ensaio colorimétrico de glicerol

  1. Reconstituir o reagente glicerol livre com 36 mL de água ultrapura e aclimatar-se à temperatura ambiente. Esses reagentes são melhor usados dentro de algumas semanas. Descarte 2 meses após a reconstituição.
  2. Descongele e misture as amostras.
  3. Crie uma curva padrão de glicerol fazendo uma diluição em série de sete pontos e 2 vezes da solução padrão de glicerol e um branco de água.
    NOTA: A curva padrão é relativamente linear até 25 μL de glicerol 2,8 mM, mas não linear em concentrações mais elevadas.
  4. Pipetar 25 μL cada um do padrão e amostras para a placa de ensaio de 96 poços. Inclua três poços com a mídia BSA para correção de fundo.
  5. Adicionar 175 μL de reagente de glicerol livre a cada poço e misturar. Evite gerar bolhas. Estoure quaisquer bolhas com uma agulha de calibre fino. Incubar a placa de ensaio a 37 °C durante 5 min.
  6. Leia a absorbância da placa a 540 nm.

6. Cálculo da taxa lipolítica

  1. Comece com valores de densidade óptica (OD). Para glicerol, use A540 OD valores diretamente. Calcular o DO do ensaio de AGL de acordo com a seguinte fórmula:
    OD = (Leitura B: A 550 - A 660) - (Leitura A: A550 - A660)
  2. Utilizar a curva padrão para calcular os níveis de AGL e glicerol nas amostras coletadas. Plotar os valores padrão OD no eixo y e, no eixo x, usar concentrações padrão em relação ao volume da amostra (ou seja, a concentração dos poços com 20 μL do padrão FFA 1 mM em uma placa com amostras de 10 μL é igual a 2 mM). Ajuste uma linha de tendência linear:
    y = mx + b
  3. Inspecione visualmente a curva padrão e remova quaisquer pontos fora da faixa linear do ensaio. Calcule as concentrações das amostras utilizando a equação:
    Concentração da amostra: x = (OD - b) ÷ m
  4. Ajustar e reensaiar amostras que estejam fora do intervalo de ensaio linear. Para obter a concentração final da amostra, subtraia a concentração dos poços de fundo contendo apenas meios BSA da concentração das amostras.
  5. Calcular os moles de AGL e glicerol produzidos por cada amostra em cada ponto de tempo, de acordo com a fórmula:
    Equation 1
    onde C n = concentração no tempo t = n; Vt = volume total no poço; Vs = volume de coleta da amostra; e M, n = moles produzidos no tempo t = n (quando as concentrações estão em mM e os volumes estão em mL, o débito é μMol).
    Por exemplo, em vários momentos:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    ou
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normalizar para o peso do tecido dividindo pelo peso do tecido para cada amostra em gramas para obter unidades de μmol/g. Para células cultivadas, os valores são apresentados como μmol/poço. Certifique-se de que o número de células e a eficiência da diferenciação sejam comparáveis de poço para poço.
    NOTA: Diferenças na eficiência de proliferação ou diferenciação complicarão a interpretação dos resultados e exigirão outro método de normalização (por exemplo, normalização para proteína; ver discussão).
  7. Calcular a inclinação do μmol/g produzido (eixo y) versus o tempo (eixo x) para cada amostra individualmente.
    1. Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =SLOPE(known_ys,known_xs). Em uma nova célula, digite "=SLOPE" (em seguida, use o cursor para realçar os valores de glicerol ou FFA da amostra em μmol/g e, em seguida, para realçar os valores de tempo correspondentes).
    2. Verifique a linearidade dos dados. Os valores de R2 são uma maneira rápida de determinar a linearidade das amostras. Em uma planilha, isso pode ser feito usando a função =RSQ(known_ys,known_xs), da mesma maneira descrita na etapa 6.7.1, mas a entrada inicial é =RSQ. Certifique-se de que os valores de R2 estejam > 0,98; valores mais baixos indicam desvio da linearidade. Isso pode resultar de um erro de medição/amostragem ou perda de linearidade.
      1. Outra forma de testar a linearidade é realizar uma regressão linear para cada amostra e plotar os resíduos. Em um software de análise estatística, gere uma tabela XY com um único valor Y para cada ponto de tempo. Selecione Analisar > regressão linear simples e selecione a caixa para Gráfico residual antes de pressionar OK. O gráfico residual aparecerá como um novo gráfico.
  8. Use o FFA e a taxa de produção de glicerol (ou seja, inclinação [(μmol/g/h]) para cada amostra como um ponto de dados individual para realizar análise estatística e plotar valores se diferentes condições lipolíticas estiverem sendo comparadas. Se as taxas lipolíticas estiverem sendo comparadas entre genótipos, use duas ou três amostras por animal como réplicas técnicas e use a média para um ponto de dados por animal, de modo que o tamanho da amostra seja igual ao número de animais.

