Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Summary

Die Triglycerid-Lipolyse in Adipozyten ist ein wichtiger Stoffwechselprozess, der zur Freisetzung von freien Fettsäuren und Glycerin führt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen und stimulierten Lipolyse in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung.

Abstract

Adipozyten speichern Energie in Form von Triglyceriden in Lipidtröpfchen. Diese Energie kann über die Lipolyse mobilisiert werden, bei der die Fettsäureseitenketten nacheinander vom Glycerinrückgrat abgespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren und Glycerin führt. Aufgrund der geringen Expression der Glycerinkinase in weißen Adipozyten sind die Wiederaufnahmeraten von Glycerin vernachlässigbar, während die Wiederaufnahme von Fettsäuren durch die Fettsäurebindungskapazität von Medienkomponenten wie Albumin bestimmt wird. Sowohl die Freisetzung von Glycerin als auch von Fettsäuren in Medien kann durch kolorimetrische Assays quantifiziert werden, um die lipolytische Rate zu bestimmen. Durch die Messung dieser Faktoren zu mehreren Zeitpunkten kann man die lineare Lipolyserate mit hoher Sicherheit bestimmen. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Messung der Lipolyse in in vitro differenzierten Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen zur Verfügung. Dieses Protokoll kann auch für andere Präadipozyten-Zelllinien oder Fettgewebe aus anderen Organismen optimiert werden. Überlegungen und Optimierungsparameter werden diskutiert. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Rate der Adipozyten-Lipolyse zwischen Mausmodellen und Behandlungen zu bestimmen und zu vergleichen.

Introduction

Überschüssige Nährstoffe werden im weißen Fettgewebe in Form von Triglyceriden im neutralen Lipidkern der Lipidtröpfchen gespeichert. Triglyceridspeicher werden über Lipolyse mobilisiert, ein Prozess, bei dem die Fettsäureseitenketten nacheinander durch Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL) gespalten werden, was zur Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) und des Glycerinrückgrats^{führt 1,2}. Die Lipolyse wird durch Katecholamin-Signalübertragung im Fettgewebe aktiviert. Sympathische Nervenendigungen setzen lokal Katecholamine frei, die an β-adrenerge Rezeptoren auf der Plasmamembran der Adipozyten binden. Nach der Ligandenbindung aktivieren diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) die Adenylylcyclase über G_αs. Die anschließende Aktivierung der Proteinkinase A (PKA) durch cAMP führt zu einer Hochregulation sowohl von ATGL als auch von HSL. Die Phosphorylierung von Perilipin-1 durch PKA bewirkt die Dissoziation von ABHD5 (auch bekannt als CGI-58), das ATGL³ bindet und koaktiviert. PKA phosphoryliert HSL direkt und fördert seine Translokation vom Zytosol zum Lipidtröpfchen, wo die Interaktion mit phosphoryliertem Perilipin-1 die Lipaseaktivität weiter fördert 4,5,6,7. Die dritte Lipase, die an der Lipolyse beteiligt ist, MGL, scheint nicht durch den Katecholamin-Signalweg reguliert^{zu werden 8}. Wichtig ist, dass die Triglyceridsynthese in Adipozyten durch den Glycerinlipidsyntheseweg vermittelt wird, bei dem keine Monoglyceride als Zwischenprodukt gebildet werden. Stattdessen katalysieren Glycerin-3-phosphat-Acyltransferasen die Bildung von Lysophosphatidsäure, die mit einem anderen Fettacyl-CoA zu Phosphatidsäure kombiniert und dann vor der endgültigen Synthese von Triglyceriden zu Diglyceriden isomerisiert wird (Abbildung 1)9,10,11.

