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Biology

पूर्व विवो मुराइन वसा ऊतक और प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स में लिपोलिसिस की दर को मापना विट्रो में विभेदित

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड लिपोलिसिस एक महत्वपूर्ण चयापचय प्रक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड और ग्लिसरॉल की मुक्ति होती है। यहां, हम चूहों से एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक में बेसल और उत्तेजित लिपोलिसिस को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

एडिपोसाइट्स लिपिड बूंदों में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में ऊर्जा संग्रहीत करते हैं। इस ऊर्जा को लिपोलिसिस के माध्यम से जुटाया जा सकता है, जहां फैटी एसिड साइड चेन को ग्लिसरॉल रीढ़ से क्रमिक रूप से अलग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड और ग्लिसरॉल की रिहाई होती है। सफेद एडिपोसाइट्स में ग्लिसरॉल काइनेज की कम अभिव्यक्ति के कारण, ग्लिसरॉल री-अपटेक दर नगण्य है, जबकि फैटी एसिड री-अपटेक एल्बुमिन जैसे मीडिया घटकों की फैटी एसिड बाइंडिंग क्षमता द्वारा निर्धारित किया जाता है। मीडिया में ग्लिसरॉल और फैटी एसिड रिलीज दोनों को लिपोलिटिक दर निर्धारित करने के लिए वर्णमिति परख द्वारा परिमाणित किया जा सकता है। कई समय बिंदुओं पर इन कारकों को मापकर, कोई उच्च आत्मविश्वास के साथ लिपोलिसिस की रैखिक दर निर्धारित कर सकता है। यहां, हम इन विट्रो विभेदित एडिपोसाइट्स और चूहों से पूर्व विवो वसा ऊतक में लिपोलिसिस के माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य जीवों से अन्य प्रीडिपोसाइट्स सेल लाइनों या वसा ऊतक के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है; विचारों और अनुकूलन मापदंडों पर चर्चा की जाती है। यह प्रोटोकॉल माउस मॉडल और उपचार के बीच एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस की दर को निर्धारित करने और तुलना करने में उपयोगी होने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

Introduction

अतिरिक्त पोषक तत्व लिपिड बूंदों के तटस्थ लिपिड कोर में ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में सफेद वसा ऊतक में संग्रहीत होते हैं। ट्राइग्लिसराइड स्टोर लिपोलिसिस के माध्यम से जुटाए जाते हैं, एक प्रक्रिया जिसके द्वारा फैटी एसिड साइड चेन को क्रमिक रूप से वसा ऊतक ट्राइग्लिसराइड लाइपेस (एटीजीएल), हार्मोन-संवेदनशील लाइपेस (एचएसएल), और मोनोग्लिसराइड लाइपेस (एमजीएल) द्वारा छोड़ दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मुक्त फैटी एसिड (एफएफए) और ग्लिसरॉल बैकबोन 1,2 की रिहाई होती है। लिपोलिसिस वसा ऊतक में कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग द्वारा सक्रिय होता है। सहानुभूति तंत्रिका टर्मिनल स्थानीय रूप से कैटेकोलामाइन जारी करते हैं, जो एडिपोसाइट्स प्लाज्मा झिल्ली पर β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स से बंधते हैं। लिगैंड बाइंडिंग पर, ये जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) जी के माध्यम से एडेनिल साइक्लेज को सक्रियकरते हैं। सीएमपी द्वारा प्रोटीन काइनेज ए (पीकेए) के बाद के सक्रियण के परिणामस्वरूप एटीजीएल और एचएसएल दोनों का अपरेगुलेशन होता है। पीकेए द्वारा पेरिलिपिन -1 का फॉस्फोराइलेशन एबीएचडी 5 (सीजीआई -58 के रूप में भी जाना जाता है) के पृथक्करण का कारण बनता है, जो एटीजीएल3 को बांधता है और सह-सक्रिय करता है। पीकेए सीधे एचएसएल को फॉस्फोराइलेट करता है, साइटोसोल से लिपिड बूंद में इसके स्थानांतरण को बढ़ावा देता है, जहां फॉस्फोराइलेटेड पेरिलिपिन -1 के साथ बातचीत आगे इसकी लाइपेस गतिविधि 4,5,6,7 को बढ़ावा देती है। लिपोलिसिस में शामिल तीसरा लाइपेस, एमजीएल, कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग8 द्वारा विनियमित नहीं होता है। महत्वपूर्ण रूप से, एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड संश्लेषण ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग द्वारा मध्यस्थ होता है, जिसमें मध्यवर्ती के रूप में मोनोग्लिसराइड्स का गठन शामिल नहीं होता है; इसके बजाय, ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट एसाइल ट्रांसफेरस लाइसोफॉस्फेटिक एसिड के गठन को उत्प्रेरित करते हैं, जिसे फॉस्फेटिक एसिड बनाने के लिए एक अन्य फैटी एसाइल-सीओए के साथ जोड़ा जाता है, और फिर ट्राइग्लिसराइड्स के अंतिम संश्लेषण से पहले डाइग्लिसराइड्स में आइसोमेराइज्ड किया जाता है (चित्रा 1)9,10,11)।

Figure 1
चित्र 1: लिपोलिसिस और ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग। शीर्ष: लिपोलिटिक मार्ग; लाल रंग में दिखाए गए एंजाइम: वसा ऊतक ट्राइग्लिसराइड लाइपेस (एटीजीएल), हार्मोन संवेदनशील लाइपेस (एचएसएल), और मोनोग्लिसराइड लाइपेस (एमजीएल)। नीचे: ग्लिसरॉल लिपिड संश्लेषण मार्ग; हरे रंग में दिखाए गए एंजाइम: डाइग्लिसराइड एसाइलट्रांसफेरेज़ (डीजीएटी), फॉस्फेटिक एसिड फॉस्फेट (पीएपी), लाइसोफॉस्फेटिक एसिड एसाइलट्रांसफेरेज़ (एलपीएटी, जिसे एलपीएएटी भी कहा जाता है), और ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट एसाइलट्रांसफेरेज़ (जीपीएटी)। लिपिड: ट्राइग्लिसराइड (टीजी), डाइग्लिसराइड (डीजी), मोनोग्लिसराइड (एमजी), फ्री फैटी एसिड (एफएफए), फैटी एसाइल-सीओए (एफए-सीओए), लाइसोफॉस्फेटिक एसिड (एलपीए), और फॉस्फेटिक एसिड (पीए)। अन्य मेटाबोलाइट्स: अकार्बनिक फॉस्फेट (पीआई) और ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट (जी 3 पी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक्स्ट्रासेल्युलर एडेनोसिन लिपोलिसिस का एक और महत्वपूर्ण नियामक है, जो एडेनिल साइक्लेज गतिविधि को प्रभावित करने के लिए जीएस- और जीआई-युग्मित जीपीसीआर के माध्यम से काम कर रहा है। एडिपोसाइट्स में प्रमुख एडेनोसिन रिसेप्टर, एडीओआरए 1, एडेनिल साइक्लेज को रोकता है, और इस प्रकार जीआई12 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस होता है। निचले स्तर पर व्यक्त, और मुख्य रूप से भूरे रंग के एडिपोसाइट्स में, एडोरा 2 ए जी एस सिग्नलिंग13 के माध्यम से लिपोलिसिस को सक्रिय करताहै। एडोरा 1 बेसल लिपोलिसिस और एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट की प्रतिक्रिया दोनों को प्रभावित करता है। लिपोलिसिस पर एडेनोसिन के प्रभाव को एडेनोसिन को बेअसर करने के लिए एडेनोसिन डीमिनेज को जोड़कर नियंत्रित किया जा सकता है, साथ ही एडीओआरए 1-विशिष्ट एगोनिस्ट फेनिलिसोप्रोपिलडेनोसिन14,15। जीक्यू-युग्मित जीपीसीआर के हार्मोनल सक्रियण फॉस्फोलिपेज़ सी और प्रोटीन काइनेज सी16,17,18,19 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस को भी प्रभावित कर सकते हैं। भड़काऊ संकेत लिपोलिटिक दरों को भी प्रभावित करते हैं। एलपीएस (और अन्य एंडोटॉक्सिन) द्वारा टीएलआर 4 सक्रियण ईआरके को सक्रिय करके लिपोलिटिक दर को बढ़ाता है, जो पेरिलिपिन -1 और एचएसएल20 को फॉस्फोराइलेट करता है। टीएनएफ -α ईआरके और एनएफ-3बी सक्रियण के साथ-साथ फॉस्फोडिएस्टरेज़ पीडीई -3 बी और सीआईडीईसी21,22,23 के ट्रांसक्रिप्शनल डाउनरेगुलेशन के माध्यम से लिपोलिसिस को भी सक्रिय करता है। आईएल -6 को एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस में वृद्धि के साथ भी जोड़ा गया है, विशेष रूप से मेसेंटेरिक वसा ऊतक में, जिसका एफएफए रिलीज यकृत स्टीटोसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस24,25,26 को प्रभावित करता है।