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Representative Results

Medimos a taxa lipolítica basal e estimulada de adipócitos diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos primários do tecido adiposo branco inguinal foram diferenciados em adipócitos pelo tratamento de células confluentes com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de IBMX, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de troglitazona por 4 dias, seguidos por um tratamento adicional de 3 dias com 1 μg/mL de insulina. As células foram incubadas em meio sem insulina por 24 h antes do ensaio de lipólise. No tempo = 0h, as células foram lavadas uma vez com PBS, em seguida, DMEM livre de fenol vermelho com BSA 2%, contendo 10 μM CL-316,243 ou veículo controle, foi adicionado a cada poço da placa de 12 poços. No tempo = 1 h, 2 h, 3 h e 4 h, 50% do meio foi coletado e substituído por 2% de BSA em DMEM livre de fenol vermelho. Os níveis de AGL e glicerol foram medidos no meio coletado e nos moles de AGL, e o glicerol secretado em meio foi calculado em cada momento (Figura 2A,B). A produção de AGL e glicerol foi linear para o ensaio de 4 horas, com valores de R2 de 0,98 e acima. Os níveis de AGL de 4 h foram ligeiramente baixos, indicando que as taxas lipolíticas podem ter diminuído; no entanto, a análise com e sem o tempo de 4 h não teve impacto significativo na taxa lipolítica calculada. As taxas lipolíticas estimuladas foram significativamente maiores do que as taxas basais (Figura 2C). A estimulação lipolítica resultou na produção de AGL e glicerol em uma razão molar próxima a 3:1 em todas as amostras coletadas, como seria esperado da lipólise completa de triglicérides sem recaptação ou retenção significativa (Figura 2D). Entretanto, nas células não estimuladas, a relação foi mais próxima de 1, sugerindo uma fonte não lipolítica de glicerol48,49,50.

Figure 2
Figura 2: Taxa lipolítica in vitro diferenciado em adipócitos primários. Os pré-adipócitos foram diferenciados em placa de 12 poços. A insulina foi retirada da mídia 24 h antes do ensaio lipolítico. No tempo = 0 h, as células foram estimuladas com 10 μM CL-316.243 (CL) ou tratadas com veículo (V) meio controle. Os nmol de (A) AGL e (B) glicerol produzidos em cada poço em cada ponto de tempo foram plotados ao longo do tempo, e uma linha de regressão linear foi ajustada para cada poço individual. (C) Taxa de produção de FFA. (D) Taxa de produção de glicerol. Os dados são representados como média ± EPM. (E) Razão molar de AGL:glicerol no meio coletado em cada momento. A análise estatística em (C) e (D) foi realizada por meio do teste t de Student; o efeito da LC foi significativo em α = 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em cultura celular, a monocamada de células está em contato direto com o meio, enquanto em tecidos cultivados ex vivo, as células no centro não estão em contato com o meio. Assim, em culturas ex vivo, os AGL têm maior probabilidade de serem retidos no tecido. Pedaços maiores de tecido, que têm menor relação superfície/volume, exibem maiores taxas de retenção de AGL, resultando em menores razões molares AGL:glicerol (Figura 3A). Com a diminuição do tamanho do pedaço de tecido, a razão molar de AGL:glicerol liberado aproxima-se de 3:1 (Figura 3A). No entanto, pedaços de tecido também podem ser muito pequenos. Além do desafio de trabalhar com minúsculos pedaços de tecido adiposo, pedaços de 1-2 mg de tecido adiposo exibem taxas lipolíticas reduzidas, sugerindo uma viabilidade e funcionalidade reduzidas do tecido (Figura 3B,C). Embora seja tedioso e demorado cortar o tecido adiposo em pedaços de tamanho e forma consistentes, é necessário obter resultados comparáveis e confiáveis. Recomendamos 5 a 10 mg de tecido adiposo, mas a consistência é mais importante. As taxas lipolíticas ainda podem ser medidas de forma reprodutível em pedaços maiores de tecido, no entanto, é importante considerar a inibição por feedback da lipólise pelos AGL63,64,65,66,67.

