Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino ex vivo y preadipocitos primarios diferenciados in vitro

Summary

La lipólisis de triglicéridos en los adipocitos es un proceso metabólico importante que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para medir la lipólisis basal y estimulada en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones.

Abstract

Los adipocitos almacenan energía en forma de triglicéridos en gotas de lípidos. Esta energía se puede movilizar a través de la lipólisis, donde las cadenas laterales de ácidos grasos se escinden secuencialmente de la columna vertebral de glicerol, lo que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Debido a la baja expresión de glicerol quinasa en los adipocitos blancos, las tasas de recaptación de glicerol son insignificantes, mientras que la recaptación de ácidos grasos está dictada por la capacidad de unión de ácidos grasos de componentes de medios como la albúmina. Tanto el glicerol como la liberación de ácidos grasos en los medios se pueden cuantificar mediante ensayos colorimétricos para determinar la tasa lipolítica. Al medir estos factores en múltiples puntos de tiempo, se puede determinar la tasa lineal de lipólisis con alta confianza. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la medición de la lipólisis en adipocitos diferenciados in vitro y tejido adiposo ex vivo de ratones. Este protocolo también puede optimizarse para otras líneas celulares de preadipocitos o tejido adiposo de otros organismos; Se discuten las consideraciones y los parámetros de optimización. Este protocolo está diseñado para ser útil en la determinación y comparación de la tasa de lipólisis de adipocitos entre modelos de ratón y tratamientos.

Introduction

El exceso de nutrientes se almacena en el tejido adiposo blanco en forma de triglicéridos en el núcleo lipídico neutro de las gotas de lípidos. Las reservas de triglicéridos se movilizan a través de la lipólisis, un proceso por el cual las cadenas laterales de ácidos grasos son escindidas secuencialmente por la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo (ATGL), la lipasa sensible a las hormonas (HSL) y la lipasa monoglicérida (MGL), lo que resulta en la liberación de ácidos grasos libres (AGL) y la columna vertebral de glicerol ^1,2. La lipólisis se activa por la señalización de catecolaminas en el tejido adiposo. Las terminales nerviosas simpáticas liberan localmente catecolaminas, que se unen a los receptores β-adrenérgicos en la membrana plasmática de los adipocitos. Tras la unión del ligando, estos receptores acoplados a proteínas G (GPCR) activan la adenilil ciclasa a través de G_αs. La activación posterior de la proteína quinasa A (PKA) por cAMP da como resultado la regulación positiva tanto de ATGL como de HSL. La fosforilación de la perilipina-1 por PKA provoca la disociación de ABHD5 (también conocido como CGI-58), que se une y coactiva ATGL³. PKA fosforila directamente HSL, promoviendo su translocación del citosol a la gota lipídica, donde la interacción con la perilipina-1 fosforilada promueve aún más su actividad lipasa 4,5,6,7. La tercera lipasa involucrada en la lipólisis, MGL, no parece estar regulada por la señalización de catecolaminas⁸. Es importante destacar que la síntesis de triglicéridos en los adipocitos está mediada por la vía de síntesis de lípidos de glicerol, que no implica la formación de monoglicéridos como intermediario; en cambio, las glicerol-3-fosfato aciltransferasas catalizan la formación de ácido lisofosfatídico, que se combina con otro acil-CoA graso para formar ácido fosfatídico, y luego se isomeriza a diglicéridos antes de la síntesis final de triglicéridos (Figura 1)9,10,11.