इंसुलिन द्वारा खिलाए गए अवस्था के दौरान लिपोलिसिस को दबा दिया जाता है। एकेटी सीएमपी सिग्नलिंग को दबाने और पीकेए सक्रियण27 को रोकने के लिए पीडीई -3 बी को फॉस्फोराइलेट और सक्रिय करता है। इंसुलिन ट्रांसक्रिप्शनल रूप से एटीजीएल28 को डाउनरेगुलेट करता है। मोटापा विभिन्न तंत्रों के माध्यम से कैटेकोलामाइन प्रतिरोध को बढ़ावा देता है, जिसमें एडिपोसाइट्स 29,30,31,32,33 में β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स का डाउनरेग्यूलेशन शामिल है। एडिपोसाइट्स सभी तीन β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स (β-1, β-2 और β-3) को व्यक्त करते हैं। जबकि β -1 और β -2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए जाते हैं, β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर मुख्य रूप से चूहों34,35 में एडिपोसाइट्स में व्यक्त किया जाता है। एडीआरबी 3 अभिव्यक्ति एडिपोजेनेसिस36 के दौरान सी / ईबीपी द्वारा प्रेरित होती है। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर परिपक्व एडिपोसाइट्स में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। β-1 और β-2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की सक्रियता β-अरेस्टिन37 द्वारा प्रतिक्रिया अवरोध के कारण आत्म-सीमित है। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर का प्रतिक्रिया निषेध अन्य सिग्नलिंग मार्गों द्वारा मध्यस्थ होता है, जो Adrb3 अभिव्यक्ति33,38,39 को कम करता है।

एडिपोसाइट्स लिपोलिसिस को सक्रिय करने के लिए कई यौगिकों का उपयोग किया जा सकता है। कैटेकोलामाइन लिपोलिसिस के प्रमुख शारीरिक उत्प्रेरक हैं। नॉरपेनेफ्रिन (या नॉरएड्रेनालाईन) और एपिनेफ्रीन (या एड्रेनालाईन) सभी तीन β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स40 को सक्रिय करते हैं। नॉरपेनेफ्रिन और एपिनेफ्रीन भी α-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सिग्नलिंग41 के सक्रियण के माध्यम से लिपोलिसिस को प्रभावित करते हैं। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट में आइसोप्रोटेनॉल शामिल है, जो एक गैर-चयनात्मक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट है, और β-3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट सीएल -316,243 और मिराबेग्रोन42। यह देखते हुए कि एडिपोसाइट्स मुख्य रूप से β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर को व्यक्त करते हैं, हम यहां एक उदाहरण के रूप में सीएल -316,243 का उपयोग करते हैं। β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर के लिए इसकी विशिष्टता भी इसे एडिपोसाइट्स कैटेकोलामाइन सिग्नलिंग का अपेक्षाकृत विशिष्ट उत्प्रेरक बनाती है, जिसे विवो में भी सुरक्षित रूप से उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें कि सेल कल्चर में 10 μM CL-316,243 की आमतौर पर उपयोग की जाने वाली एकाग्रता अधिकतम प्रतिक्रिया33 प्राप्त करने के लिए आवश्यक ~ 0.1 μM खुराक से अधिक परिमाण के आदेश हैं। फोर्सकोलिन एड्रीनर्जिक रिसेप्टर को बाईपास करता है, सीधे एडेनिल साइक्लेज और डाउनस्ट्रीम लिपोलिटिक सिग्नलिंग को सक्रिय करता है। कई और सक्रियकर्ता हैं, साथ ही लिपोलिसिस के शमनकर्ता भी हैं। लिपोलिसिस को उत्तेजित करने के लिए एक यौगिक का चयन करते समय, प्रयोगात्मक डिजाइन के भीतर रिसेप्टर-विशिष्टता और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए।

सफेद वसा ऊतक में लिपोलिसिस की दर उपवास या व्यायाम 43,44,45,46 के दौरान ठंड सहिष्णुता और पोषक तत्वों की उपलब्धता को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण चयापचय कारक है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एडिपोसाइट्स और वसा ऊतक में लिपोलिसिस की दर को मापना है, जो एडिपोसाइट्स चयापचय की समझ की सुविधा प्रदान करेगा और यह विभिन्न मुराइन मॉडल के चयापचय फेनोटाइप को कैसे प्रभावित कर सकता है। लिपोलिटिक दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए, हम मीडिया (यानी, एफएफए और ग्लिसरॉल) में लिपोलिटिक उत्पादों की उपस्थिति को मापते हैं। विधि एडिपोसाइट्स से मीडिया में लिपोलिटिक उत्पादों की रिहाई पर निर्भर करती है। चूंकि सफेद एडिपोसाइट्स ग्लिसरॉल काइनेज के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, ग्लिसरॉल रीपटेक दर कम47 है। इसके विपरीत, लिपोलिसिस के अलावा चयापचय मार्गों द्वारा एफएफए और ग्लिसरॉल के उत्पादन पर भी विचार किया जाना चाहिए। एडिपोसाइट्स ग्लिसरॉल -3 फॉस्फेट के खिलाफ गतिविधि के साथ एक फॉस्फेट व्यक्त करते हैं, जिससे ग्लूकोज 48,49,50 से प्राप्त ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट से ग्लिसरॉल का उत्पादन संभव होता है। ग्लाइकोलाइसिस ग्लिसरॉल -3-फॉस्फेट का एक स्रोत है जिसका उपयोग सफेद एडिपोसाइट्स में एफएफए री-एस्टरीफिकेशन के लिए किया जाता है। जब ग्लूकोज का स्तर सीमित होता है, तो ग्लिसरोजेनेसिस को अन्य 3-कार्बन स्रोतों की आवश्यकता होती है, जैसे लैक्टेट और पाइरूवेट51। कोशिका के भीतर लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए के चैनलिंग और उनके चयापचय भाग्य को खराब तरीके से समझा जाता है; लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए को फिर से एस्टरिफाइड होने या β-ऑक्सीकरण से गुजरने से पहले फैटी एसाइल-सीओए में परिवर्तित किया जाना चाहिए। ऐसा प्रतीत होता है कि लिपोलिसिस द्वारा जारी एफएफए संभवतः वापस लेने से पहले सेल से बाहर निकल जाते हैं और फैटी एसाइल-सीओए 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 में परिवर्तित हो जाते हैं।. एफएफए को एल्ब्यूमिन द्वारा सेल के बाहर अनुक्रमित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, लंबी श्रृंखला वाले एफएफए को फीडबैक-बाधित लिपोलिसिस के लिए जाना जाता है यदि वे एल्ब्यूमिन 63,64,65,66,67 द्वारा अनुक्रमित नहीं होते हैं। इस प्रकार, लिपोलिसिस परख के दौरान मीडिया की एफएफए बफरिंग क्षमता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित प्रक्रिया चूहों और मनुष्यों से एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक 15,68,69,70,71 में लिपोलाइटिक दर को मापने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों के समान है। यह प्रोटोकॉल सीरियल सैंपलिंग के उपयोग के माध्यम से भिन्न होता है; सीरियल सैंपलिंग करके, हम आंतरिक रूप से मान्य कर सकते हैं कि लिपोलिसिस को रैखिक चरण में मापा जा रहा है और लिपोलिसिस की दर की गणना करने के लिए कई मापों का उपयोग करते हैं, जिससे अंतिम गणना मूल्य में आत्मविश्वास बढ़ाने के लिए माप त्रुटि कम हो जाती है। सीरियल सैंपलिंग का दोष यह है कि परख को अधिक समय और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है; हालांकि, लंबी समय सीमा दर के अनुमानों की मानक त्रुटि पर माप त्रुटि के प्रभाव को कम करती है। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल एफएफए और ग्लिसरॉल रिलीज दोनों को मापता है, और 3: 1 अनुपात प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ एफएफए: ग्लिसरॉल रिलीज के अनुपात पर विचार करता है, जैसा कि पूर्ण लिपोलिसिस और मीडिया72 में लिपोलिटिक उत्पादों की रिहाई से उम्मीद की जाएगी।

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Protocol

कॉर्नेल विश्वविद्यालय के वेइल कॉर्नेल मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा सभी जानवरों के उपयोग को मंजूरी दी गई थी।

1. बफर और संग्रह प्लेटों की तैयारी

  1. फिनोल लाल के बिना डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 100 मिलीलीटर में 5 ग्राम बीएसए को घोलकर 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) बनाएं। धीरे से बीएसए को भंग करने के लिए हिलाएं (हिलाना अनुत्पादक है)। एक बार बीएसए पूरी तरह से भंग हो जाने के बाद, 0.2 μm फ़िल्टर के साथ मीडिया को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। बीएसए मीडिया को 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. नियंत्रण और उत्तेजना मीडिया की कामकाजी सांद्रता बनाएं। नियंत्रण मीडिया: वाहन नियंत्रण के साथ 5% बीएसए मीडिया। उत्तेजना मीडिया: 0.5 μM CL-316,243 के साथ 5% बीएसए मीडिया। प्रत्येक प्रयोग के लिए ताजा उत्तेजना मीडिया बनाएं।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग करने के लिए मीडिया को गर्म करें। मीडिया संग्रह के लिए 96-वेल प्लेट लेबल करें।

