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Biology

पूर्व विवो मुराइन वसा ऊतक और प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स में लिपोलिसिस की दर को मापना विट्रो में विभेदित

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/65106
,
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine,Weill Cornell Medicine

Summary

एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड लिपोलिसिस एक महत्वपूर्ण चयापचय प्रक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड और ग्लिसरॉल की मुक्ति होती है। यहां, हम चूहों से एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक में बेसल और उत्तेजित लिपोलिसिस को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

एडिपोसाइट्स लिपिड बूंदों में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में ऊर्जा संग्रहीत करते हैं। इस ऊर्जा को लिपोलिसिस के माध्यम से जुटाया जा सकता है, जहां फैटी एसिड साइड चेन को ग्लिसरॉल रीढ़ से क्रमिक रूप से अलग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड और ग्लिसरॉल की रिहाई होती है। सफेद एडिपोसाइट्स में ग्लिसरॉल काइनेज की कम अभिव्यक्ति के कारण, ग्लिसरॉल री-अपटेक दर नगण्य है, जबकि फैटी एसिड री-अपटेक एल्बुमिन जैसे मीडिया घटकों की फैटी एसिड बाइंडिंग क्षमता द्वारा निर्धारित किया जाता है। मीडिया में ग्लिसरॉल और फैटी एसिड रिलीज दोनों को लिपोलिटिक दर निर्धारित करने के लिए वर्णमिति परख द्वारा परिमाणित किया जा सकता है। कई समय बिंदुओं पर इन कारकों को मापकर, कोई उच्च आत्मविश्वास के साथ लिपोलिसिस की रैखिक दर निर्धारित कर सकता है। यहां, हम इन विट्रो विभेदित एडिपोसाइट्स और चूहों से पूर्व विवो वसा ऊतक में लिपोलिसिस के माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य जीवों से अन्य प्रीडिपोसाइट्स सेल लाइनों या वसा ऊतक के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है; विचारों और अनुकूलन मापदंडों पर चर्चा की जाती है। यह प्रोटोकॉल माउस मॉडल और उपचार के बीच एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस की दर को निर्धारित करने और तुलना करने में उपयोगी होने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Introduction

अतिरिक्त पोषक तत्व लिपिड बूंदों के तटस्थ लिपिड कोर में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में सफेद वसा ऊतक में संग्रहीत होते हैं। ट्राइग्लिसराइड स्टोर लिपोलिसिस के माध्यम से जुटाए जाते हैं, एक प्रक्रिया जिसके द्वारा फैटी एसिड साइड चेन को क्रमिक रूप से वसा ऊतक ट्राइग्लिसराइड लाइपेस (एटीजीएल), हार्मोन-संवेदनशील लाइपेस (एचएसएल), और मोनोग्लिसराइड लाइपेस (एमजीएल) द्वारा छोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड (एफएफए) और ग्लिसरॉल बैकबोन 1,2 की रिहाई होती है। लिपोलिसिस वसा ऊतक में कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग द्वारा सक्रिय होता है। सहानुभूति तंत्रिका टर्मिनल स्थानीय रूप से कैटेकोलामाइन जारी करते हैं, जो एडिपोसाइट्स प्लाज्मा झिल्ली पर β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स से बंधते हैं। लिगैंड बाइंडिंग पर, ये जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) जी के माध्यम से एडेनिल साइक्लेज को सक्रियकरते हैं। सीएमपी द्वारा प्रोटीन काइनेज ए (पीकेए) के बाद के सक्रियण के परिणामस्वरूप एटीजीएल और एचएसएल दोनों का अपरेगुलेशन होता है। पीकेए द्वारा पेरिलिपिन -1 का फॉस्फोराइलेशन एबीएचडी 5 (सीजीआई -58 के रूप में भी जाना जाता है) के पृथक्करण का कारण बनता है, जो एटीजीएल3 को बांधता है और सह-सक्रिय करता है। पीकेए सीधे एचएसएल को फॉस्फोराइलेट करता है, साइटोसोल से लिपिड बूंद में इसके स्थानांतरण को बढ़ावा देता है, जहां फॉस्फोराइलेटेड पेरिलिपिन -1 के साथ बातचीत आगे इसकी लाइपेस गतिविधि 4,5,6,7 को बढ़ावा देती है। लिपोलिसिस में शामिल तीसरा लाइपेस, एमजीएल, कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग8 द्वारा विनियमित नहीं होता है। महत्वपूर्ण रूप से, एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड संश्लेषण ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग द्वारा मध्यस्थ होता है, जिसमें मध्यवर्ती के रूप में मोनोग्लिसराइड्स का गठन शामिल नहीं होता है; इसके बजाय, ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट एसाइल ट्रांसफेरस लाइसोफॉस्फेटिक एसिड के गठन को उत्प्रेरित करते हैं, जिसे फॉस्फेटिक एसिड बनाने के लिए एक अन्य फैटी एसाइल-सीओए के साथ जोड़ा जाता है, और फिर ट्राइग्लिसराइड्स के अंतिम संश्लेषण से पहले डाइग्लिसराइड्स में आइसोमेराइज्ड किया जाता है (चित्रा 1)9,10,11)।