Figura 1: Vías de síntesis de lípidos de lipólisis y lipíleo de lipcerol. Arriba: vía lipolítica; enzimas mostradas en rojo: triglicéridos del tejido adiposo lipasa (ATGL), lipasa sensible a hormonas (HSL) y monoglicéridos lipasa (MGL). Abajo: vía de síntesis de lípidos de glicerol; enzimas mostradas en verde: diglicérido aciltransferasa (DGAT), fosfatasa de ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAT, también conocida como LPAAT) y glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT). Lípidos: triglicéridos (TG), diglicéridos (DG), monoglicéridos (MG), ácidos grasos libres (FFA), acil-CoA grasos (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) y ácido fosfatídico (PA). Otros metabolitos: fosfato inorgánico (Pi) y glicerol 3-fosfato (G3P). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La adenosina extracelular es otro regulador importante de la lipólisis, que trabaja a través de GPCR acoplados a G_s y G_i para afectar la actividad de la adenilciclasa. El receptor de adenosina predominante en los adipocitos, ADORA1, inhibe la adenilil ciclasa y, por lo tanto, la lipólisis a través de la activación de G_i¹². Expresado en niveles más bajos, y principalmente en adipocitos marrones, ADORA2A activa la lipólisis a través de la señalización G_s ¹³. ADORA1 afecta tanto a la lipólisis basal como a la respuesta a los agonistas adrenérgicos. El efecto de la adenosina sobre la lipólisis se puede controlar mediante la adición de adenosina desaminasa para neutralizar la adenosina, así como el agonista específico de ADORA1 fenilisopropiladenosina^14,15. La activación hormonal de los GPCR acoplados a G_q también puede afectar la lipólisis a través de la activación de la fosfolipasa C y la proteína quinasa C^16,17,18,19. Las señales inflamatorias también afectan las tasas lipolíticas. La activación de TLR4 por LPS (y otras endotoxinas) aumenta la tasa lipolítica al activar ERK, que fosforila perilipin-1 y HSL²⁰. El TNF-α también activa la lipólisis a través de la activación de ERK y NF-κB, así como la regulación transcripcional a la baja de la fosfodiesterasa PDE-3B y CIDEC^21,22,23. La IL-6 también se ha asociado con un aumento de la lipólisis de los adipocitos, especialmente en el tejido adiposo mesentérico, cuya liberación de AGF afecta la esteatosis hepática y la gluconeogénesis^24,25,26.

La lipólisis es suprimida durante el estado alimentado por la insulina. AKT fosforila y activa PDE-3B para suprimir la señalización de cAMP y prevenir la activación de PKA²⁷. La insulina también regula transcripcionalmente a la baja ATGL²⁸. La obesidad promueve la resistencia a las catecolaminas a través de una variedad de mecanismos, incluyendo la regulación a la baja de los receptores β-adrenérgicos en los adipocitos 29,30,31,32,33. Los adipocitos expresan los tres receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 y β-3). Mientras que los receptores adrenérgicos β-1 y β-2 se expresan ubicuamente, el receptor adrenérgico β-3 se expresa predominantemente en los adipocitos en ratones^34,35. La expresión de Adrb3 es inducida por C/EBPα durante la adipogénesis³⁶. El receptor adrenérgico β-3 está altamente expresado en adipocitos maduros. La activación de los receptores adrenérgicos β-1 y β-2 es autolimitada debido a la inhibición de la retroalimentación por β-arrestina³⁷. La inhibición por retroalimentación del receptor adrenérgico β-3 está mediada por otras vías de señalización, que reducen la expresión de Adrb3 ^33,38,39.

Se pueden utilizar numerosos compuestos para activar la lipólisis de los adipocitos. Las catecolaminas son los principales activadores fisiológicos de la lipólisis. La norepinefrina (o noradrenalina) y la epinefrina (o adrenalina) activan los tres receptores β-adrenérgicos⁴⁰. La norepinefrina y la epinefrina también afectan la lipólisis a través de la activación de la señalización del receptor α-adrenérgico⁴¹. Los agonistas de los receptores β-adrenérgicos comúnmente utilizados incluyen isoproterenol, que es un agonista no selectivo del receptor β-adrenérgico, y los agonistas del receptor adrenérgico β-3 CL-316,243 y mirabegron⁴². Dado que los adipocitos expresan predominantemente el receptor adrenérgico β-3, utilizamos CL-316,243 como ejemplo aquí. Su especificidad para el receptor adrenérgico β-3 también lo convierte en un activador relativamente específico de la señalización de catecolaminas de adipocitos, que también se puede usar de manera segura in vivo. Tenga en cuenta que la concentración comúnmente utilizada de 10 μM CL-316,243 en cultivo celular es órdenes de magnitud mayor que la dosis de ~ 0.1 μM requerida para lograr una respuesta máxima³³. La forskoline evita el receptor adrenérgico, activando directamente la adenilil ciclasa y la señalización lipolítica aguas abajo. Hay muchos más activadores, así como supresores de la lipólisis. Al seleccionar un compuesto para estimular la lipólisis, la especificidad del receptor y las vías de señalización aguas abajo deben considerarse cuidadosamente dentro del diseño experimental.