2. नमूना तैयार करना

  1. नीचे वर्णित के रूप में सेल संस्कृति का प्रदर्शन करें। बाहरी संदूषण को कम करने के लिए बाँझ फ्यूम हुड में सभी सेल कार्य करें।
    1. 73,74 के रूप में प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स को अलग करें और अलग करें।
      1. उच्च घनत्व पर प्लेट प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स, जैसे कि 1 एमएल / वेल कल्चर मीडिया में 24-वेल प्लेट में 1 x10 5 कोशिकाएं / अच्छी तरह से (डीएमईएम / एफ 12 में 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन)।
      2. कोशिकाओं के 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद, 3 दिनों के लिए कल्चर मीडिया में 5 μM डेक्सामेथासोन, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μg / mL इंसुलिन, और 1 μM थियाज़ोलिडिनेडियोन (TZD) के साथ अंतर करें। फिर, लिपिड बूंदों को विकसित करने के लिए कम से कम 3 दिनों के लिए 1 μg / mL इंसुलिन के साथ कल्चर मीडिया में बदलें। 24-वेल प्लेट में 1 एमएल / वेल मीडिया का उपयोग करें।
      3. हर 2 या 3 दिनों में इंसुलिन के साथ कल्चर मीडिया (1 मिलीलीटर / वेल) बदलें। कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक इंसुलिन के साथ मीडिया में बनाए रखा जा सकता है। केवल उन संस्कृतियों का उपयोग करें जिनमें भेदभाव दर 90% से अधिक है और इस परख के लिए समूहों में समान हैं, क्योंकि कम भेदभाव को लिपोलिटिक दर में कमी के रूप में गलत समझा जा सकता है।
      4. लिपोलिसिस को मापने से पहले 24 घंटे के लिए इंसुलिन मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को कल्चर करें।
        नोट: मीडिया में इंसुलिन लिपिड बूंदों को बनाए रखता है, लेकिन लिपोलिसिस को भी रोकता है। 24 घंटे के लिए इंसुलिन के बिना इनक्यूबेशन लिपिड बूंद की मात्रा के नुकसान के बिना पूर्ण लिपोलिटिक सक्रियण की अनुमति देता है। कुछ प्रणालियों में, इंसुलिन के बिना संस्कृति समय को छोटा या विस्तारित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. कल्चर मीडिया से अवशिष्ट सीरम को हटाने के लिए एक बार डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में सीरम भुखमरी शामिल नहीं है, जो लिपोलिसिस को सक्रिय कर सकती है। सीरम भुखमरी शोधकर्ता के विवेक पर नियोजित की जा सकती है।
  2. नीचे वर्णित के रूप में पूर्व विवो संस्कृति का प्रदर्शन करें।
    1. प्रत्येक माउस से एकत्र किए जाने वाले प्रत्येक ऊतक के लिए एक कुएं के साथ एक 6-वेल प्लेट तैयार करें। उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक कुएं में कमरे के तापमान डीएमईएम के 4 मिलीलीटर रखें।
      नोट: संग्रह मीडिया में बीएसए आवश्यक नहीं है।
    2. लिपोलिसिस परख के लिए एक 48-वेल प्लेट तैयार करें, जिसमें प्रत्येक प्रतिकृति के लिए एक अच्छी तरह से हो। उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक कुएं में कमरे के तापमान डीएमईएम के 400 μL रखें। प्रति माउस प्रति ऊतक दो से चार नियंत्रण और दो से चार उत्तेजित कुओं का उपयोग करें।
    3. द्विपक्षीय न्यूमोथोरैक्स जैसी द्वितीयक विधि के साथ, संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। यहां, हमने 32 ग्राम, 7 महीने की महिला सी 57बीएल / 6 जे माउस का उपयोग किया, जिसे 4 महीने के लिए 45% उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया गया।
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग पुरुषों, साथ ही अन्य उपभेदों, आहार और उम्र के लिए भी किया जा सकता है।
    4. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और पेट की त्वचा के केंद्र में एक छोटा (~ 1 सेमी) पार्श्व चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें, अंगूठे और फोरफिंगर के साथ दोनों तरफ चुटकी लेकर त्वचा को अलग करें और पीछे के चमड़े के नीचे के डिपो को प्रकट करने के लिए निचले पेट की त्वचा को मोड़ें। इंगुइनल लिम्फ नोड का पता लगाएं और निकालें और बल का उपयोग करके इंगुइनल लिम्फ नोड के तुरंत पीछे के इंगुइनल एडीपोज ऊतक को कुंद करें।
    5. गोनाडल वसा ऊतक को इकट्ठा करने के लिए, पेरिटोनियल गुहा तक पहुंचने के लिए पेरिटोनियम में एक पार्श्व और एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। गोनाडल वसा पैड को चिमटी के साथ पकड़ें और गोनाडल वसा ऊतक को हटाने के लिए गर्भाशय (या पुरुषों के लिए एपिडीडिमिस) के साथ काट लें। एकत्र किए गए डिपो को 6-वेल प्लेट में रखें।
    6. ऊतक को अच्छी तरह से निकालें, सिलिकॉन मैट पर रखें, और कैंची के साथ 5 से 7 मिलीग्राम के टुकड़ों में काट लें।
    7. प्रत्येक परख के लिए 25 से 30 मिलीग्राम (पांच या छह हिस्से) का वजन अच्छी तरह से करें और 48-अच्छी परख प्लेट में रखें। किसी भी मीडिया को हटाने के लिए वजन करने से पहले एक साफ तौलिया पर ऊतक को धब्बा दें। ऊतक को हटाने के बाद वजन नाव का वजन करें और पीछे छोड़े गए किसी भी अवशेष के वजन को रिकॉर्ड करें। वजन नाव को पोंछें, नमूनों के बीच साफ करें और यदि आवश्यक हो तो फिर से तैयार करें। प्रत्येक ऊतक के लिए एक नई वजन नाव का उपयोग करें।
    8. एक बार सभी ऊतक के नमूनों का वजन हो जाने के बाद, 48-अच्छी परख प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 10% सीओ2 इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए रखें।

3. लिपोलिसिस परख

  1. मीडिया संग्रह निष्पादित करें. बाहरी स्रोतों से संभावित संदूषण को कम करने के लिए मीडिया का हस्तांतरण और बाद में एक बाँझ फ्यूम हुड में नमूना संग्रह करना।
    1. टी = 0 पर, मीडिया को हटा दें और नियंत्रण या उत्तेजना मीडिया के प्रति कुएं में 400 μL जोड़ें, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 10% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। पूर्व विवो ऊतक संस्कृति के लिए, पिपेट का उपयोग करके मीडिया को सावधानीपूर्वक हटा दें; सक्शन का उपयोग कभी नहीं किया जाना चाहिए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, नियंत्रण और उत्तेजना मीडिया के साथ एक दूसरी प्लेट तैयार करें, और ऊतकों को स्थानांतरित करें।
    2. टी = 1, 2, 3 और 4 घंटे पर, 200 μL मीडिया एकत्र करें, उपयुक्त नियंत्रण या उत्तेजना मीडिया के 200 μL के साथ बदलें, और परख प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें। संग्रह प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बीएसए मीडिया की एफएफए बफरिंग क्षमता निर्धारित करने के लिए, 24 घंटे पर एक अतिरिक्त संग्रह का उपयोग करें।
      नोट: प्रयोगों को यहां रोका जा सकता है, और एकत्र किए गए मीडिया को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. एफएफए कलरमेट्रिक परख

  1. अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर गर्म करें और विलायक ए की एक बोतल के साथ रंग अभिकर्मक ए की एक बोतल और विलायक बी की एक बोतल के साथ रंग अभिकर्मक बी की एक बोतल घोलें। पुनर्गठन की तारीख से, इन अभिकर्मकों को 1 सप्ताह के भीतर सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है। पुनर्गठन के 1 महीने बाद छोड़ दें।
  2. नमूनों को पिघलाएं और मिलाएं।
  3. एक एफएफए मानक वक्र बनाएँ। मानक समाधान 1 mM है। मानक वक्र के लिए अभिकर्मकों के साथ निम्नलिखित मात्रा का उपयोग करें: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1: 2 कमजोर पड़ना), 10 μL (1: 4 कमजोर पड़ना), 10 μL (1: 8 कमजोर पड़ना), और अधिकतम सीमा के लिए 10 μL पानी। कम एफएफए स्तरों के लिए, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM और 0.05 mM मानक के 10 μL अधिक लागू हो सकते हैं।
  4. पिपेट मानकों और नमूनों को 96-अच्छी तरह से परख प्लेट में बदलना। अनुशंसित नमूना मात्रा 10 μL है। पृष्ठभूमि सुधार के लिए नमूने के रूप में बीएसए मीडिया की समान मात्रा वाले तीन कुएं शामिल करें।
    नोट: यदि नमूना सांद्रता मानक वक्र की सीमा से बाहर आती है, तो नमूना मात्रा को 2-25 μL में समायोजित करते हुए परख दोहराएं।
  5. प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक ए के 150 μL जोड़ें और मिलाएं। बुलबुले पैदा करने से बचें। किसी भी बुलबुले को एक बढ़िया गेज सुई के साथ पॉप करें। परख प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 550 एनएम और 660 एनएम संदर्भ (रीडिंग ए) पर प्लेट के अवशोषण को पढ़ें।
  7. प्रत्येक कुएं में अभिकर्मक बी के 75 μL जोड़ें और मिलाएं। बुलबुले पैदा करने से बचें। किसी भी बुलबुले को एक बढ़िया गेज सुई के साथ पॉप करें। परख प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. 550 एनएम और 660 एनएम संदर्भ (रीडिंग बी) पर प्लेट के अवशोषण को फिर से पढ़ें।