Figure 3
Figura 3: Efeito do tamanho do fragmento tecidual na liberação de AGL e taxa lipolítica. O tecido adiposo branco gonadal de uma dieta rica em gordura alimentada com camundongos fêmeas C57Bl/6J foi coletado e cortado em pedaços de tamanho variável. Todos os poços continham 25-30 mg de tecido adiposo no total; para os poços de 25 mg, tratava-se de um pedaço de tecido; Os poços de 10 mg continham três pedaços de tecido cada de ~ 10 mg, os poços de 5 mg continham cinco ou seis pedaços de tecido e os poços de 2 mg continham 13-16 pedaços. No tempo = 0 h, a lipólise foi estimulada com CL-316.243 (CL) 0,5 μM, ou os poços controle foram tratados com veículo (V). A taxa lipolítica calculada a partir de amostras coletadas após 1 h, 2 h e 3 h é plotada para (A) AGL e (B) glicerol. (C) Razão molar de AGL:produção de glicerol em cada poço. ±A análise estatística em (A) e (B) foi realizada usando uma ANOVA two-way com uma análise post-hoc de Holm-Sidak, α = 0,05. O efeito da LC foi significativo em todas as amostras. Dentro das amostras tratadas com CL, as taxas de produção de AGL e glicerol foram significativamente diferentes em todas as comparações pareadas, exceto nas amostras de 10 mg versus 5 mg. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O impacto negativo da retenção de AGL pode ser observado nos pedaços de tecido de 25 mg, que apresentam menores taxas de produção de AGL e glicerol à estimulação (Figura 3B,C). Essa inibição de feedback também é aparente quando a capacidade de ligação FFA da mídia é muito baixa (ou seja, não há BSA suficiente na mídia). Quando a ASC na mídia foi reduzida para 0,5%, a liberação de AGL foi reduzida mais de quatro vezes, e a liberação de glicerol reduziu quase duas vezes (Figura 4A,B). Como regra geral, os níveis micromolares de AGL na mídia não devem se aproximar da porcentagem de ACS na mídia (ou seja, os níveis de AGL devem permanecer abaixo de 5 mM de AGL em meios de BSA de 5% e 0,5 mM em meios de BSA de 0,5% [neste nível há uma razão molar de 20:3 de AGL:BSA]). Para testar a capacidade máxima de tamponamento de BSA da preparação de meios de BSA, colete o meio de uma amostra estimulada por 24 h e meça a concentração de AGL (a concentração será alta, portanto, recomenda-se um menor volume de amostra ou diluição da amostra). O acúmulo de AGL no meio de ASC a 5% após estimulação de 24 horas foi de cerca de 5 mM, enquanto o conteúdo de AGL do meio de ASC a 0,5% foi de apenas 0,6 mM (Figura 4C). Observando a concentração de AGL nos meios coletados, pode-se observar que a capacidade de ligação de 0,5% de AGL dos meios BSA está sobrecarregada (Figura 4D). Embora os níveis de FFA na mídia BSA de 5% sejam muito mais altos, eles não excedem a capacidade de tamponamento da mídia (Figura 4D). Idealmente, a concentração de AGL no meio deve permanecer abaixo de uma razão molar 3:1 AGL:BSA (ou seja, 2,3 mM de AGL em 5% [0,75 mM] de ASC).

