JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65106
,
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine,Weill Cornell Medicine

Summary

Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Adipositler, lipit damlacıklarında trigliseritler şeklinde enerji depolar. Bu enerji, yağ asidi yan zincirlerinin gliserol omurgasından sırayla ayrıldığı ve serbest yağ asitlerinin ve gliserolün salınmasına neden olan lipoliz yoluyla harekete geçirilebilir. Beyaz adipositlerde gliserol kinazın düşük ekspresyonu nedeniyle, gliserol geri alım oranları ihmal edilebilirken, yağ asidi geri alımı, albümin gibi medya bileşenlerinin yağ asidi bağlama kapasitesi tarafından belirlenir. Hem gliserol hem de yağ asidinin ortama salınımı, lipolitik oranı belirlemek için kolorimetrik testlerle ölçülebilir. Bu faktörleri birden fazla zaman noktasında ölçerek, lipolizin doğrusal oranını yüksek güvenle belirleyebilirsiniz. Burada, farelerden in vitro diferansiye adipositlerin ve ex vivo yağ dokusunun lipoliz ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol ayrıca diğer preadiposit hücre hatları veya diğer organizmalardan yağ dokusu için optimize edilebilir; Dikkat edilmesi gereken noktalar ve optimizasyon parametreleri ele alınmıştır. Bu protokol, fare modelleri ve tedavileri arasındaki adiposit lipoliz oranını belirlemede ve karşılaştırmada yararlı olacak şekilde tasarlanmıştır.

Introduction

Fazla besinler, lipit damlacıklarının nötr lipit çekirdeğinde trigliseritler şeklinde beyaz yağ dokusunda depolanır. Trigliserit depoları, yağ asidi yan zincirlerinin yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL) tarafından sırayla bölündüğü ve serbest yağ asitlerinin (FFA’lar) ve gliserol omurgasının 1,2 salınımına neden olan bir süreç olan lipoliz yoluyla mobilize edilir. Lipoliz, yağ dokusunda katekolamin sinyalizasyonu ile aktive edilir. Sempatik sinir terminalleri, adiposit plazma zarındaki β-adrenerjik reseptörlere bağlanan katekolaminleri lokal olarak serbest bırakır. Ligand bağlanması üzerine, bu G-protein kuplajlı reseptörler (GPCR’ler), Gαs yoluyla adenil siklazı aktive eder. Daha sonra protein kinaz A’nın (PKA) cAMP ile aktivasyonu, hem ATGL hem de HSL’nin yukarı regülasyonuna neden olur. Perilipin-1’in PKA tarafından fosforilasyonu, ATGL3’ü bağlayan ve birlikte aktive eden ABHD5’in (CGI-58 olarak da bilinir) ayrışmasına neden olur. PKA, HSL’yi doğrudan fosforile eder, sitosolden lipit damlacığına translokasyonunu teşvik eder, burada fosforile perilipin-1 ile etkileşim, lipaz aktivitesini daha da arttırır 4,5,6,7. Lipolizde yer alan üçüncü lipaz, MGL, katekolamin sinyalizasyonu8 ile düzenlenmiyor gibi görünmektedir. Önemli olarak, adipositlerde trigliserit sentezine, bir ara madde olarak monogliserit oluşumunu içermeyen gliserol lipid sentez yolu aracılık eder; Bunun yerine, gliserol-3-fosfat açil transferazlar, fosfatidik asit oluşturmak için başka bir yağ açil-CoA ile birleştirilen ve daha sonra trigliseritlerin son sentezinden önce digliseritlere izomerize edilen lizofosfatidik asit oluşumunu katalize eder (Şekil 1) 9,10,11.

Figure 1
Resim 1: Lipoliz ve gliserol lipid sentez yolakları. Üst: Lipolitik yolak; kırmızı renkle gösterilen enzimler: yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL). Alt: gliserol lipid sentez yolu; yeşil renkte gösterilen enzimler: digliserit asiltransferaz (DGAT), fosfatidik asit fosfataz (PAP), lizofosfatidik asit asiltransferaz (LPAT, LPAAT olarak da bilinir) ve gliserol-3-fosfat asiltransferaz (GPAT). Lipitler: trigliserit (TG), digliserit (DG), monogliserit (MG), serbest yağ asidi (FFA), yağ açil-CoA (FA-CoA), lizofosfatidik asit (LPA) ve fosfatidik asit (PA). Diğer metabolitler: inorganik fosfat (Pi) ve gliserol 3-fosfat (G3P). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre dışı adenozin, adenil siklaz aktivitesini etkilemek için Gs ve G i-kuplajlı GPCR’ler aracılığıyla çalışan lipolizin bir başka önemli düzenleyicisidir. Adipositlerdeki baskın adenozin reseptörü ADORA1, adenilil siklazı ve böylece Gi12’nin aktivasyonu yoluyla lipolizi inhibe eder. Daha düşük seviyelerde ve öncelikle kahverengi adipositlerde eksprese edilen ADORA2A,13 sinyalleme yoluyla lipolizi aktive eder. ADORA1 hem bazal lipolizi hem de adrenerjik agonistlere yanıtı etkiler. Adenozinin lipoliz üzerindeki etkisi, adenozini nötralize etmek için adenozin deaminaz ve ADORA1’e özgü agonist fenilizopropiladenozin14,15 eklenerek kontrol edilebilir. G q-kuplajlı GPCR’lerin hormonal aktivasyonu, fosfolipaz C ve protein kinaz C 16,17,18,19’un aktivasyonu yoluyla lipolizi de etkileyebilir. Enflamatuar sinyaller ayrıca lipolitik oranları da etkiler. LPS (ve diğer endotoksinler) ile TLR4 aktivasyonu, perilipin-1 ve HSL20’yi fosforile eden ERK’yi aktive ederek lipolitik hızı arttırır. TNF-α ayrıca ERK ve NF-κB aktivasyonu yoluyla lipolizi aktive eder, ayrıca fosfodiesteraz PDE-3B ve CIDEC21,22,23’ün transkripsiyonel downregülasyonu. IL-6 ayrıca, özellikle FFA salınımı hepatik steatoz ve glukoneogenezi etkileyen mezenterik yağ dokusunda artmış adiposit lipoliz ile ilişkilendirilmiştir24,25,26.