5. ग्लिसरॉल वर्णमिति परख

  1. 36 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी के साथ मुक्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक का पुनर्गठन करें और कमरे के तापमान के अनुकूल हों। इन अभिकर्मकों को कुछ हफ्तों के भीतर सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है। पुनर्गठन के 2 महीने बाद छोड़ दें।
  2. नमूनों को पिघलाएं और मिलाएं।
  3. ग्लिसरॉल मानक समाधान और पानी खाली के सात बिंदु, 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने से ग्लिसरॉल मानक वक्र बनाएं।
    नोट: मानक वक्र 2.8 एमएम ग्लिसरॉल के 25 μL तक अपेक्षाकृत रैखिक है, लेकिन उच्च सांद्रता पर रैखिक नहीं है।
  4. पिपेट 25 μL मानक और नमूने 96-अच्छी परख प्लेट में प्रत्येक। पृष्ठभूमि सुधार के लिए बीएसए मीडिया के साथ तीन कुएं शामिल करें।
  5. प्रत्येक कुएं में 175 μL मुक्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक जोड़ें और मिलाएं। बुलबुले पैदा करने से बचें। किसी भी बुलबुले को एक बढ़िया गेज सुई के साथ पॉप करें। परख प्लेट को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 540 एनएम पर प्लेट के अवशोषण को पढ़ें।

6. लिपोलिटिक दर की गणना

  1. ऑप्टिकल घनत्व (OD) मानों से प्रारंभ करें। ग्लिसरॉल के लिए, सीधे ए540 ओडी मानों का उपयोग करें। निम्नलिखित सूत्र के अनुसार एफएफए परख के ओडी की गणना करें:
    OD = (पढ़ना B: A 550 - A 660) - (पढ़ना A: A550 - A660)
  2. एकत्र किए गए नमूनों में एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर की गणना करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें। मानक ओडी मानों को वाई-अक्ष पर प्लॉट करें, और एक्स-अक्ष पर, नमूना मात्रा के सापेक्ष मानक सांद्रता का उपयोग करें (यानी, 10 μL नमूने वाली प्लेट पर 1 mM FFA मानक के 20 μL के साथ कुओं की एकाग्रता 2 mM के बराबर है)। एक रैखिक ट्रेंडलाइन फिट करें:
    y = mx + b
  3. मानक वक्र का नेत्रहीन निरीक्षण करें और परख की रैखिक सीमा के बाहर किसी भी बिंदु को हटा दें। समीकरण का उपयोग करके नमूना सांद्रता की गणना करें:
    नमूना एकाग्रता: x = (OD - b) ÷ m
  4. रैखिक परख सीमा के बाहर गिरने वाले नमूनों को समायोजित और पुन: परख करें। अंतिम नमूना एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, नमूनों की एकाग्रता से केवल बीएसए मीडिया युक्त पृष्ठभूमि कुओं की एकाग्रता को घटाएं।
  5. सूत्र के अनुसार, प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक नमूने द्वारा उत्पादित एफएफए और ग्लिसरॉल के मोल्स की गणना करें:
    Equation 1
    जहां समय पर C n = एकाग्रता t = n; Vt = कुएं में कुल मात्रा; वीएस = नमूना संग्रह मात्रा; और एम एन = मोल्स समय पर उत्पादित टी = एन (जब सांद्रता एमएम में होती है और वॉल्यूम एमएल में होती है तो आउटपुट μMol होता है)।
    उदाहरण के लिए, विभिन्न समय बिंदुओं पर:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2 + C3)Vs
    नहीं तो
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. μmol / g की इकाइयों को प्राप्त करने के लिए ग्राम में प्रत्येक नमूने के लिए ऊतक वजन से विभाजित करके ऊतक के वजन को सामान्य करें। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, मूल्यों को μmol / well के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सुनिश्चित करें कि सेल संख्या और भेदभाव दक्षता अच्छी तरह से तुलनीय है।
    नोट: प्रसार या भेदभाव दक्षता में अंतर परिणामों की व्याख्या को जटिल करेगा और सामान्यीकरण की एक और विधि की आवश्यकता होगी (उदाहरण के लिए, प्रोटीन के लिए सामान्यीकरण; चर्चा देखें)।
  7. प्रत्येक नमूने के लिए उत्पादित μmol/g (y-अक्ष) बनाम समय (x-अक्ष) की ढलान की गणना अलग-अलग करें।
    1. एक स्प्रेडशीट में, यह = स्लोप (known_ys,known_xs) फ़ंक्शन का उपयोग करके किया जा सकता है। एक नए सेल में, टाइप करें "= स्लोप" (फिर नमूना ग्लिसरॉल या एफएफए मानों को μmol / g में हाइलाइट करने के लिए कर्सर का उपयोग करें, फिर संबंधित समय मानों को उजागर करने के लिए)।
    2. डेटा की रैखिकता की जाँच करें। आर2 मान नमूने की रैखिकता निर्धारित करने का एक त्वरित तरीका है। एक स्प्रेडशीट में, यह = आरएसक्यू (known_ys,known_xs) फ़ंक्शन का उपयोग करके किया जा सकता है, उसी तरह से जैसा कि चरण 6.7.1 में वर्णित है, लेकिन प्रारंभिक इनपुट = आरएसक्यू है। सुनिश्चित करें कि आर2 मान 0.98 > हैं; निम्न मान रैखिकता से विचलन का संकेत देते हैं। यह माप / नमूना त्रुटि या रैखिकता के नुकसान के परिणामस्वरूप हो सकता है।
      1. रैखिकता का परीक्षण करने का एक और तरीका प्रत्येक नमूने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन करना और अवशिष्ट को प्लॉट करना है। एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक समय बिंदु के लिए एकल वाई मान के साथ एक एक्सवाई तालिका उत्पन्न करें। सरल रैखिक प्रतिगमन > विश्लेषण का चयन करें और ओके हिट करने से पहले अवशिष्ट प्लॉट के लिए बॉक्स का चयन करें। अवशिष्ट प्लॉट एक नए ग्राफ के रूप में दिखाई देगा।
  8. सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन दर (यानी, ढलान [(μmol/g/h)) का उपयोग एक व्यक्तिगत डेटा बिंदु के रूप में करें, और यदि विभिन्न लिपोलिटिक स्थितियों की तुलना की जा रही हो तो प्लॉट मान। यदि जीनोटाइप में लिपोलिटिक दरों की तुलना की जा रही है, तो तकनीकी प्रतिकृति के रूप में प्रति जानवर दो या तीन नमूनों का उपयोग करें, और प्रति जानवर एक डेटा बिंदु के लिए औसत का उपयोग करें, ताकि नमूना आकार जानवरों की संख्या के बराबर हो।

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Representative Results

हमने इन विट्रो विभेदित एडिपोसाइट्स के बेसल और उत्तेजित लिपोलिटिक दर को मापा। इंगुइनल सफेद वसा ऊतक से प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स को 4 दिनों के लिए 5 μM डेक्सामेथासोन, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL इंसुलिन, और 1 μM ट्रोग्लिटाज़ोन के साथ कॉन्फ्लुएंट कोशिकाओं के उपचार द्वारा एडिपोसाइट्स में विभेदित किया गया था, इसके बाद 1 μg / mL इंसुलिन के साथ एक अतिरिक्त 3 दिन का उपचार किया गया था। लिपोलिसिस परख से पहले 24 घंटे के लिए इंसुलिन के बिना मीडिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया गया था। समय = 0 h पर, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ एक बार धोया गया था, फिर 2% बीएसए के साथ फिनोल लाल-मुक्त डीएमईएम, जिसमें 10 μM CL-316,243 या वाहन नियंत्रण शामिल था, को 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया था। समय = 1 घंटे, 2 घंटे, 3 घंटे, और 4 घंटे, 50% मीडिया एकत्र किया गया था और फिनोल लाल-मुक्त डीएमईएम में 2% बीएसए के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर को एकत्र किए गए मीडिया और एफएफए के मोल्स में मापा गया था, और मीडिया में स्रावित ग्लिसरॉल की गणना प्रत्येक समय बिंदु (चित्रा 2 ए, बी) पर की गई थी। एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन 4 एच परख के लिए रैखिक थे, जिसमें 0.98 और उससे अधिक के आर2 मान थे। 4 एच एफएफए का स्तर थोड़ा कम था, यह दर्शाता है कि लिपोलिटिक दर धीमी हो सकती है; हालांकि, 4 घंटे के समय बिंदु के साथ और बिना विश्लेषण का गणना की गई लिपोलिटिक दर पर महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। उत्तेजित लिपोलिटिक दरें बेसल दरों (चित्रा 2 सी) की तुलना में काफी अधिक थीं। लिपोलिटिक उत्तेजना के परिणामस्वरूप सभी एकत्र किए गए नमूनों में लगभग 3: 1 दाढ़ अनुपात में एफएफए और ग्लिसरॉल का उत्पादन हुआ, जैसा कि महत्वपूर्ण रीपटेक या प्रतिधारण के बिना पूर्ण ट्राइग्लिसराइड लिपोलिसिस से उम्मीद की जाएगी (चित्रा 2 डी)। हालांकि, उत्तेजित कोशिकाओं में, अनुपात 1 के करीब था, जो ग्लिसरॉल 48,49,50 के गैर-लिपोलिटिक स्रोत का सुझाव देता है।

