Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Summary

A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.

Abstract

Os adipócitos armazenam energia na forma de triglicerídeos em gotículas lipídicas. Essa energia pode ser mobilizada via lipólise, onde as cadeias laterais dos ácidos graxos são sequencialmente clivadas da espinha dorsal do glicerol, resultando na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Devido à baixa expressão de glicerol quinase em adipócitos brancos, as taxas de recaptação de glicerol são desprezíveis, enquanto a recaptação de ácidos graxos é ditada pela capacidade de ligação de ácidos graxos de componentes do meio, como a albumina. Tanto a liberação de glicerol quanto de ácidos graxos em meios pode ser quantificada por ensaios colorimétricos para determinar a taxa lipolítica. Medindo esses fatores em vários momentos, pode-se determinar a taxa linear de lipólise com alta confiança. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a mensuração da lipólise em adipócitos diferenciados in vitro e tecido adiposo ex vivo de camundongos. Este protocolo também pode ser otimizado para outras linhagens celulares de pré-adipócitos ou tecido adiposo de outros organismos; considerações e parâmetros de otimização são discutidos. Este protocolo foi projetado para ser útil na determinação e comparação da taxa de lipólise de adipócitos entre modelos e tratamentos em camundongos.

Introduction

Os nutrientes em excesso são armazenados no tecido adiposo branco na forma de triglicerídeos no núcleo lipídico neutro das gotículas lipídicas. Os estoques de triglicérides são mobilizados via lipólise, processo pelo qual as cadeias laterais de ácidos graxos são sequencialmente clivadas por lipase triglicérides do tecido adiposo (ATGL), lipase hormônio-sensível (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL), resultando na liberação de ácidos graxos livres (AGL) e da espinha dorsal do glicerol ^1,2. A lipólise é ativada pela sinalização de catecolaminas no tecido adiposo. Os terminais nervosos simpáticos liberam localmente catecolaminas, que se ligam aos receptores β-adrenérgicos na membrana plasmática dos adipócitos. Após a ligação do ligante, esses receptores acoplados à proteína G (GPCRs) ativam a adenilil ciclase via G_αs. A ativação subsequente da proteína quinase A (PKA) pelo AMPc resulta na regulação positiva tanto da ATGL quanto da HSL. A fosforilação da perilipina-1 pela PKA causa a dissociação da ABHD5 (também conhecida como CGI-58), que se liga e coativa a ATGL³. O PKA fosforila diretamente a HSL, promovendo sua translocação do citosol para a gota lipídica, onde a interação com a perilipina-1 fosforilada promove ainda mais sua atividade lipase 4,5,6,7. A terceira lipase envolvida na lipólise, a MGL, parece não ser regulada pela sinalização das catecolaminas⁸. É importante ressaltar que a síntese de triglicérides em adipócitos é mediada pela via de síntese lipídica do glicerol, que não envolve a formação de monoglicerídeos como intermediário; em vez disso, as glicerol-3-fosfato acilo transferases catalisam a formação de ácido lisofosfatídico, que é combinado com outro acil-CoA graxo para formar ácido fosfatídico e, em seguida, isomerizado em diglicerídeos antes da síntese final de triglicérides (Figura 1)9,10,11.