Figure 4
Figura 4: Níveis insuficientes de SCQ resultam em taxas lipolíticas aparentes reduzidas. O tecido adiposo branco gonadal de uma dieta rica em gordura alimentada com camundongos fêmeas C57Bl/6J foi coletado e cortado em pedaços de ~5 mg. Um total de 20-30 mg de tecido adiposo foi colocado em cada poço. No tempo = 0 h, a lipólise foi estimulada com 0,5 μM CL-316.243 (CL), ou os poços controle foram tratados com veículo (V) em meio BSA a 5% ou meio contendo apenas 0,5% de BSA. A taxa lipolítica calculada a partir das amostras coletadas após 4 h é plotada para (A) AGL e (B) glicerol. O efeito da LC foi significativo em todas as amostras. Dentro das amostras tratadas com CL, as taxas de produção de AGL e glicerol foram significativamente diferentes entre as condições de 5% e 0,5% de BSA meio. (C) Níveis de AGL nos meios dos poços estimulados após 24 h. (D) Níveis de AGL nas amostras coletadas em 4 h. (E) Curvas padrão de AGL com e sem várias preparações de BSA a 5% em DMEM. Densidade óptica calculada como (Leitura B: A 550 - A 660) - (Leitura A: A550 - A660). (F) Curva padrão de glicerol com e sem BSA. A densidade óptica é absorvente a 540 nm (A540). Os valores de DO a 5,6 mM não foram lineares e, portanto, não foram incluídos na curva padrão. (G) Taxa de liberação de AGL do tecido adiposo gonadal feminino utilizando diferentes tipos de SCQ nos meios de ensaio. ±A análise estatística em (A) e (B) foi realizada usando uma ANOVA two-way com uma análise post hoc de Holm-Sidak, * valor de p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

É importante salientar que algumas preparações de BSA contêm FFAs. Cada lote de BSA deve ser testado para garantir que o conteúdo de FFA é insignificante (note que algumas preparações de BSA são comercializadas como livres de FFA). Embora não seja especificamente comercializado como livre de FFA, o BSA usado aqui não contém FFAs detectáveis. Testamos o meio de ensaio contendo BSA livre de FFA (Equitech Bio Inc, BAH66), o BSA usado em experimentos aqui (Sigma, A9418) e uma fração V BSA (Sigma, 810531) mais crua (menos dispendiosa). O BSA livre de FFA e o BSA A9418 não produziram nenhum sinal de fundo ou alteraram a inclinação ou interceptação da curva padrão; as curvas padrão eram sobreponíveis (Figura 4E). Também não foi observado impacto do BSA DMEM na curva padrão do glicerol (Figura 4F). A fração V BSA, por outro lado, produziu um sinal de fundo no ensaio de AGL, que equivalia a uma concentração de AGL de 0,3 mM (Figura 4E). Esse fundo deslocou a curva padrão para cima, mas não impactou significativamente a inclinação, indicando que a subtração de fundo é suficiente. Também realizamos um experimento de lipólise estimulada usando esses três diferentes tipos de SCQ e verificamos que, após a subtração de fundo, a taxa calculada de lipólise não diferiu entre as formulações de BSA (Figura 4F). No entanto, este muitas vezes não é o caso, especialmente com preparações de BSA menos puras que podem facilmente conter insulina ou outros componentes que afetam a taxa de lipólise. Cada lote de BSA deve ser testado e validado, e usado consistentemente (ou seja, amostras ensaiadas com diferentes lotes de BSA não são comparáveis). Uma curva padrão completa com a adição de BSA e DMEM deve ser realizada ao validar cada lote de BSA para garantir que não contenha nada que interfira com as enzimas nos ensaios colorimétricos.