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो विभेदित प्राथमिक एडिपोसाइट्स में लिपोलिटिक दर। प्रीडिपोसाइट्स को 12-वेल प्लेट में विभेदित किया गया था। लिपोलिटिक परख से 24 घंटे पहले मीडिया से इंसुलिन को हटा दिया गया था। समय = 0 घंटे पर, कोशिकाओं को 10 μM CL-316,243 (CL) के साथ उत्तेजित किया गया था या वाहन (V) नियंत्रण मीडिया के साथ इलाज किया गया था। प्रत्येक समय बिंदु द्वारा प्रत्येक कुएं में उत्पादित (ए) एफएफए और (बी) ग्लिसरॉल के एनएमओएल को समय के साथ प्लॉट किया गया था, और प्रत्येक व्यक्ति के लिए एक रैखिक प्रतिगमन रेखा अच्छी तरह से फिट की गई थी। (ग) एफएफए उत्पादन की दर। (डी) ग्लिसरॉल उत्पादन की दर। डेटा को प्रत्येक समय बिंदु पर एकत्रित मीडिया में एफएफए: ग्लिसरॉल के औसत ± एसईएम के रूप में दर्शाया जाता है। (सी) और (डी) में सांख्यिकीय विश्लेषण एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था; सीएल का प्रभाव α = 0.05 पर महत्वपूर्ण था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल कल्चर में, कोशिकाओं का मोनोलेयर मीडिया के सीधे संपर्क में होता है, जबकि ऊतकों में सुसंस्कृत पूर्व विवो, केंद्र में कोशिकाएं मीडिया के संपर्क में नहीं होती हैं। इस प्रकार, पूर्व विवो संस्कृतियों में, एफएफए को ऊतक के भीतर बनाए रखने की अधिक संभावना है। ऊतक के बड़े हिस्से, जिनमें आयतन अनुपात के लिए कम सतह क्षेत्र होता है, एफएफए प्रतिधारण की उच्च दर प्रदर्शित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एफएफए: ग्लिसरॉल मोलर अनुपात कम होता है (चित्रा 3 ए)। घटते ऊतक खंड के आकार के साथ, एफएफए: ग्लिसरॉल का दाढ़ अनुपात 3: 1 तक पहुंच ता है (चित्रा 3 ए)। हालांकि, ऊतक के टुकड़े भी बहुत छोटे हो सकते हैं। वसा ऊतक के छोटे टुकड़ों के साथ काम करने की चुनौती के अलावा, वसा ऊतक के 1-2 मिलीग्राम टुकड़े कम लिपोलिटिक दर प्रदर्शित करते हैं, जो ऊतक की कम व्यवहार्यता और कार्यक्षमता का सुझाव देते हैं (चित्रा 3 बी, सी)। जबकि वसा ऊतक को सुसंगत आकार और आकार के टुकड़ों में काटना थकाऊ और समय लेने वाला है, तुलनीय और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करना आवश्यक है। हम वसा ऊतक के 5 से 10 मिलीग्राम टुकड़े की सलाह देते हैं, लेकिन स्थिरता सबसे महत्वपूर्ण है। लिपोलिटिक दरों को अभी भी बड़े ऊतक खंडों में मापा जा सकता है, हालांकि, एफएफए 63,64,65,66,67 द्वारा लिपोलिसिस के प्रतिक्रिया निषेध पर विचार करना महत्वपूर्ण है।

Figure 3
चित्रा 3: एफएफए रिलीज और लिपोलिटिक दर पर ऊतक खंड के आकार का प्रभाव। उच्च वसा वाले आहार से गोनाडल सफेद वसा ऊतक को मादा C57Bl / 6J माउस खिलाया गया और अलग-अलग आकार के टुकड़ों में काटा गया। सभी कुओं में कुल मिलाकर 25-30 मिलीग्राम वसा ऊतक होते हैं; 25 मिलीग्राम कुओं के लिए, यह ऊतक का एक हिस्सा था; 10 मिलीग्राम कुओं में ~ 10 मिलीग्राम के ऊतक के तीन हिस्से थे, 5 मिलीग्राम कुओं में ऊतक के पांच या छह टुकड़े थे, और 2 मिलीग्राम कुओं में 13-16 टुकड़े थे। समय = 0 घंटे पर, लिपोलिसिस को 0.5 μM CL-316,243 (CL) के साथ उत्तेजित किया गया था, या नियंत्रण कुओं को वाहन (V) के साथ इलाज किया गया था। 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे के बाद एकत्र किए गए नमूनों से गणना की गई लिपोलिटिक दर (ए) एफएफए और (बी) ग्लिसरॉल के लिए प्लॉट की जाती है। (सी) प्रत्येक कुएं में एफएफए: ग्लिसरॉल उत्पादन का मोलर अनुपात। ±(ए) और (बी) में सांख्यिकीय विश्लेषण होल्म-सिदक पोस्ट-हॉक विश्लेषण के साथ दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, α = 0.05। सीएल का प्रभाव सभी नमूनों में महत्वपूर्ण था। सीएल उपचारित नमूनों के भीतर, एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन की दर 10 मिलीग्राम बनाम 5 मिलीग्राम नमूनों को छोड़कर, सभी जोड़ी-वार तुलनाओं में काफी भिन्न थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एफएफए प्रतिधारण का नकारात्मक प्रभाव 25 मिलीग्राम ऊतक खंड में देखा जा सकता है, जो उत्तेजना पर एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन दोनों की कम दर प्रदर्शित करता है (चित्रा 3 बी, सी)। यह प्रतिक्रिया अवरोध तब भी स्पष्ट होता है जब मीडिया की एफएफए बाध्यकारी क्षमता बहुत कम होती है (यानी, मीडिया में पर्याप्त बीएसए नहीं है)। जब मीडिया में बीएसए 0.5% तक कम हो गया था, तो एफएफए रिलीज चार गुना से अधिक कम हो गई थी, और ग्लिसरॉल रिलीज लगभग दो गुना कम हो गई थी (चित्रा 4 ए, बी)। एक आसान नियम के रूप में, मीडिया में एफएफए के माइक्रोमोलर स्तर को मीडिया में बीएसए के प्रतिशत तक नहीं पहुंचना चाहिए (यानी, एफएफए का स्तर 5% बीएसए मीडिया में 5 एमएम एफएफए से नीचे और 0.5% बीएसए मीडिया में 0.5 एमएम से नीचे रहना चाहिए [इस स्तर पर एफएफए: बीएसए का 20: 3 मोलर अनुपात है)। बीएसए मीडिया की तैयारी की अधिकतम बीएसए बफरिंग क्षमता का परीक्षण करने के लिए, 24 घंटे उत्तेजित नमूने से मीडिया एकत्र करें, और एफएफए की एकाग्रता को मापें (एकाग्रता अधिक होगी, इसलिए कम नमूना मात्रा या नमूना कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है)। 24 घंटे की उत्तेजना के बाद 5% बीएसए मीडिया में एफएफए संचय लगभग 5 एमएम था, जबकि 0.5% बीएसए मीडिया की एफएफए सामग्री केवल 0.6 एमएम थी (चित्रा 4 सी)। एकत्रित मीडिया में एफएफए एकाग्रता को देखते हुए, यह देखा जा सकता है कि 0.5% बीएसए मीडिया एफएफए बाध्यकारी क्षमता अत्यधिक बोझ है (चित्रा 4 डी)। जबकि 5% बीएसए मीडिया में एफएफए का स्तर बहुत अधिक है, वे मीडिया की बफरिंग क्षमता से अधिक नहीं हैं (चित्रा 4 डी)। आदर्श रूप से, मीडिया में एफएफए एकाग्रता 3: 1 एफएफए: बीएसए मोलर अनुपात (यानी, 5% [0.75 एमएम] बीएसए में 2.3 एमएम एफएफए) से नीचे रहनी चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: अपर्याप्त बीएसए स्तर के परिणामस्वरूप स्पष्ट लिपोलिटिक दर कम हो जाती है। एक उच्च वसा वाले आहार से गोनाडल सफेद वसा ऊतक को महिला C57Bl / 6J माउस खिलाया गया और ~ 5 मिलीग्राम टुकड़ों में काटा गया। प्रत्येक कुएं में कुल 20-30 मिलीग्राम वसा ऊतक रखा गया था। समय = 0 घंटे पर, लिपोलिसिस को 0.5 μM CL-316,243 (CL) के साथ उत्तेजित किया गया था, या नियंत्रण कुओं को 5% बीएसए मीडिया या केवल 0.5% बीएसए वाले मीडिया में वाहन (V) के साथ इलाज किया गया था। 4 घंटे के बाद एकत्र किए गए नमूनों से गणना की गई लिपोलिटिक दर (ए) एफएफए और (बी) ग्लिसरॉल के लिए प्लॉट की जाती है। सीएल का प्रभाव सभी नमूनों में महत्वपूर्ण था। सीएल-उपचारित नमूनों के भीतर, एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन दोनों की दरें 5% और 0.5% बीएसए मीडिया स्थितियों के बीच काफी भिन्न थीं। (ग) 24 घंटे के बाद उत्तेजित कुओं से मीडिया में एफएफए का स्तर (घ) 4 घंटे पर एकत्र किए गए नमूनों में एफएफए का स्तर (ई) डीएमईएम में 5% बीएसए की विभिन्न तैयारी के साथ और बिना एफएफए मानक वक्र। ऑप्टिकल घनत्व की गणना (रीडिंग बी: ए 550 - ए 660) - (रीडिंग ए: ए550 - ए660) के रूप में की जाती है। (एफ) बीएसए के साथ और बिना ग्लिसरॉल मानक वक्र। ऑप्टिकल घनत्व 540 एनएम (ए540) पर अवशोषक है। 5.6 mM पर OD मान रैखिक नहीं थे और इस प्रकार मानक वक्र में शामिल नहीं थे। (जी) परख मीडिया में विभिन्न प्रकार के बीएसए का उपयोग करके महिला गोनाडल वसा ऊतक से एफएफए रिलीज की दर। ±(ए) और (बी) में सांख्यिकीय विश्लेषण होल्म-सिदक पोस्ट हॉक विश्लेषण, * पी वैल्यू < 0.05 के साथ दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह बताना महत्वपूर्ण है कि बीएसए की कुछ तैयारियों में एफएफए शामिल हैं। बीएसए के प्रत्येक लॉट का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि एफएफए सामग्री नगण्य है (ध्यान दें कि कुछ बीएसए तैयारी एफएफए मुक्त के रूप में विपणन की जाती है)। जबकि विशेष रूप से एफएफए-मुक्त के रूप में विपणन नहीं किया गया है, यहां उपयोग किए जाने वाले बीएसए में पता लगाने योग्य एफएफए नहीं है। हमने एफएफए-मुक्त बीएसए (इक्विटेक बायो इंक, बीएएच 66), यहां प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले बीएसए (सिग्मा, ए 9 418), और एक क्रूड (कम महंगा) अंश वी बीएसए (सिग्मा, 810531) वाले परख मीडिया का परीक्षण किया। एफएफए-मुक्त बीएसए और ए 9418 बीएसए दोनों ने किसी भी पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन नहीं किया या मानक वक्र ढलान या अवरोध को नहीं बदला; मानक वक्र सुपरइम्पोजेबल थे (चित्रा 4 ई)। ग्लिसरॉल मानक वक्र पर बीएसए डीएमईएम का कोई प्रभाव नहीं देखा गया (चित्रा 4 एफ)। दूसरी ओर, अंश वी बीएसए ने एफएफए परख में एक पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन किया, जो 0.3 एमएम (चित्रा 4 ई) की एफएफए एकाग्रता के बराबर था। इस पृष्ठभूमि ने मानक वक्र को ऊपर स्थानांतरित कर दिया, लेकिन ढलान को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया, यह दर्शाता है कि पृष्ठभूमि घटाव पर्याप्त है। हमने इन तीन अलग-अलग प्रकार के बीएसए का उपयोग करके एक उत्तेजित लिपोलिसिस प्रयोग भी किया, और पाया कि पृष्ठभूमि घटाव के बाद, लिपोलिसिस की गणना दर बीएसए योगों (चित्रा 4 एफ) के बीच भिन्न नहीं थी। हालांकि, यह अक्सर मामला नहीं होता है, खासकर कम शुद्ध बीएसए तैयारी के साथ जिसमें आसानी से इंसुलिन या अन्य घटक हो सकते हैं जो लिपोलिसिस की दर को प्रभावित करते हैं। बीएसए के प्रत्येक लॉट का परीक्षण और सत्यापन किया जाना चाहिए, और लगातार उपयोग किया जाना चाहिए (यानी, बीएसए के विभिन्न लॉट के साथ परख किए गए नमूने तुलनीय नहीं हैं)। बीएसए के प्रत्येक लॉट को मान्य करते समय बीएसए और डीएमईएम के अतिरिक्त एक पूर्ण मानक वक्र किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसमें ऐसा कुछ भी नहीं है जो वर्णमिति परख में एंजाइमों के साथ हस्तक्षेप करता है।