Figura 1: Vias de lipólise e síntese lipídica do glicerol. Topo: Via lipolítica; enzimas mostradas em vermelho: lipase triglicerídica do tecido adiposo (ATGL), lipase sensível ao hormônio (HSL) e lipase monoglicerídica (MGL). Fundo: via de síntese lipídica do glicerol; enzimas mostradas em verde: diglicerídeos aciltransferase (DGAT), fosfatase do ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAT, também conhecido como LPAATs) e glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT). Lipídios: triglicerídeos (TG), diglicerídeos (DG), monoglicerídeos (MG), ácidos graxos livres (AGL), acil-CoA graxo (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) e ácido fosfatídico (AP). Outros metabólitos: fosfato inorgânico (Pi) e glicerol 3-fosfato (G3P). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A adenosina extracelular é outro importante regulador da lipólise, atuando através de GPCRs acoplados a G_s e G_i para impactar a atividade da adenil ciclase. O receptor de adenosina predominante nos adipócitos, ADORA1, inibe a adenilil ciclase e, assim, a lipólise através da ativação de G_i¹². Expressa em níveis mais baixos, e principalmente em adipócitos marrons, a ADORA2A ativa a lipólise via sinalização_{de G s} ¹³. ADORA1 afeta tanto a lipólise basal quanto a resposta aos agonistas adrenérgicos. O efeito da adenosina na lipólise pode ser controlado pela adição de adenosina desaminase para neutralizar a adenosina, assim como o agonista específico ADORA1 fenilisopropiladenosina^14,15. A ativação hormonal de GPCRs acopladas a G_q também pode afetar a lipólise via ativação da fosfolipase C e da proteína quinase C^16,17,18,19. Sinais inflamatórios também afetam as taxas lipolíticas. A ativação de TLR4 pelo LPS (e outras endotoxinas) aumenta a taxa lipolítica pela ativação da ERK, que fosforila perilipina-1 e HSL²⁰. O TNF-α também ativa a lipólise via ativação de ERK e NF-κB, bem como downregulation transcricional da fosfodiesterase PDE-3B e CIDEC^21,22,23. A IL-6 também tem sido associada ao aumento da lipólise dos adipócitos, especialmente no tecido adiposo mesentérico, cuja liberação de AGL afeta a esteatose hepática e a gliconeogênese^24,25,26.

A lipólise é suprimida durante o estado alimentado pela insulina. AKT fosforila e ativa PDE-3B para suprimir a sinalização de AMPc e impedir a ativação de PKA²⁷. A insulina também diminui transcricionalmente a ATGL²⁸. A obesidade promove resistência às catecolaminas através de uma variedade de mecanismos, incluindo a diminuição da regulação dos receptores β-adrenérgicos nos adipócitos 29,30,31,32,33. Os adipócitos expressam os três receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 e β-3). Enquanto os receptores adrenérgicos β-1 e β-2 são expressos de forma ubíqua, o receptor adrenérgico β-3 é predominantemente expresso em adipócitos de camundongos^34,35. A expressão de Adrb3 é induzida por C/EBPα durante a adipogênese³⁶. O receptor adrenérgico β-3 é altamente expresso em adipócitos maduros. A ativação dos receptores adrenérgicos β-1 e β-2 é autolimitada devido à inibição por feedback pela β-arrestina³⁷. A inibição por feedback do receptor adrenérgico β-3 é mediada por outras vias de sinalização, que reduzem^{a expressão de} Adrb33,38,39.

Numerosos compostos podem ser usados para ativar a lipólise dos adipócitos. As catecolaminas são os principais ativadores fisiológicos da lipólise. A noradrenalina (ou noradrenalina) e a epinefrina (ou adrenalina) ativam os três receptores β-adrenérgicos⁴⁰. A noradrenalina e a adrenalina também afetam a lipólise via ativação da sinalização dos receptores α-adrenérgicos⁴¹. Os agonistas dos receptores β-adrenérgicos comumente usados incluem o isoproterenol, que é um agonista não seletivo dos receptores β-adrenérgicos, e os agonistas dos receptores adrenérgicos β-3 CL-316,243 e mirabegron⁴². Como os adipócitos expressam predominantemente o receptor adrenérgico β-3, utilizamos a CL-316,243 como exemplo. Sua especificidade para o receptor adrenérgico β-3 também o torna um ativador relativamente específico da sinalização de catecolaminas de adipócitos, que também pode ser usado com segurança in vivo. Note-se que a concentração comumente usada de 10 μM CL-316,243 em cultura celular é ordens de magnitude maior do que a dose de ~0,1 μM necessária para atingir uma resposta máxima³³. Forskolin contorna o receptor adrenérgico, ativando diretamente adenilil ciclase e sinalização lipolítica a jusante. Existem muito mais ativadores, bem como supressores de lipólise. Ao selecionar um composto para estimular a lipólise, a especificidade do receptor e as vias de sinalização a jusante devem ser cuidadosamente consideradas dentro do planejamento experimental.