Figure 1
चित्र 1: लिपोलिसिस और ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग। शीर्ष: लिपोलिटिक मार्ग; लाल रंग में दिखाए गए एंजाइम: वसा ऊतक ट्राइग्लिसराइड लाइपेस (एटीजीएल), हार्मोन संवेदनशील लाइपेस (एचएसएल), और मोनोग्लिसराइड लाइपेस (एमजीएल)। नीचे: ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग; हरे रंग में दिखाए गए एंजाइम: डाइग्लिसराइड एसाइलट्रांसफेरेज़ (डीजीएटी), फॉस्फेटिक एसिड फॉस्फेट (पीएपी), लाइसोफॉस्फेटिक एसिड एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलपीएटी, जिसे एलपीएएटी भी कहा जाता है), और ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट एसाइलट्रांसफेरेज़ (जीपीएटी)। लिपिड: ट्राइग्लिसराइड (टीजी), डाइग्लिसराइड (डीजी), मोनोग्लिसराइड (एमजी), फ्री फैटी एसिड (एफएफए), फैटी एसाइल-सीओए (एफए-सीओए), लाइसोफॉस्फेटिक एसिड (एलपीए), और फॉस्फेटिक एसिड (पीए)। अन्य मेटाबोलाइट्स: अकार्बनिक फॉस्फेट (पीआई) और ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट (जी 3 पी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक्स्ट्रासेल्युलर एडेनोसिन लिपोलिसिस का एक और महत्वपूर्ण नियामक है, जो एडेनिल साइक्लेज गतिविधि को प्रभावित करने के लिए जीएस– और जीआई-युग्मित जीपीसीआर के माध्यम से काम कर रहा है। एडिपोसाइट्स में प्रमुख एडेनोसिन रिसेप्टर, एडीओआरए 1, एडेनिल साइक्लेज को रोकता है, और इस प्रकार जीआई12 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस होता है। निचले स्तर पर व्यक्त, और मुख्य रूप से भूरे रंग के एडिपोसाइट्स में, एडोरा 2 ए जी एस सिग्नलिंग13 के माध्यम से लिपोलिसिस को सक्रिय करताहै। एडोरा 1 बेसल लिपोलिसिस और एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट की प्रतिक्रिया दोनों को प्रभावित करता है। लिपोलिसिस पर एडेनोसिन के प्रभाव को एडेनोसिन को बेअसर करने के लिए एडेनोसिन डीमिनेज को जोड़कर नियंत्रित किया जा सकता है, साथ ही एडीओआरए 1-विशिष्ट एगोनिस्ट फेनिलिसोप्रोपिलडेनोसिन14,15। जीक्यू-युग्मित जीपीसीआर के हार्मोनल सक्रियण फॉस्फोलिपेज़ सी और प्रोटीन काइनेज सी16,17,18,19 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस को भी प्रभावित कर सकते हैं। भड़काऊ संकेत लिपोलिटिक दरों को भी प्रभावित करते हैं। एलपीएस (और अन्य एंडोटॉक्सिन) द्वारा टीएलआर 4 सक्रियण ईआरके को सक्रिय करके लिपोलिटिक दर को बढ़ाता है, जो पेरिलिपिन -1 और एचएसएल20 को फॉस्फोराइलेट करता है। टीएनएफ -α ईआरके और एनएफ-3बी सक्रियण के साथ-साथ फॉस्फोडिएस्टरेज़ पीडीई -3 बी और सीआईडीईसी21,22,23 के ट्रांसक्रिप्शनल डाउनरेगुलेशन के माध्यम से लिपोलिसिस को भी सक्रिय करता है। आईएल -6 को एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस में वृद्धि के साथ भी जोड़ा गया है, विशेष रूप से मेसेंटेरिक वसा ऊतक में, जिसका एफएफए रिलीज यकृत स्टीटोसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस24,25,26 को प्रभावित करता है।