सीरियल नमूने लेना और ताजा मीडिया के साथ वॉल्यूम को बदलना पूरे प्रयोग के दौरान मीडिया में एफएफए लोड को कम करने में मदद करता है। हमने 4 महीने के लिए उच्च वसा वाले आहार खिलाए गए मादा माउस से गोनाडल वसा ऊतक में लिपोलिटिक दरों को मापा। इस प्रयोग में, 5-8 मिलीग्राम ऊतक खंड (25-30 मिलीग्राम का कुल वजन) को 5% बीएसए मीडिया के 200 μL में इनक्यूबेट किया गया था, और 100 μL एकत्र किए गए थे और 1 घंटे, 2 घंटे, 3 घंटे और 4 घंटे में प्रतिस्थापित किए गए थे। 3 घंटे पर, मीडिया में एफएफए का स्तर 2.3 एमएम (चित्रा 5 ए) के खतरे के क्षेत्र तक पहुंच गया था। लिपोलिसिस के प्रतिक्रिया निषेध को 4 घंटे (चित्रा 5 ए, बी) पर मीडिया एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर में वृद्धि की कमी से सुझाया गया था। प्रत्येक समय बिंदु पर जारी एफएफए और ग्लिसरॉल के μmol की गणना करने और एक रैखिक वक्र फिट करने के बाद, यह स्पष्ट है कि उत्तेजित नमूनों में 4 घंटे पर लिपोलिटिक दर में गिरावट शुरू हो जाती है, जिसमें आर2 मान एफएफए के लिए 0.976 और ग्लिसरॉल के लिए 0.983 (चित्रा 5 सी, डी) के रूप में कम है। अवशिष्ट भूखंड को देखते हुए, यह स्पष्ट है कि 4 एच मान रैखिक प्रवृत्ति से नीचे हैं (यानी, अवशिष्ट नकारात्मक हैं) (चित्रा 5 ई, एफ)। 4 घंटे के समय बिंदु के बहिष्करण ने एफएफए और ग्लिसरॉल के लिए आर2 मूल्यों को क्रमशः 0.997 और 0.998 और उससे अधिक तक बढ़ा दिया। 4 घंटे के समय बिंदु को शामिल करने से गणना की गई एफएफए और ग्लिसरॉल रिलीज दरों (चित्रा 5 जी, एच) में एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण कमी आती है।

Figure 5
चित्रा 5: एक्स विवो वसा ऊतक में रैखिक लिपोलिटिक दर की गणना। एक उच्च वसा वाले आहार से गोनाडल सफेद वसा ऊतक को महिला C57Bl / 6J माउस खिलाया गया और ~ 5 मिलीग्राम टुकड़ों में काटा गया। प्रत्येक कुएं में कुल 20-30 मिलीग्राम वसा ऊतक रखा गया था। समय = 0 घंटे पर, लिपोलिसिस को 0.5 μM CL-316,243 (CL) के साथ उत्तेजित किया गया था, या नियंत्रण कुओं को वाहन (V) के साथ इलाज किया गया था। मीडिया संग्रह 1 घंटे, 2 घंटे, 3 घंटे और 4 घंटे पर किए गए थे। (सी) एफएफए और (डी) ग्लिसरॉल उत्पादन समय के साथ प्लॉट किया गया। समय के साथ (ई) एफएफए और (एफ) ग्लिसरॉल उत्पादन के लिए अवशिष्ट प्लेटें। (जी) एफएफए और (एच) ग्लिसरॉल की रिहाई की दर, 4 घंटे के समय बिंदु के साथ और बिना गणना की जाती है। (i) महिला गोनाडल वसा ऊतक में एफएफए रिलीज। लगभग 50% मीडिया 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे में बदल गया। घंटों के बीच, 15 मिनट के समय बिंदुओं ने प्रतिस्थापन के बिना 2.75% मीडिया एकत्र किया। (G) और (H) में सांख्यिकीय विश्लेषण होल्म-सिडक पोस्ट-हॉक विश्लेषण, * p मान ±< 0.05 के साथ दो-तरफा ANOVA का उपयोग करके किया गया था। सीएल का प्रभाव सभी नमूनों में महत्वपूर्ण था (पी मान < 0.05)। सीएल उपचारित नमूनों के भीतर, एफएफए और ग्लिसरॉल उत्पादन दोनों की दरें 4 घंटे के समय बिंदु के साथ और बिना गणना के बीच काफी भिन्न थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत, यह प्रोटोकॉल लिपोलिटिक दर निर्धारित करने के लिए कई समय बिंदुओं का उपयोग करता है, जिससे माप त्रुटि कम हो जाती है और आंतरिक सत्यापन प्रदान करता है कि लिपोलिसिस की रैखिक दर को मापा जा रहा है। प्रत्येक संग्रह बिंदु पर रैखिक चरण में लिपोलिसिस को बनाए रखने के लिए, मीडिया का 50% एकत्र और प्रतिस्थापित किया जाता है। चूंकि रैखिकता महत्वपूर्ण है, इसलिए हम यह सुनिश्चित करना चाहते थे कि ताजा मीडिया के अतिरिक्त प्रत्येक जोड़ में लिपोलिसिस का विस्फोट नहीं हो रहा था। समय बिंदुओं के बीच रैखिकता को मान्य करने के लिए, हमने प्रतिस्थापन के बिना 1 घंटे से 3 घंटे तक प्रति घंटा समय बिंदुओं के बीच हर 15 मिनट में एक बहुत छोटा नमूना (2.75%) लिया। 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे में, सामान्य 50% नमूना संग्रह बनाया गया और प्रतिस्थापित किया गया। एफएफए रिलीज की दर सामान्य समय बिंदुओं के बीच रैखिक थी, यह दर्शाता है कि ताजा मीडिया (चित्रा 5 आई) के प्रत्येक जोड़ के साथ लिपोलिसिस का विस्फोट नहीं हुआ था।