Coletar amostras seriadas e substituir o volume por mídia nova ajuda a reduzir a carga de FFA na mídia durante todo o experimento. Medimos as taxas lipolíticas no tecido adiposo gonadal de uma rata alimentada com uma dieta rica em gordura por 4 meses. Neste experimento, pedaços de tecido de 5-8 mg (peso total de 25-30 mg) foram incubados em 200 μL de meio BSA a 5%, e 100 μL foram coletados e substituídos em 1 h, 2 h, 3 h e 4 h. Os níveis de AGL e glicerol no meio coletado foram medidos. Às 3 h, os níveis de FFA nos meios atingiram a zona de perigo de 2,3 mM (Figura 5A). A inibição por feedback da lipólise foi sugerida pela ausência de aumento dos AGL médios e glicerol em 4 h (Figura 5A,B). Após o cálculo do μmol de AGL e glicerol liberados em cada momento e ajuste de uma curva linear, percebe-se que a taxa lipolítica começa a declinar em 4 h nas amostras estimuladas, com valores de R2 tão baixos quanto 0,976 para AGL e 0,983 para glicerol (Figura 5C,D). Observando o gráfico residual, fica claro que os valores de 4 h estão abaixo da tendência linear (ou seja, os resíduos são negativos) (Figura 5E,F). A exclusão do tempo de 4 h aumentou os valores de R2 para 0,997 e 0,998 e acima para AGL e glicerol, respectivamente. A inclusão do ponto de tempo de 4 h causa uma pequena, mas significativa diminuição nas taxas calculadas de AGL e liberação de glicerol (Figura 5G,H).

Figure 5
Figura 5: Cálculo da taxa lipolítica linear no tecido adiposo ex vivo . O tecido adiposo branco gonadal de uma dieta rica em gordura alimentada com camundongos fêmeas C57Bl/6J foi coletado e cortado em pedaços de ~5 mg. Um total de 20-30 mg de tecido adiposo foi colocado em cada poço. No tempo = 0 h, a lipólise foi estimulada com 0,5 μM CL-316,243 (CL), ou os poços controle foram tratados com veículo (V). As coletas de mídia foram realizadas em 1 h, 2 h, 3 h e 4 h. (A) FFA e (B) níveis de glicerol na mídia. (C) produção de AGL e (D) glicerol plotada ao longo do tempo. Placas residuais para produção de (E) AGL e (F) glicerol ao longo do tempo. Taxa de liberação de (G) AGL e (H) glicerol, calculada com e sem o tempo de 4 h. (I) Liberação de AGL no tecido adiposo gonadal feminino. Quase 50% dos meios de comunicação mudaram em 1 h, 2 h e 3 h. Entre as horas, os 15 min coletaram 2,75% da mídia sem reposição. ±A análise estatística em (G) e (H) foi realizada usando uma ANOVA two-way com uma análise post-hoc de Holm-Sidak, * valor de p < 0,05. O efeito da LC foi significativo em todas as amostras (valor de p < 0,05). Dentro das amostras tratadas com CL, as taxas de produção de AGL e glicerol foram significativamente diferentes entre os cálculos com e sem o tempo de 4 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diferentemente de protocolos anteriores, este protocolo utiliza múltiplos pontos de tempo para determinar a taxa lipolítica, reduzindo assim o erro de medida e fornecendo validação interna de que a taxa linear de lipólise está sendo medida. Para manter a lipólise na fase linear em cada ponto de coleta, 50% do meio é coletado e substituído. Como a linearidade é crítica, queríamos garantir que a adição de mídia fresca não estivesse causando uma explosão de lipólise a cada adição. Para validar a linearidade entre os momentos, foi coletada uma amostra muito pequena (2,75%) a cada 15 min entre os momentos horários de 1 h a 3 h, sem reposição. Em 1 h, 2 h e 3 h, a coleta normal de 50% da amostra foi feita e substituída. A taxa de liberação de AGL foi linear entre os momentos habituais, indicando que não houve explosão de lipólise a cada adição de meio fresco (Figura 5I).