इंसुलिन द्वारा खिलाए गए अवस्था के दौरान लिपोलिसिस को दबा दिया जाता है। एकेटी सीएमपी सिग्नलिंग को दबाने और पीकेए सक्रियण27 को रोकने के लिए पीडीई -3 बी को फॉस्फोराइलेट और सक्रिय करता है। इंसुलिन ट्रांसक्रिप्शनल रूप से एटीजीएल28 को डाउनरेगुलेट करता है। मोटापा विभिन्न तंत्रों के माध्यम से कैटेकोलामाइन प्रतिरोध को बढ़ावा देता है, जिसमें एडिपोसाइट्स 29,30,31,32,33 में β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स का डाउनरेग्यूलेशन शामिल है। एडिपोसाइट्स सभी तीन β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स (β-1, β-2 और β-3) को व्यक्त करते हैं। जबकि β -1 और β -2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए जाते हैं, β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर मुख्य रूप से चूहों34,35 में एडिपोसाइट्स में व्यक्त किया जाता है। एडीआरबी 3 अभिव्यक्ति एडिपोजेनेसिस36 के दौरान सी / ईबीपी द्वारा प्रेरित होती है। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर परिपक्व एडिपोसाइट्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। β-1 और β-2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की सक्रियता β-अरेस्टिन37 द्वारा प्रतिक्रिया अवरोध के कारण आत्म-सीमित है। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर का प्रतिक्रिया निषेध अन्य सिग्नलिंग मार्गों द्वारा मध्यस्थ होता है, जो Adrb3 अभिव्यक्ति33,38,39 को कम करता है।

एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस को सक्रिय करने के लिए कई यौगिकों का उपयोग किया जा सकता है। कैटेकोलामाइन लिपोलिसिस के प्रमुख शारीरिक उत्प्रेरक हैं। नॉरपेनेफ्रिन (या नॉरएड्रेनालाईन) और एपिनेफ्रीन (या एड्रेनालाईन) सभी तीन β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स40 को सक्रिय करते हैं। नॉरपेनेफ्रिन और एपिनेफ्रीन भी α-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सिग्नलिंग41 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस को प्रभावित करते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट में आइसोप्रोटेनॉल शामिल है, जो एक गैर-चयनात्मक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट है, और β-3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट सीएल -316,243 और मिराबेग्रोन42। यह देखते हुए कि एडिपोसाइट्स मुख्य रूप से β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर को व्यक्त करते हैं, हम यहां एक उदाहरण के रूप में सीएल -316,243 का उपयोग करते हैं। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर के लिए इसकी विशिष्टता भी इसे एडिपोसाइट्स कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग का अपेक्षाकृत विशिष्ट उत्प्रेरक बनाती है, जिसे विवो में भी सुरक्षित रूप से उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें कि सेल कल्चर में 10 μM CL-316,243 की आमतौर पर उपयोग की जाने वाली एकाग्रता अधिकतम प्रतिक्रिया33 प्राप्त करने के लिए आवश्यक ~ 0.1 μM खुराक से अधिक परिमाण के आदेश हैं। फोर्सकोलिन एड्रीनर्जिक रिसेप्टर को बाईपास करता है, सीधे एडेनिल साइक्लेज और डाउनस्ट्रीम लिपोलिटिक सिग्नलिंग को सक्रिय करता है। कई और सक्रियकर्ता हैं, साथ ही लिपोलिसिस के शमनकर्ता भी हैं। लिपोलिसिस को उत्तेजित करने के लिए एक यौगिक का चयन करते समय, प्रयोगात्मक डिजाइन के भीतर रिसेप्टर-विशिष्टता और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए।