Abbildung 1: Lipolyse- und Glycerinlipidsynthesewege. Oben: Lipolytischer Weg; Rot dargestellte Enzyme: Fettgewebe-Triglyceridlipase (ATGL), hormonsensitive Lipase (HSL) und Monoglyceridlipase (MGL). Unten: Glycerin-Lipid-Syntheseweg; Grün dargestellte Enzyme: Diglycerid-Acyltransferase (DGAT), Phosphatidsäure-Phosphatase (PAP), Lysophosphatidsäure-Acyltransferase (LPAT, auch bekannt als LPAATs) und Glycerin-3-Phosphat-Acyltransferase (GPAT). Lipide: Triglyceride (TG), Diglyceride (DG), Monoglyceride (MG), freie Fettsäuren (FFA), Fettacyl-CoA (FA-CoA), Lysophosphatidsäure (LPA) und Phosphatidsäure (PA). Weitere Metaboliten: anorganisches Phosphat (Pi) und Glycerin-3-phosphat (G3P). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Extrazelluläres Adenosin ist ein weiterer wichtiger Regulator der Lipolyse, der durch G_s– und G_i-gekoppelte GPCRs die Aktivität der Adenylcyclase beeinflusst. Der in Adipozyten vorherrschende Adenosinrezeptor ADORA1 hemmt die Adenylylcyclase und damit die Lipolyse durch die Aktivierung von G_i¹². ADORA2A wird in niedrigeren Konzentrationen und vor allem in braunen Adipozyten exprimiert und aktiviert die Lipolyse über den G_s-Signalweg ¹³. ADORA1 beeinflusst sowohl die basale Lipolyse als auch die Reaktion auf adrenerge Agonisten. Die Wirkung von Adenosin auf die Lipolyse kann durch Zugabe von Adenosin-Deaminase zur Neutralisierung von Adenosin sowie des ADORA1-spezifischen Agonisten Phenylisopropyladenosin^14,15 kontrolliert werden. Die hormonelle Aktivierung von G q-gekoppelten GPCRs kann auch die Lipolyse über die Aktivierung der Phospholipase C und der Proteinkinase C^{beeinflussen 16,17,18,19}. Entzündungssignale wirken sich auch auf die lipolytischen Raten aus. Die Aktivierung von TLR4 durch LPS (und andere Endotoxine) erhöht die lipolytische Rate durch die Aktivierung von ERK, das Perilipin-1 und HSL²⁰ phosphoryliert. TNF-α aktiviert auch die Lipolyse über ERK- und NF-κB-Aktivierung sowie die transkriptionelle Herunterregulierung der Phosphodiesterase PDE-3B und CIDEC^21,22,23. IL-6 wurde auch mit einer erhöhten Lipolyse von Adipozyten in Verbindung gebracht, insbesondere im mesenterialen Fettgewebe, dessen FFA-Freisetzung die Lebersteatose und die Gluconeogenese beeinflusst^24,25,26.

Die Lipolyse wird im gefütterten Zustand durch Insulin unterdrückt. AKT phosphoryliert und aktiviert PDE-3B, um den cAMP-Signalweg zu unterdrücken und die PKA-Aktivierung zu verhindern²⁷. Insulin reguliert ATGL²⁸ auch transkriptionell herunter. Adipositas fördert die Katecholaminresistenz durch eine Vielzahl von Mechanismen, einschließlich der Herunterregulierung von β-adrenergen Rezeptoren in Adipozyten 29,30,31,32,33. Adipozyten exprimieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren (β-1, β-2 und β-3). Während β-1 und β-2 adrenerge Rezeptoren ubiquitär exprimiert werden, wird der β-3 adrenerge Rezeptor in Mäusen überwiegend in Adipozyten exprimiert^34,35. Die Expression von Adrb3 wird durch C/EBPα während der Adipogenese induziert³⁶. Der adrenerge Rezeptor β-3 wird in reifen Adipozyten stark exprimiert. Die Aktivierung von β-1 und β-2 adrenergen Rezeptoren ist aufgrund der Rückkopplungshemmung durch β-Arrestin³⁷ selbstlimitierend. Die Hemmung der Rückkopplung des β-3-adrenergen Rezeptors wird durch andere Signalwege vermittelt, die die Adrb3-Expression reduzieren^33,38,39.

Zahlreiche Verbindungen können verwendet werden, um die Lipolyse der Adipozyten zu aktivieren. Katecholamine sind wichtige physiologische Aktivatoren der Lipolyse. Noradrenalin (oder Noradrenalin) und Adrenalin (oder Adrenalin) aktivieren alle drei β-adrenergen Rezeptoren⁴⁰. Noradrenalin und Adrenalin beeinflussen die Lipolyse auch durch die Aktivierung des α-adrenergen Rezeptorsignals⁴¹. Häufig verwendete β-adrenerge Rezeptoragonisten sind Isoproterenol, ein nicht-selektiver β-adrenerger Rezeptoragonist, und die β-3-Adrenosensor-Agonisten CL-316,243 und Mirabegron⁴². Da Adipozyten überwiegend den β-3 adrenergen Rezeptor exprimieren, verwenden wir hier CL-316.243 als Beispiel. Seine Spezifität für den β-3-adrenergen Rezeptor macht es auch zu einem relativ spezifischen Aktivator der Adipozyten-Katecholamin-Signaltransduktion, der auch sicher in vivo verwendet werden kann. Beachten Sie, dass die üblicherweise verwendete Konzentration von 10 μM CL-316,243 in Zellkultur um Größenordnungen höher ist als die ~0,1 μM-Dosis, die erforderlich ist, um ein maximales Ansprechen zu erreichen³³. Forskolin umgeht den adrenergen Rezeptor und aktiviert direkt die Adenylylcyclase und die nachgeschaltete lipolytische Signalübertragung. Es gibt noch viele weitere Aktivatoren sowie Unterdrücker der Lipolyse. Bei der Auswahl einer Verbindung zur Stimulierung der Lipolyse sollten die Rezeptorspezifität und die nachgeschalteten Signalwege innerhalb des experimentellen Designs sorgfältig berücksichtigt werden.