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Discussion

यहां, हम एडिपोसाइट्स और एक्स विवो एडीपोज ऊतक में लिपोलिसिस की दर को मापने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। लिपोलिसिस की मात्रा निर्धारित करने के लिए, रैखिक चरण में लिपोलिटिक दर को मापना महत्वपूर्ण है। हम एक सीरियल सैंपलिंग तकनीक का उपयोग करते हैं, जहां मीडिया का एक बड़ा अंश एकत्र किया जाता है और नियमित अंतराल पर ताजा मीडिया के साथ बदल दिया जाता है। यह अर्धरूढ़िवादी विधि एफएफए बफरिंग क्षमता के साथ ताजा बीएसए को जोड़ने की अनुमति देती है और रैखिक लिपोलिसिस की अवधि का विस्तार करते हुए प्रतिक्रिया निषेध में देरी करती है। यह प्रयोगात्मक डिजाइन विवो में वसा ऊतक के वैस्कुलराइजेशन को पुन: उत्पन्न करने का प्रयास करता है, जो जारी एफएफए75 को बांधने के लिए ताजा एल्बुमिन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को म्यूरिन एक्स विवो व्हाइट एडीपोज ऊतक और इनगुइनल एडीपोज ऊतक प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स में लिपोलिसिस को मापने के लिए अनुकूलित किया गया था। प्रोटोकॉल को भूरे और बेज वसा डिपो में अच्छी तरह से काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही अन्य जीवों से वसा ऊतक और उच्च एडिपोजेनिक क्षमता के साथ अमर सेल लाइनें। प्रोटोकॉल पूर्व विवो परख के लिए वसा ऊतक के संग्रह से पहले चूहों की उम्र, लिंग और आहार में लचीलेपन की अनुमति देता है। कुछ जोड़तोड़, जैसे कि उपवास, बेसल लिपोलिटिक दर को प्रभावित कर सकते हैं, जबकि आहार-प्रेरित मोटापे जैसे अन्य हस्तक्षेप भी उत्तेजित लिपोलिसिस की दर को प्रभावित करते हैं।

प्रोटोकॉल को प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, यह इस बात पर निर्भर करता है कि लिपोलिटिक दर अधिक या कम है या नहीं। रैखिकता को मान्य करने के लिए, हम आर2 मानों की गणना करने और अवशिष्ट भूखंड को देखने की सलाह देते हैं। R2 मान 1 के बहुत करीब होना चाहिए। अवशिष्ट प्लॉट का मूल्यांकन करते समय, किसी को बाद के समय बिंदुओं पर नकारात्मक अवशिष्ट मूल्यों की तलाश में रहना चाहिए, क्योंकि ये इंगित करते हैं कि लिपोलिटिक दरों में गिरावट आ रही है, और रैखिकता खो रही है। ऐसे अवशिष्ट भूखंडों के उदाहरण चित्र 5E, F में दिखाए गए हैं। इस मामले में 4 घंटे के समय बिंदुओं को समाप्त करना रैखिक लिपोलिटिक दर की अधिक सटीक गणना प्रदान करता है और आर2 मूल्यों में सुधार करता है। हालांकि, चूंकि दर की गणना कई समय बिंदुओं से की जाती है, इसलिए यह अपेक्षाकृत मजबूत है, और इस तरह के समय बिंदु को शामिल करने से आर2 मूल्यों और लिपोलिसिस की गणना दर पर केवल एक छोटा सा प्रभाव पड़ता है। यदि लिपोलिटिक दर की गणना करने के लिए एक एकल समय बिंदु का उपयोग किया जाता है, तो डेटा अधिक आसानी से तिरछा हो सकता है।

जिस तरह से डेटा सामान्यीकृत किया जाता है, वह नमूनों के बीच सापेक्ष परिणामों को भी प्रभावित कर सकता है। यहां, हम पूर्व विवो ऊतक को ऊतक के वजन और प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स को विट्रो में अच्छी तरह से विभेदित करने की सलाह देते हैं। हालांकि, ये सामान्यीकरण तकनीक सभी प्रयोगात्मक प्रणालियों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, यदि प्रसार दर या भेदभाव दक्षता समूहों के बीच भिन्न होती है, तो प्रति कुएं सामान्यीकरण उचित नहीं है। वैकल्पिक सामान्यीकरण तकनीकों में प्रोटीन, लिपिड और डीएनए शामिल हैं। सामान्यीकरण की प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान हैं। ऊतक वजन और अच्छी तरह से सामान्यीकरण सरल और सीधा है। एडिपोसाइट्स आकार में अंतर का मतलब यह हो सकता है कि दुबला वसा ऊतक में मोटे वसा ऊतक की तुलना में प्रति ग्राम कई अधिक एडिपोसाइट्स होते हैं, जबकि भेदभाव दक्षता में अंतर के परिणामस्वरूप प्रति एडिपोसाइट्स की संख्या में अंतर हो सकता है। लिपिड को कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, 2: 1 क्लोरोफॉर्म: मेथनॉल [वी / वी]) और ट्राइग्लिसराइड सामग्री के साथ निकाला जा सकता है जिसे एक रंगीन अभिकर्मक का उपयोग करके मापा जाता है। जबकि लिपिड सामग्री के लिए सामान्यीकरण एक पारंपरिक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि नहीं है, लिपिड बूंदें, आखिरकार, लिपोलिसिस से गुजरने वाले ऑर्गेनेल हैं, और यह सामान्यीकरण विधि एडिपोसाइट्स के लिए विशिष्ट है, जो कोशिकाओं के बीच भेदभाव दर भिन्न होने पर उपयोगी हो सकती है। लिपिड निष्कर्षण के बाद, 0.1-0.3 एन एनएओएच का उपयोग प्रोटीन निकालने के लिए किया जा सकता है, जिसे तब ब्रैडफोर्ड या बीसीए प्रोटीन परख68 द्वारा परख किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को लाइसिस बफर में समरूप किया जा सकता है, और लिपिड अंश को सेंट्रीफ्यूजेशन70 द्वारा हटा दिया जाता है। ध्यान दें कि लिपिड संदूषण प्रोटीन परख के साथ हस्तक्षेप करेगा। यदि सामान्यीकरण के लिए प्रोटीन का उपयोग किया जाना है, तो परख मीडिया से बीएसए को हटाने के लिए कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर (कम से कम तीन बार) धोया जाना चाहिए। कभी-कभी, विभेदित एडिपोसाइट्स प्लेट का अच्छी तरह से पालन नहीं करते हैं और अतिरिक्त बीएसए को हटाने के लिए आवश्यक तीन वॉश को सहन नहीं करते हैं। डीएनए का सामान्यीकरण सेल संख्या के सामान्यीकरण की अनुमति देता है, और इसे वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट के साथ किया जा सकता है, इसके बाद जीन कॉपी संख्या के अवशोषण या वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा कुल डीएनए का परिमाणीकरण किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, प्लेटेड कोशिकाओं में, इमेजिंग के बाद डीएपीआई धुंधला होने का उपयोग नाभिक की गणना करने और सेल संख्या को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है। सेल नंबर या प्रोटीन का उपयोग करके सामान्य करते समय, नमूने में गैर-एडिपोसाइट्स कोशिकाओं पर विचार करना महत्वपूर्ण है। वसा ऊतक में प्रतिरक्षा और एंडोथेलियल कोशिकाएं भी होती हैं; मोटापे से ग्रस्त वसा ऊतक में, सूजन और अतिवृद्धि के परिणामस्वरूप परिपक्व एडिपोसाइट्स से आने वाले 10 नाभिकों में से कम से कम 1 हो सकता है। हालांकि, एडिपोसाइट्स अभी भी ऊतक के द्रव्यमान और लिपिड सामग्री के बहुमत में योगदान करते हैं। इन विट्रो विभेदित प्रीडिपोसाइट्स के लिए, भेदभाव दक्षता परिपक्व एडिपोसाइट्स के सापेक्ष प्रतिशत को प्रभावित करती है; जब यह मामला है, तो सामान्यीकरण जटिल है। आदर्श रूप से, लिपोलिसिस परख के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले भेदभाव दक्षता को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि संभव नहीं है, तो लिपिड सामग्री के सामान्यीकरण की सिफारिश की जाती है यदि लिपिड बूंद की मात्रा विभेदित एडिपोसाइट्स के बीच समान है। असमान भेदभाव के साथ एडिपोसाइट्स संस्कृतियों में लिपोलिटिक दरों की तुलना लिपोलिसिस के बारे में गलत निष्कर्ष निकाल सकती है जब ड्राइविंग कारक वास्तव में एडिपोजेनेसिस होता है; यह प्रोटोकॉल की एक सीमा है।