सफेद वसा ऊतक में लिपोलिसिस की दर उपवास या व्यायाम 43,44,45,46 के दौरान ठंड सहिष्णुता और पोषक तत्वों की उपलब्धता को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण चयापचय कारक है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एडिपोसाइट्स और वसा ऊतक में लिपोलिसिस की दर को मापना है, जो एडिपोसाइट्स चयापचय की समझ की सुविधा प्रदान करेगा और यह विभिन्न मुराइन मॉडल के चयापचय फेनोटाइप को कैसे प्रभावित कर सकता है। लिपोलिटिक दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हम मीडिया (यानी, एफएफए और ग्लिसरॉल) में लिपोलिटिक उत्पादों की उपस्थिति को मापते हैं। विधि एडिपोसाइट्स से मीडिया में लिपोलिटिक उत्पादों की रिहाई पर निर्भर करती है। चूंकि सफेद एडिपोसाइट्स ग्लिसरॉल काइनेज के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, ग्लिसरॉल रीपटेक दर कम47 है। इसके विपरीत, लिपोलिसिस के अलावा चयापचय मार्गों द्वारा एफएफए और ग्लिसरॉल के उत्पादन पर भी विचार किया जाना चाहिए। एडिपोसाइट्स ग्लिसरॉल -3 फॉस्फेट के खिलाफ गतिविधि के साथ एक फॉस्फेट व्यक्त करते हैं, जिससे ग्लूकोज 48,49,50 से प्राप्त ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट से ग्लिसरॉल का उत्पादन संभव होता है। ग्लाइकोलाइसिस ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट का एक स्रोत है जिसका उपयोग सफेद एडिपोसाइट्स में एफएफए री-एस्टरीफिकेशन के लिए किया जाता है। जब ग्लूकोज का स्तर सीमित होता है, तो ग्लिसरोजेनेसिस को अन्य 3-कार्बन स्रोतों की आवश्यकता होती है, जैसे लैक्टेट और पाइरूवेट51। कोशिका के भीतर लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए के चैनलिंग और उनके चयापचय भाग्य को खराब तरीके से समझा जाता है; लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए को फिर से एस्टरिफाइड होने या β-ऑक्सीकरण से गुजरने से पहले फैटी एसाइल-सीओए में परिवर्तित किया जाना चाहिए। ऐसा प्रतीत होता है कि लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए संभवतः वापस लेने से पहले सेल से बाहर निकल जाते हैं और फैटी एसाइल-सीओए 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 में परिवर्तित हो जाते हैं।. एफएफए को एल्ब्यूमिन द्वारा सेल के बाहर अनुक्रमित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, लंबी श्रृंखला वाले एफएफए को फीडबैक-बाधित लिपोलिसिस के लिए जाना जाता है यदि वे एल्ब्यूमिन 63,64,65,66,67 द्वारा अनुक्रमित नहीं होते हैं। इस प्रकार, लिपोलिसिस परख के दौरान मीडिया की एफएफए बफरिंग क्षमता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित प्रक्रिया चूहों और मनुष्यों से एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक 15,68,69,70,71 में लिपोलाइटिक दर को मापने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों के समान है। यह प्रोटोकॉल सीरियल सैंपलिंग के उपयोग के माध्यम से भिन्न होता है; सीरियल सैंपलिंग करके, हम आंतरिक रूप से मान्य कर सकते हैं कि लिपोलिसिस को रैखिक चरण में मापा जा रहा है और लिपोलिसिस की दर की गणना करने के लिए कई मापों का उपयोग करते हैं, जिससे अंतिम गणना मूल्य में आत्मविश्वास बढ़ाने के लिए माप त्रुटि कम हो जाती है। सीरियल सैंपलिंग का दोष यह है कि परख को अधिक समय और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है; हालांकि, लंबी समय सीमा दर के अनुमानों की मानक त्रुटि पर माप त्रुटि के प्रभाव को कम करती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल एफएफए और ग्लिसरॉल रिलीज दोनों को मापता है, और 3: 1 अनुपात प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ एफएफए: ग्लिसरॉल रिलीज के अनुपात पर विचार करता है, जैसा कि पूर्ण लिपोलिसिस और मीडिया72 में लिपोलिटिक उत्पादों की रिहाई से उम्मीद की जाएगी।

Protocol

कॉर्नेल विश्वविद्यालय के वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा सभी जानवरों के उपयोग को मंजूरी दी गई थी। 1. बफर और संग्रह प्लेटों की तैयारी<…

Representative Results

हमने इन विट्रो विभेदित एडिपोसाइट्स के बेसल और उत्तेजित लिपोलिटिक दर को मापा। इंगुइनल सफेद वसा ऊतक से प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स को 4 दिनों के लिए 5 μM डेक्सामेथासोन, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL इंसुलिन, और 1 μM ट्रोग्लिटाज…

Discussion

यहां, हम एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक में लिपोलिसिस की दर को मापने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। लिपोलिसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए, रैखिक चरण में लिपोलिटिक दर को मापन…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर01डीके126944 द्वारा एसएमआर को समर्थित किया गया था।

Materials

24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work
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References

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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).
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