Die Lipolyserate im weißen Fettgewebe ist ein wichtiger Stoffwechselfaktor, der sich auf die Kältetoleranz und die Nährstoffverfügbarkeit während des Fastens oder der körperlichen Betätigung auswirkt^43,44,45,46. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Lipolyserate in Adipozyten und Fettgewebe zu messen, was das Verständnis des Adipozytenstoffwechsels und dessen Auswirkungen auf den metabolischen Phänotyp verschiedener Mausmodelle erleichtern wird. Um die lipolytische Rate zu quantifizieren, messen wir das Vorkommen lipolytischer Produkte in den Medien (d.h. FFAs und Glycerin). Die Methode beruht auf der Freisetzung lipolytischer Produkte aus den Adipozyten in das Medium. Da weiße Adipozyten geringe Mengen an Glycerinkinase exprimieren, sind die Glycerin-Wiederaufnahmeraten niedrig⁴⁷. Umgekehrt sollte auch die Produktion von FFAs und Glycerin über andere Stoffwechselwege als die Lipolyse in Betracht gezogen werden. Adipozyten scheinen eine Phosphatase mit Aktivität gegen Glycerin-3-Phosphat zu exprimieren, was die Produktion von Glycerin aus Glycerin-3-phosphat ermöglicht, das aus Glukose^{abgeleitet wird 48,49,50}. Die Glykolyse ist eine Quelle für Glycerin-3-phosphat, die für die FFA-Wiederveresterung in weißen Adipozyten verwendet wird. Wenn der Glukosespiegel begrenzt ist, benötigt die Glyceroneogenese andere 3-Kohlenstoffquellen wie Laktat und^{Pyruvat 51}. Die Kanalisierung von FFAs, die durch Lipolyse innerhalb der Zelle freigesetzt werden, und ihr metabolisches Schicksal sind nur unzureichend verstanden. FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, müssen in Fettacyl-CoA umgewandelt werden, bevor sie wieder verestert oder einer β-Oxidation unterzogen werden. Es scheint, dass FFAs, die durch Lipolyse freigesetzt werden, wahrscheinlich die Zelle verlassen, bevor sie wieder aufgenommen und in Fettacyl-CoA umgewandelt^werden 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFAs können außerhalb der Zelle durch Albumin sequestriert werden. Wichtig ist, dass langkettige FFAs dafür bekannt sind, die Lipolyse rückkopplungshemmend zu sein, wenn sie nicht durch Albumin 63,64,65,66,67 sequestriert werden. Daher ist die Optimierung der FFA-Pufferkapazität des Mediums während des Lipolyse-Assays von entscheidender Bedeutung. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den bisher veröffentlichten Methoden zur Messung der lipolytischen Rate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe von Mäusen und Menschen 15,68,69,70,71. Dieses Protokoll unterscheidet sich durch die Verwendung von seriellem Sampling; Durch die Durchführung von seriellen Abtastungen können wir intern überprüfen, ob die Lipolyse in der linearen Phase gemessen wird, und mehrere Messungen verwenden, um die Lipolyserate zu berechnen, wodurch Messfehler reduziert werden, um das Vertrauen in den endgültigen berechneten Wert zu erhöhen. Der Nachteil der seriellen Probenahme besteht darin, dass der Assay mehr Zeit und Reagenzien benötigt. Der längere Zeitrahmen verringert jedoch die Auswirkungen von Messfehlern auf den Standardfehler der Schätzungen des Satzes. Darüber hinaus misst dieses Protokoll sowohl die FFA- als auch die Glycerinfreisetzung und berücksichtigt das Verhältnis von FFA:Glycerinfreisetzung mit dem Ziel, ein Verhältnis von 3:1 zu erreichen, wie es bei vollständiger Lipolyse und Freisetzung von lipolytischen Produkten in das Medium zu erwarten wäre⁷².

Protocol

Die Verwendung aller Tiere wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Weill Cornell Medical College der Cornell University genehmigt. 1. Vorbereitung von Puffern und Sammelplatten Stellen Sie 5 % Kälberserumalbumin (BSA) her, indem Sie 5 g BSA in 100 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) ohne Phenolrot auflösen. Rühren Sie das BSA vorsichtig um, damit es sich auflöst (Schütteln ist kontraproduktiv). Sobald das BSA vollständig aufge…

Representative Results

Wir maßen die basale und stimulierte lipolytische Rate von in vitro differenzierten Adipozyten. Primäre Präadipozyten aus inguinalem weißem Fettgewebe wurden durch die Behandlung konfluenter Zellen mit 5 μM Dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml Insulin und 1 μM Troglitazon über 4 Tage zu Adipozyten differenziert, gefolgt von einer zusätzlichen 3-tägigen Behandlung mit 1 μg/ml Insulin. Die Zellen wurden vor dem Lipolyse-Assay 24 h lang in Medien ohne Insulin inkubiert. Zum Zeitpunkt = 0h wurden die Zellen…

Discussion

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll zur Messung der Lipolyserate in Adipozyten und ex vivo Fettgewebe zur Verfügung. Um die Lipolyse zu quantifizieren, ist es wichtig, die lipolytische Rate in der linearen Phase zu messen. Wir verwenden eine serielle Probenahmetechnik, bei der ein großer Teil der Medien gesammelt und in regelmäßigen Abständen durch frische Medien ersetzt wird. Diese semikonservative Methode ermöglicht die Zugabe von frischem BSA mit FFA-Pufferkapazität und verzögert die Rückkop…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work