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Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo básico para medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo ex vivo . Para quantificar a lipólise, é importante medir a taxa lipolítica na fase linear. Usamos uma técnica de amostragem seriada, onde uma grande fração de meios é coletada e substituída por meios frescos em intervalos regulares. Este método semiconservador permite a adição de BSA fresco com capacidade tamponante de AGL e retarda a inibição do feedback, estendendo a duração da lipólise linear. Este desenho experimental tenta recapitular a vascularização do tecido adiposo in vivo, que libera albumina fresca para se ligar aos AGL liberados75. Este protocolo foi otimizado para medir lipólise em tecido adiposo branco murino ex vivo e pré-adipócitos primários de tecido adiposo inguinal diferenciados in vitro. O protocolo provavelmente pode ser otimizado para funcionar bem em depósitos adiposos marrom e bege, bem como tecido adiposo de outros organismos e linhagens celulares imortalizadas com alto potencial adipogênico. O protocolo permite flexibilidade na idade, sexo e dieta dos camundongos antes da coleta de tecido adiposo para ensaios ex vivo . Algumas manipulações, como o jejum, podem afetar a taxa lipolítica basal, enquanto outras intervenções, como a obesidade induzida por dieta, também afetam a taxa de lipólise estimulada.

O protocolo deve ser otimizado para cada sistema experimental, dependendo se as taxas lipolíticas são maiores ou menores. Para validar a linearidade, recomendamos calcular os valores de R2 e observar o gráfico de resíduos. Os valores de R2 devem ser muito próximos de 1. Ao avaliar o gráfico de resíduos, deve-se estar atento a valores residuais negativos em momentos posteriores, pois estes indicam que as taxas lipolíticas estão diminuindo e a linearidade está sendo perdida. Exemplos dessas parcelas residuais são mostrados na Figura 5E,F. A eliminação dos pontos de tempo de 4 h neste caso fornece um cálculo mais preciso da taxa lipolítica linear e melhora os valores de R2. No entanto, como a taxa é calculada a partir de vários pontos de tempo, ela é relativamente robusta, e a inclusão de tal ponto de tempo tem apenas um pequeno impacto sobre os valores de R2 e a taxa de lipólise calculada. Se um único ponto de tempo é usado para calcular a taxa lipolítica, os dados podem ser mais facilmente distorcidos.