Lipoliz, beslenen durum sırasında insülin tarafından bastırılır. AKT, cAMP sinyalini bastırmak ve PKA aktivasyonunu önlemek için PDE-3B’yi fosforile eder ve aktive eder27. İnsülin ayrıca ATGL28’i transkripsiyonel olarak aşağı regüle eder. Obezite, adipositlerde β-adrenerjik reseptörlerin aşağı regülasyonu da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla katekolamin direncini arttırır 29,30,31,32,33. Adipositler üç β-adrenerjik reseptörün tümünü eksprese eder (β-1, β-2 ve β-3). β-1 ve β-2 adrenerjik reseptörleri her yerde eksprese edilirken, β-3 adrenerjik reseptör ağırlıklı olarak farelerde adipositlerde eksprese edilir34,35. Adrb3 ekspresyonu, adipogenez36 sırasında C / EBPα tarafından indüklenir. β-3 adrenerjik reseptör olgun adipositlerde yüksek oranda eksprese edilir. β-1 ve β-2 adrenerjik reseptörlerin aktivasyonu, β-arrestin37 ile geri besleme inhibisyonu nedeniyle kendi kendini sınırlar. β-3 adrenerjik reseptörün geri besleme inhibisyonuna, Adrb3 ekspresyonunu 33,38,39 azaltan diğer sinyal yolları aracılık eder.

Adiposit lipolizi aktive etmek için çok sayıda bileşik kullanılabilir. Katekolaminler lipolizin başlıca fizyolojik aktivatörleridir. Norepinefrin (veya noradrenalin) ve epinefrin (veya adrenalin) üç β-adrenerjik reseptörün hepsini aktive eder40. Norepinefrin ve epinefrin ayrıca α-adrenerjik reseptör sinyalinin aktivasyonu yoluyla lipolizi etkiler41. Yaygın olarak kullanılan β-adrenerjik reseptör agonistleri, seçici olmayan bir β-adrenerjik reseptör agonisti olan izoproterenol ve β-3 adrenerjik reseptör agonistleri CL-316,243 ve mirabegron42’yi içerir. Adipositlerin ağırlıklı olarak β-3 adrenerjik reseptörü ifade ettiği göz önüne alındığında, burada örnek olarak CL-316,243 kullanıyoruz. β-3 adrenerjik reseptör için özgüllüğü, onu in vivo olarak güvenle kullanılabilen adiposit katekolamin sinyallemesinin nispeten spesifik bir aktivatörü yapar. Hücre kültüründe yaygın olarak kullanılan 10 μM CL-316,243 konsantrasyonunun, maksimum yanıt33’e ulaşmak için gereken ~ 0.1 μM dozundan daha yüksek büyüklük sıraları olduğunu unutmayın. Forskolin, adrenerjik reseptörü atlayarak adenil siklaz ve aşağı akış lipolitik sinyallemesini doğrudan aktive eder. Lipolizin baskılayıcılarının yanı sıra daha birçok aktivatör vardır. Lipolizi uyarmak için bir bileşik seçerken, reseptör özgüllüğü ve aşağı akış sinyal yolları deneysel tasarım içinde dikkatlice düşünülmelidir.