A taxa de lipólise no tecido adiposo branco é um importante fator metabólico que afeta a tolerância ao frio e a disponibilidade de nutrientes durante o jejum ou exercício^43,44,45,46. O objetivo deste protocolo é medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo, o que facilitará o entendimento do metabolismo dos adipócitos e como ele pode afetar o fenótipo metabólico de vários modelos murinos. Para quantificar a taxa lipolítica, medimos a aparência dos produtos lipolíticos na mídia (i.e., AGL e glicerol). O método baseia-se na liberação de produtos lipolíticos do adipócito para o meio. Como os adipócitos brancos expressam baixos níveis de glicerol quinase, as taxas de recaptação do glicerol são baixas⁴⁷. Por outro lado, a produção de AGL e glicerol por outras vias metabólicas que não a lipólise também deve ser considerada. Os adipócitos parecem expressar uma fosfatase com atividade contra o glicerol-3 fosfato, possibilitando a produção de glicerol a partir do glicerol-3-fosfato derivado da glicose^48,49,50. A glicólise é uma fonte de glicerol-3-fosfato usado para reesterificação de AGL em adipócitos brancos. Quando os níveis de glicose são limitados, a gliceroneogênese requer outras fontes de carbono 3, como lactato e piruvato⁵¹. A canalização dos AGL liberados pela lipólise dentro da célula e seu destino metabólico é pouco compreendido; Os AGL liberados pela lipólise devem ser convertidos em acil-CoA graxo, antes de serem reesterificados ou submetidos à β-oxidação. Parece que os AGL liberados pela lipólise provavelmente saem da célula antes de serem retomados e convertidos em acil-CoA gorduroso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Os AGL podem ser sequestrados fora da célula pela albumina. É importante ressaltar que os AGL de cadeia longa são conhecidos por inibir a lipólise se não forem sequestrados pela albumina 63,64,65,66,67. Assim, a otimização da capacidade tampão dos AGL do meio durante o ensaio de lipólise é fundamental. O procedimento aqui descrito é semelhante aos métodos publicados anteriormente para medir a taxa lipolítica em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos e humanos 15,68,69,70,71. Esse protocolo difere pelo uso de amostragem seriada; Ao realizar amostragens seriadas, podemos validar internamente que a lipólise está sendo medida na fase linear e utilizar múltiplas medidas para calcular a taxa de lipólise, reduzindo assim o erro de medição para aumentar a confiança no valor final calculado. A desvantagem da amostragem seriada é que o ensaio requer mais tempo e reagentes; no entanto, o prazo mais longo reduz o impacto do erro de medição no erro padrão das estimativas da taxa. Além disso, esse protocolo mede tanto a liberação de AGL quanto a de glicerol e considera a relação AGL:liberação de glicerol com o objetivo de atingir uma relação de 3:1, como seria esperado a partir da lipólise completa e liberação de produtos lipolíticos na mídia⁷².

Protocol

O uso de todos os animais foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Weill Cornell Medical College da Cornell University. 1. Preparação de tampões e placas coletoras Produzir albumina de soro bovino (BSA) a 5% dissolvendo 5 g de BSA em 100 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sem vermelho de fenol. Mexa suavemente o BSA para dissolver (agitar é contraproducente). Uma vez que a BSA esteja totalmente dissolvida, filtre-est…

Representative Results

Medimos a taxa lipolítica basal e estimulada de adipócitos diferenciados in vitro. Os pré-adipócitos primários do tecido adiposo branco inguinal foram diferenciados em adipócitos pelo tratamento de células confluentes com 5 μM de dexametasona, 0,5 mM de IBMX, 1 μg/mL de insulina e 1 μM de troglitazona por 4 dias, seguidos por um tratamento adicional de 3 dias com 1 μg/mL de insulina. As células foram incubadas em meio sem insulina por 24 h antes do ensaio de lipólise. No tempo = 0h, as células fora…

Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo básico para medir a taxa de lipólise em adipócitos e tecido adiposo ex vivo . Para quantificar a lipólise, é importante medir a taxa lipolítica na fase linear. Usamos uma técnica de amostragem seriada, onde uma grande fração de meios é coletada e substituída por meios frescos em intervalos regulares. Este método semiconservador permite a adição de BSA fresco com capacidade tamponante de AGL e retarda a inibição do feedback, estendendo a duração da lipólise linear….

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work