A maneira como os dados são normalizados também pode afetar os resultados relativos entre as amostras. Aqui, recomendamos a normalização do tecido ex vivo para o peso tecidual e os pré-adipócitos primários diferenciados in vitro por poço. No entanto, essas técnicas de normalização podem não ser apropriadas para todos os sistemas experimentais. É importante ressaltar que, se a taxa de proliferação ou a eficiência de diferenciação diferem entre os grupos, a normalização por poço não é apropriada. Técnicas alternativas de normalização incluem proteínas, lipídios e DNA. Cada método de normalização tem suas vantagens e desvantagens. O peso do tecido e a normalização do bem é simples e direto. Diferenças no tamanho dos adipócitos podem significar que o tecido adiposo magro contém muito mais adipócitos por grama do que o tecido adiposo obeso, enquanto diferenças na eficiência da diferenciação podem resultar em diferenças no número de adipócitos por poço. Os lipídios podem ser extraídos com solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio 2:1:metanol [v/v]) e o conteúdo de triglicérides medido usando um reagente colorimétrico. Embora a normalização para o conteúdo lipídico não seja um método tradicionalmente utilizado, as gotículas lipídicas são, afinal, a organela que sofre lipólise, e esse método de normalização é específico para adipócitos, o que pode ser útil quando as taxas de diferenciação diferem entre as células. Após a extração lipídica, NaOH 0,1-0,3 N pode ser usado para extrair proteína, que pode então ser ensaiada por Bradford ou BCA protein assay68. Alternativamente, as amostras podem ser homogeneizadas em tampão de lise, e a fração lipídica removida por centrifugação70. Note que a contaminação lipídica irá interferir com os ensaios proteicos. Se a proteína for usada para normalização, as células devem ser lavadas extensivamente (pelo menos três vezes) para remover a BSA do meio de ensaio. Às vezes, os adipócitos diferenciados não aderem bem à placa e não toleram as três lavagens necessárias para remover o excesso de SCQ. A normalização para DNA permite a normalização para o número de células, e pode ser realizada com um kit comercial de extração de DNA, seguido da quantificação do DNA total por absorbância ou análise por PCR em tempo real do número de cópias do gene. Alternativamente, em células plaqueadas, a coloração DAPI seguida de imagem pode ser usada para contar núcleos e normalizar para o número de células. Ao normalizar usando número de células ou proteína, é importante considerar as células não adipócitos na amostra. O tecido adiposo também contém células imunes e endoteliais; No tecido adiposo obeso, a inflamação e a hipertrofia podem resultar em apenas 1 em cada 10 núcleos provenientes de adipócitos maduros. No entanto, os adipócitos ainda contribuem para a maior parte da massa e conteúdo lipídico do tecido. Para pré-adipócitos diferenciados in vitro , a eficiência de diferenciação afeta a porcentagem relativa de adipócitos maduros; Quando é esse o caso, a normalização é complicada. Idealmente, a eficiência da diferenciação deve ser otimizada antes da utilização das células para um ensaio de lipólise. Se não for possível, a normalização para o conteúdo lipídico é recomendada se o volume da gotícula lipídica for semelhante entre os adipócitos diferenciados. A comparação das taxas lipolíticas entre culturas de adipócitos com diferenciação desigual pode levar a conclusões errôneas sobre lipólise quando o fator determinante é, na verdade, a adipogênese; essa é uma limitação do protocolo.

AGL de cadeia longa inibem a lipólise 63,64,65,66,67. Os FFAs se acumulam quando não estão suficientemente sequestrados na mídia. Grande parte da solução de problemas associada à otimização da medição da lipólise está relacionada à minimização da retenção de AGL. O cálculo da razão molar da liberação de AGL:glicerol na mídia ajuda a identificar problemas relacionados à retenção de AGL. Se a razão molar é de 3:1 para AGL:glicerol, então todos os produtos da lipólise estão sendo liberados e capturados na mídia, enquanto uma relação abaixo de 2:1 é motivo de preocupação. Uma consideração importante para ensaios ex vivo é o tamanho do pedaço de tecido adiposo. Pedaços maiores de tecido têm uma menor relação área de superfície/volume e, portanto, são mais propensos a reter AGL e exibir taxas lipolíticas reduzidas como consequência (Figura 4A,B). Tendo isso em mente, é fundamental cortar o tecido adiposo de cada amostra em pedaços de tamanho e forma consistentes. Para facilitar o sequestro de FFA nos meios de comunicação, também é importante garantir que os meios contenham BSA suficiente para vincular os FFA liberados. A capacidade tamponante de FFA do meio pode ser aumentada aumentando a concentração de BSA ou aumentando o volume do meio. É igualmente eficaz aumentar o volume ou a frequência da coleta. Se observarmos altas taxas lipolíticas, mas a relação AGL:glicerol for inferior a 2:1, recomendamos aumentar a frequência de coleta a cada 30 min e interromper o ensaio em 2,5 h.