La tasa de lipólisis en el tejido adiposo blanco es un factor metabólico importante que afecta la tolerancia al frío y la disponibilidad de nutrientes durante el ayuno o el ejercicio^43,44,45,46. El propósito de este protocolo es medir la tasa de lipólisis en adipocitos y tejido adiposo, lo que facilitará la comprensión del metabolismo de los adipocitos y cómo puede afectar el fenotipo metabólico de varios modelos murinos. Para cuantificar la tasa lipolítica, medimos la aparición de productos lipolíticos en los medios (es decir, AGL y glicerol). El método se basa en la liberación de productos lipolíticos del adipocito en los medios. Dado que los adipocitos blancos expresan niveles bajos de glicerol quinasa, las tasas de recaptación de glicerol son bajas⁴⁷. Por el contrario, también se debe considerar la producción de AGL y glicerol por vías metabólicas distintas de la lipólisis. Los adipocitos parecen expresar una fosfatasa con actividad contra el fosfato de glicerol-3, lo que permite la producción de glicerol a partir de glicerol-3-fosfato derivado de la glucosa^48,49,50. La glucólisis es una fuente de glicerol-3-fosfato utilizada para la reesterificación de FFA en adipocitos blancos. Cuando los niveles de glucosa son limitados, la gliceroneogénesis requiere otras fuentes de 3 carbonos, como lactato y piruvato⁵¹. La canalización de AGL liberados por lipólisis dentro de la célula y su destino metabólico es poco conocida; Los AGL liberados por lipólisis deben convertirse en acil-CoA graso, antes de ser reesterificados o sometidos a β-oxidación. Parece que los AGL liberados por lipólisis probablemente salen de la célula antes de ser tomados de nuevo y convertidos en acil-CoA graso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Los AGF pueden ser secuestrados fuera de la célula por la albúmina. Es importante destacar que se sabe que los AGF de cadena larga inhiben la lipólisis si no son secuestrados por la albúmina 63,64,65,66,67. Por lo tanto, es fundamental optimizar la capacidad de amortiguación de FFA de los medios durante el ensayo de lipólisis. El procedimiento descrito aquí es similar a los métodos publicados anteriormente para medir la tasa lipolítica en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones y humanos 15,68,69,70,71. Este protocolo difiere por el uso de muestreo en serie; Al realizar un muestreo en serie, podemos validar internamente que la lipólisis se mide en la fase lineal y utilizar múltiples mediciones para calcular la tasa de lipólisis, reduciendo así el error de medición para aumentar la confianza en el valor final calculado. El inconveniente del muestreo en serie es que el ensayo requiere más tiempo y reactivos; Sin embargo, el plazo más largo reduce el impacto del error de medición en el error estándar de las estimaciones de la tasa. Además, este protocolo mide tanto la liberación de FFA como la de glicerol, y considera la relación de liberación de FFA:glicerol con el objetivo de lograr una relación de 3:1, como se esperaría de la lipólisis completa y la liberación de productos lipolíticos en los medios⁷².

Protocol

El uso de todos los animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell. 1. Preparación de tampones y placas de recogida Producir albúmina sérica bovina (BSA) al 5% disolviendo 5 g de BSA en 100 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin rojo fenol. Revuelva suavemente el BSA para que se disuelva (agitar es contraproducente). Una vez que el BSA esté compl…

Representative Results

Medimos la tasa lipolítica basal y estimulada de adipocitos diferenciados in vitro. Los preadipocitos primarios del tejido adiposo blanco inguinal se diferenciaron en adipocitos mediante el tratamiento de células confluentes con 5 μM de dexametasona, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml de insulina y 1 μM de troglitazona durante 4 días, seguido de un tratamiento adicional de 3 días con 1 μg/ml de insulina. Las células se incubaron en medios sin insulina durante 24 h antes del ensayo de lipólisis. En el momento = 0h, l…

Discussion

Aquí, proporcionamos un protocolo básico para medir la tasa de lipólisis en adipocitos y tejido adiposo ex vivo . Para cuantificar la lipólisis, es importante medir la tasa lipolítica en la fase lineal. Utilizamos una técnica de muestreo en serie, donde se recolecta una gran fracción de los medios y se reemplaza con medios frescos a intervalos regulares. Este método semiconservador permite la adición de BSA fresco con capacidad de amortiguación FFA y retrasa la inhibición de la retroalimentación, ext…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work