Beyaz yağ dokusunda lipoliz oranı, açlık veya egzersiz sırasında soğuk toleransını ve besin mevcudiyetini etkileyen önemli bir metabolik faktördür43,44,45,46. Bu protokolün amacı, adiposit metabolizmasının anlaşılmasını ve çeşitli murin modellerinin metabolik fenotipini nasıl etkileyebileceğini kolaylaştıracak adiposit ve yağ dokusundaki lipoliz oranını ölçmektir. Lipolitik oranı ölçmek için, lipolitik ürünlerin medyadaki görünümünü (yani, FFA’lar ve gliserol) ölçüyoruz. Yöntem, lipolitik ürünlerin adipositten medyaya salınmasına dayanır. Beyaz adipositler düşük gliserol kinaz seviyelerini eksprese ettiğinden, gliserol geri alım oranları düşüktür47. Tersine, FFA’ların ve gliserolün lipoliz dışındaki metabolik yollarla üretimi de göz önünde bulundurulmalıdır. Adipositler, gliserol-3 fosfata karşı aktiviteye sahip bir fosfatazı eksprese ediyor gibi görünmektedir ve glikoz 48,49,50’den türetilen gliserol-3-fosfattan gliserol üretimini sağlar. Glikoliz, beyaz adipositlerde FFA reesterifikasyonu için kullanılan bir gliserol-3-fosfat kaynağıdır. Glikoz seviyeleri sınırlı olduğunda, gliseroneogenez, laktat ve piruvat51 gibi diğer 3 karbonlu kaynakları gerektirir. Lipoliz ile salınan FFA’ların hücre içinde kanalize edilmesi ve metabolik kaderleri tam olarak anlaşılamamıştır; Lipoliz tarafından salınan FFA’lar, yeniden esterleştirilmeden veya β-oksidasyona uğramadan önce yağlı açil-CoA’ya dönüştürülmelidir. Lipoliz tarafından salınan FFA’ların muhtemelen geri alınmadan ve yağlı açil-CoA’ya dönüştürülmeden önce hücreden çıktığı görülmektedir 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA’lar albümin ile hücrenin dışında tutulabilir. Önemli olarak, uzun zincirli FFA’ların, albümin63,64,65,66,67 tarafından tutulmazlarsa lipolizi geri besleme-inhibe ettiği bilinmektedir. Bu nedenle, lipoliz testi sırasında ortamın FFA tamponlama kapasitesinin optimize edilmesi kritik öneme sahiptir. Burada açıklanan prosedür, farelerden ve insanlardan adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipolitik oranı ölçmek için daha önce yayınlanmış yöntemlere benzer 15,68,69,70,71. Bu protokol, seri örnekleme kullanımına göre farklılık gösterir; Seri örnekleme yaparak, lipolizin doğrusal fazda ölçüldüğünü dahili olarak doğrulayabilir ve lipoliz oranını hesaplamak için birden fazla ölçüm kullanabilir, böylece nihai hesaplanan değere olan güveni artırmak için ölçüm hatasını azaltabiliriz. Seri örneklemenin dezavantajı, tahlilin daha fazla zaman ve reaktif gerektirmesidir; Bununla birlikte, daha uzun zaman dilimi, ölçüm hatasının oran tahminlerinin standart hatası üzerindeki etkisini azaltır. Ek olarak, bu protokol hem FFA hem de gliserol salınımını ölçer ve FFA: gliserol salınımının oranını, tam lipoliz ve lipolitik ürünlerin medyaya salınmasından beklendiği gibi 3: 1 oranına ulaşmak amacıyla dikkate alır72.

Protocol

Tüm hayvanların kullanımı, Cornell Üniversitesi Weill Cornell Tıp Fakültesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Tamponların ve toplama plakalarının hazırlanması 5 g BSA’yı 100 mL Dulbecco’nun modifiye Eagle’s medium (DMEM) içinde fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 sığır serum albümini (BSA) yapın. BSA’yı çözünmesi için hafifçe karıştırın (sallamak verimsizdir). BSA tamamen …

Representative Results

İn vitro diferansiye adipositlerin bazal ve uyarılmış lipolitik oranlarını ölçtük. Kasık beyaz yağ dokusundan primer preadipositler, 5 μM deksametazon, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL insülin ve 1 μM troglitazon ile 4 gün boyunca konfluent hücrelerin tedavisi ile adipositlere farklılaştırıldı ve ardından 1 μg / mL insülin ile 3 günlük ek bir tedavi uygulandı. Hücreler lipoliz tahlilinden önce 24 saat boyunca insülinsülsüz ortamda inkübe edildi. Zaman = 0h’de, hücreler bir kez PBS ile y?…

Discussion

Burada, adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipoliz oranını ölçmek için temel bir protokol sunuyoruz. Lipolizi ölçmek için, doğrusal fazda lipolitik hızı ölçmek önemlidir. Ortamın büyük bir kısmının toplandığı ve düzenli aralıklarla taze ortamlarla değiştirildiği seri örnekleme tekniği kullanıyoruz. Bu yarı konservatif yöntem, FFA tamponlama kapasitesine sahip taze BSA’nın eklenmesine izin verir ve lineer lipoliz süresini uzatarak geri besleme inhibisyonunu geciktirir. Bu d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından S.M.R.’ye R01DK126944 hibesi ile desteklenmiştir.

Materials

24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog–regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3′:5′-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. . Methods in Molecular Biology. , (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

Keywords: LipolysisPreadipocytesMurineEx VivoIn VitroFree Fatty AcidsBSADMEMInsulinDifferentiationDPBSStimulationControlSerial SamplingMeasurementOptimization
check_url/65106?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image