लंबी श्रृंखला एफएफए प्रतिक्रिया-लिपोलिसिस 63,64,65,66,67 को रोकती है। एफएफए तब जमा होते हैं जब वे मीडिया में पर्याप्त रूप से अनुक्रमित नहीं होते हैं। लिपोलिसिस के माप को अनुकूलित करने से जुड़े अधिकांश समस्या निवारण एफएफए प्रतिधारण को कम करने से संबंधित हैं। मीडिया में एफएफए: ग्लिसरॉल रिलीज के दाढ़ अनुपात की गणना करने से एफएफए प्रतिधारण से संबंधित मुद्दों की पहचान करने में मदद मिलती है। यदि एफएफए: ग्लिसरॉल के लिए दाढ़ अनुपात 3: 1 है, तो लिपोलिसिस के सभी उत्पादों को मीडिया में जारी और कैप्चर किया जा रहा है, जबकि 2: 1 से नीचे का अनुपात चिंता का कारण है। पूर्व विवो परख के लिए एक महत्वपूर्ण विचार वसा ऊतक खंड का आकार है। ऊतक के बड़े हिस्सों में आयतन अनुपात के लिए कम सतह क्षेत्र होता है, और इस प्रकार एफएफए को बनाए रखने और परिणामस्वरूप कम लिपोलिटिक दरों का प्रदर्शन करने की अधिक संभावना होती है (चित्रा 4 ए, बी)। इसे ध्यान में रखते हुए, प्रत्येक नमूने के लिए वसा ऊतक को एक सुसंगत आकार और आकार के टुकड़ों में काटना महत्वपूर्ण है। मीडिया में एफएफए अनुक्रमण की सुविधा के लिए, यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि मीडिया में जारी एफएफए को बांधने के लिए पर्याप्त बीएसए हो। बीएसए की एकाग्रता बढ़ाकर या मीडिया की मात्रा बढ़ाकर मीडिया की एफएफए बफरिंग क्षमता को बढ़ाया जा सकता है। यह संग्रह मात्रा या आवृत्ति बढ़ाने के लिए समान रूप से प्रभावी है। यदि कोई उच्च लिपोलिटिक दरों को देखता है, लेकिन एफएफए: ग्लिसरॉल अनुपात 2: 1 से नीचे है, तो हम हर 30 मिनट में संग्रह आवृत्ति बढ़ाने और 2.5 घंटे पर परख को रोकने की सलाह देते हैं।

यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल को माउस एक्स विवो व्हाइट एडीपोज ऊतक और प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स के लिए विट्रो में विभेदित किया गया है, जिनमें से दोनों अत्यधिक लिपोलिटिक हैं। परख को अन्य प्रणालियों में लिपोलिसिस को मापने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है, या यदि लिपोलिसिस की अपेक्षाकृत कम बेसल दर में अंतर विशेष रुचि रखते हैं। उदाहरण के लिए, 3T3-L1 एडिपोसाइट्स में लिपोलिटिक गतिविधि32 कम होती है। जब लिपोलिटिक दर कम होती है, तो इनक्यूबेशन की मात्रा कम हो जानी चाहिए (यानी, 24-वेल प्लेट में 400 μL प्रति कुएं के बजाय, 24-वेल प्लेट में 200 μL का उपयोग किया जाना चाहिए, या 12-वेल प्लेट में 300 μL, और प्रति समय बिंदु पर 100-150 μL एकत्र किया जाना चाहिए)। संग्रह की मात्रा 100 μL से नीचे नहीं गिरनी चाहिए, क्योंकि कम एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर को सटीक रूप से मापने के लिए बड़े नमूना वॉल्यूम की आवश्यकता होती है। प्रति नमूना 50 μL मीडिया का उपयोग करके ग्लिसरॉल की परख करने के लिए, मुक्त ग्लिसरॉल अभिकर्मक को 31 मिलीलीटर पानी में भंग किया जाना चाहिए, और प्रत्येक कुएं में 50 μL नमूने के साथ 150 μL अभिकर्मक का उपयोग किया जाना चाहिए। एफएफए के स्तर को प्रति कुएं 25 μL नमूने के साथ मापा जा सकता है, शायद अधिक, जब तक रैखिकता बनाए रखी जाती है। सिग्नल बढ़ाने के लिए टाइम पॉइंट्स को बढ़ाया भी जा सकता है। सफेद एडिपोसाइट्स के अलावा अन्य कोशिकाओं से लिपोलिटिक दरों की जांच करते समय, सेलुलर चयापचय में अंतर पर विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, भूरे और बेज एडिपोसाइट्स ग्लिसरॉल काइनेज के बहुत अधिक स्तर को व्यक्त करते हैं, और इस प्रकार लिपोलिसिस76,77 द्वारा ग्लिसरॉल रिलीज को बनाए रखने में सक्षम होते हैं। ये चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाएं मीडिया में रिलीज के बिना जारी फैटी एसिड को कैटाबोलिक या सिंथेटिक मार्गों में चैनल करने में सक्षम हो सकती हैं। विशिष्ट सेल प्रकार में एफएफए और ग्लिसरॉल के चयापचय भाग्य पर विचार किया जाना चाहिए जब लिपोलिसिस परख के परिणामों की व्याख्या की जानी चाहिए, खासकर सफेद एडिपोसाइट्स के अलावा अन्य सेल प्रकार में। अन्य सेल प्रकारों में लिपोलिसिस परख को अनुकूलित और मान्य करने की आवश्यकता है।

यह प्रोटोकॉल माउस मॉडल में लिपोलिटिक दर में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। विट्रो में विभेदित प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स एडिपोसाइट्स में आनुवंशिक जोड़तोड़ या औषधीय उपचार के सेल स्वायत्त प्रभावों की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। दूसरी ओर, वसा ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित अन्य सेल प्रकार होते हैं। पूरे ऊतक लिपोलिसिस का आकलन करते समय लिपोलिसिस को विनियमित करने में वसा ऊतक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रभाव पर विचार करना महत्वपूर्ण है। सुसंस्कृत एडिपोसाइट लिपोलिसिस मॉडल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संभावित जटिल प्रभाव को दरकिनार कर सकते हैं और विशिष्ट सेल प्रकारों की पूरी तरह से जांच को सक्षम कर सकते हैं, जबकि वसा ऊतक खोज विवो वातावरण में अधिक मजबूत तुलना को सक्षम करते हैं। इसके अतिरिक्त, एक्स विवो परख का उपयोग विभिन्न वसा डिपो में लिपोलिटिक दरों की जांच के लिए किया जा सकता है। इन प्रणालियों में, लिपोलिसिस को β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट जैसे यौगिकों द्वारा उत्तेजित किया जाता है, इस प्रकार, सहानुभूति टोन में कोई भी परिवर्तन जो विवो माउस मॉडल को प्रभावित कर सकता है, नहीं देखा जाएगा। लिपोलिसिस के विवो माप में एफएफए और ग्लिसरॉल रिलीज की गतिशीलता और पूरे शरीर में विभिन्न ऊतकों में तेज होना जटिल है। किसी भी समय सीरम एफएफए और ग्लिसरॉल का स्तर स्राव और उत्थान का संतुलन है, और यह नहीं माना जाना चाहिए कि सीरम एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर में परिवर्तन केवल वसा ऊतक लिपोलिसिस के कारण होते हैं। उपवास-प्रेरित लिपोलिसिस सहानुभूति टोन से प्रभावित होता है, लेकिन सीरम एफएफए या ग्लिसरॉल के स्तर में तेजी से और मजबूत परिवर्तन नहीं करता है, जिससे एफएफए और ग्लिसरॉल के उपवास सीरम स्तर में परिवर्तन की व्याख्या करना मुश्किल हो जाता है। विवो लिपोलिसिस में β -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट, जैसे सीएल -316,243 का उपयोग करके उत्तेजित किया जा सकता है, और उत्तेजना के 20 मिनट के भीतर सीरम एफएफए और ग्लिसरॉल में वृद्धि का पता लगाया जा सकता है। विवो लिपोलिटिक परख में सीरम एफएफए और ग्लिसरॉल के बेसलाइन माप के साथ-साथ वाहन नियंत्रण दोनों शामिल होना चाहिए; इस तरह, सीरम एफएफए और ग्लिसरॉल के स्तर में उत्तेजना-विशिष्ट परिवर्तन निर्धारित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट आर01डीके126944 द्वारा एसएमआर को समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

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References

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<em>पूर्व विवो</em> मुराइन वसा ऊतक और प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स में लिपोलिसिस की दर को मापना विट्रो <em>में</em> विभेदित
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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

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