O protocolo aqui fornecido é otimizado para tecido adiposo branco ex vivo de camundongos e pré-adipócitos primários diferenciados in vitro, ambos altamente lipolíticos. O ensaio precisa ser otimizado para medir a lipólise em outros sistemas, ou se diferenças na taxa basal relativamente baixa de lipólise são de particular interesse. Por exemplo, adipócitos 3T3-L1 apresentam menor atividade lipolítica32. Quando a taxa de lipolítica é baixa, o volume de incubação deve ser reduzido (ou seja, em vez de 400 μL por poço em uma placa de 24 poços, 200 μL em uma placa de 24 poços devem ser usados, ou 300 μL em uma placa de 12 poços, e 100-150 μL coletados por ponto de tempo. O volume de coleta não deve cair abaixo de 100 μL, pois volumes maiores de amostra são necessários para medir com precisão os baixos níveis de AGL e glicerol. Para dosar o glicerol usando 50 μL de meio por amostra, o reagente de glicerol livre deve ser dissolvido em 31 mL de água, e 150 μL de reagente usado com 50 μL de amostra em cada poço. Os níveis de AGL podem ser medidos com 25 μL de amostra por poço, talvez mais, desde que a linearidade seja mantida. Os pontos de tempo também podem ser estendidos para aumentar o sinal. Ao determinar taxas lipolíticas de células que não sejam adipócitos brancos, diferenças no metabolismo celular devem ser consideradas. Por exemplo, adipócitos marrons e beges expressam níveis muito mais elevados de glicerol quinase, sendo, portanto, capazes de reter a liberação de glicerol por lipólise76,77. Essas células metabolicamente ativas também podem ser capazes de canalizar ácidos graxos liberados em vias catabólicas ou sintéticas sem liberação no meio. O destino metabólico dos AGL e do glicerol no tipo celular específico a ser ensaiado deve ser considerado ao interpretar os resultados de um ensaio de lipólise, especialmente em um tipo celular diferente dos adipócitos brancos. Ensaios de lipólise em outros tipos celulares precisam ser otimizados e validados.

Este protocolo é projetado para avaliar diferenças na taxa lipolítica em modelos de camundongos. Pré-adipócitos primários diferenciados in vitro são uma ferramenta útil para investigar efeitos autônomos celulares de manipulações genéticas ou tratamentos farmacológicos em adipócitos. O tecido adiposo, por outro lado, contém outros tipos celulares, incluindo células imunes. O impacto das células imunes do tecido adiposo na regulação da lipólise é importante considerar na avaliação da lipólise tecidual total. Modelos de lipólise de adipócitos cultivados podem contornar a potencial influência complicadora de células imunes e permitir a investigação completa dos tipos celulares específicos, enquanto os explantes de tecido adiposo permitem uma comparação mais robusta com o ambiente in vivo . Além disso, o ensaio ex vivo pode ser usado para investigar taxas lipolíticas em vários depósitos adiposos. Nesses sistemas, a lipólise é estimulada por compostos como os agonistas dos receptores β-adrenérgicos, portanto, não serão observadas alterações no tônus simpático que possam impactar o modelo in vivo em camundongos. A medição in vivo da lipólise é complicada pela dinâmica da liberação e captação de AGL e glicerol em vários tecidos do corpo. Os níveis séricos de AGL e glicerol em um determinado momento são o equilíbrio entre secreção e captação, e não se deve presumir que as alterações nos níveis séricos de AGL e glicerol sejam atribuíveis exclusivamente à lipólise do tecido adiposo. A lipólise induzida pelo jejum é influenciada pelo tônus simpático, mas não produz mudanças rápidas e robustas nos níveis séricos de AGL ou glicerol, dificultando a interpretação de alterações nos níveis séricos de AGL e glicerol em jejum. A lipólise in vivo pode ser estimulada usando um agonista dos receptores adrenérgicos β-3, como o CL-316,243, e o aumento dos AGL séricos e do glicerol são detectáveis dentro de 20 minutos após a estimulação. Os ensaios lipolíticos in vivo devem incluir medições basais de AGL sérico e glicerol, bem como um controle do veículo; dessa forma, pode-se determinar a alteração específica da estimulação nos níveis séricos de AGL e glicerol.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo US National Institutes of Health grant R01DK126944 para S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

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Mensuração da Taxa de Lipólise <em>em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo</em> e Pré-adipócitos Primários Diferenciados <em>In Vitro</em>
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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

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