Måling av graden av lipolyse i ex vivo murint fettvev og primære preadipocytter differensiert in vitro

Summary

Triglyseridlipolyse i adipocytter er en viktig metabolsk prosess som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer og glyserol. Her gir vi en detaljert protokoll for å måle basal og stimulert lipolyse i adipocytter og ex vivo fettvev fra mus.

Abstract

Adipocytter lagrer energi i form av triglyserider i lipiddråper. Denne energien kan mobiliseres via lipolyse, hvor fettsyresidekjedene spaltes sekvensielt fra glyserolryggraden, noe som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer og glyserol. På grunn av det lave uttrykket av glyserolkinase i hvite adipocytter er glyserolopptakshastigheten ubetydelig, mens fettsyreopptak dikteres av fettsyrebindingskapasiteten til mediekomponenter som albumin. Både glyserol- og fettsyrefrigjøring i media kan kvantifiseres ved kolorimetriske analyser for å bestemme lipolytisk hastighet. Ved å måle disse faktorene på flere tidspunkter, kan man bestemme den lineære hastigheten av lipolyse med høy tillit. Her gir vi en detaljert protokoll for måling av lipolyse i in vitro differensierte adipocytter og ex vivo fettvev fra mus. Denne protokollen kan også optimaliseres for andre preadipocyttcellelinjer eller fettvev fra andre organismer; Viktige faktorer og optimaliseringsparametere diskuteres. Denne protokollen er designet for å være nyttig for å bestemme og sammenligne graden av adipocytlipolyse mellom musemodeller og behandlinger.

Introduction

Overflødig næringsstoffer lagres i hvitt fettvev i form av triglyserider i den nøytrale lipidkjernen av lipiddråper. Triglyseridbutikker mobiliseres via lipolyse, en prosess der fettsyresidekjedene spaltes sekvensielt av fettvevstriglyseridlipase (ATGL), hormonsensitiv lipase (HSL) og monoglyseridlipase (MGL), noe som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer (FFA) og glyserolryggraden ^1,2. Lipolyse aktiveres ved katekolaminsignalering i fettvevet. Sympatiske nerveterminaler frigjør lokalt katekolaminer, som binder seg til β-adrenerge reseptorer på adipocyttplasmamembranen. Ved ligandbinding aktiverer disse G-proteinkoblede reseptorene (GPCR) adenylylsyklase via G_αs. Påfølgende aktivering av proteinkinase A (PKA) ved cAMP resulterer i oppregulering av både ATGL og HSL. Fosforyleringen av perilipin-1 av PKA forårsaker dissosiasjon av ABHD5 (også kjent som CGI-58), som binder og koaktiverer ATGL³. PKA fosforylerer HSL direkte, fremmer translokasjonen fra cytosol til lipiddråpen, hvor interaksjon med fosforylert perilipin-1 ytterligere fremmer lipaseaktiviteten 4,5,6,7. Den tredje lipasen involvert i lipolyse, MGL, ser ikke ut til å være regulert av katekolaminsignalering⁸. Det er viktig at triglyseridsyntese i adipocytter medieres av glyserollipidsynteseveien, som ikke involverer dannelsen av monoglyserider som et mellomprodukt; I stedet katalyserer glyserol-3-fosfatacyltransferaser dannelsen av lysofosfatidsyre, som kombineres med en annen fettacyl-CoA for å danne fosfatidsyre, og deretter isomeriseres til diglyserider før den endelige syntesen av triglyserider (figur 1) 9,10,11.

Figur 1: Lipolyse og glyserollipidsynteseveier. Øverst: Lipolytisk vei; enzymer vist i rødt: fettvevstriglyseridlipase (ATGL), hormonsensitiv lipase (HSL) og monoglyseridlipase (MGL). Bunn: glyserollipidsyntesevei; enzymer vist i grønt: diglyseridacyltransferase (DGAT), fosfatidsyrefosfatase (PAP), lysofosfatidsyreacyltransferase (LPAT, også kjent som LPAATs) og glyserol-3-fosfatacyltransferase (GPAT). Lipider: triglyserid (TG), diglyserid (DG), monoglyserid (MG), fri fettsyre (FFA), fettacyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidsyre (LPA) og fosfatidsyre (PA). Andre metabolitter: uorganisk fosfat (Pi) og glyserol 3-fosfat (G3P). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ekstracellulær adenosin er en annen viktig regulator av lipolyse, som arbeider gjennom G_s– og G i-koblede GPCRs for å påvirke adenylsyklaseaktivitet. Den dominerende adenosinreseptoren i adipocytter, ADORA1, hemmer adenylylsyklase, og dermed lipolyse gjennom aktivering av G_i¹². Uttrykt i lavere nivåer, og primært i brune adipocytter, aktiverer ADORA2A lipolyse via G_s signalering¹³. ADORA1 påvirker både basal lipolyse og responsen på adrenerge agonister. Effekten av adenosin på lipolyse kan kontrolleres ved å tilsette adenosindeaminase for å nøytralisere adenosin, samt ADORA1-spesifikk agonist fenylisopropyladenosin^14,15. Hormonell aktivering av G q-koblede GPCR kan også påvirke lipolyse via aktivering av fosfolipase C og proteinkinase C^16,17,18,19. Inflammatoriske signaler påvirker også lipolytiske hastigheter. TLR4-aktivering av LPS (og andre endotoksiner) øker lipolytisk hastighet ved å aktivere ERK, som fosforylerer perilipin-1 og HSL²⁰. TNF-α aktiverer også lipolyse via ERK- og NF-κB-aktivering, samt transkripsjonell nedregulering av fosfodiesterase PDE-3B og CIDEC^21,22,23. IL-6 har også vært assosiert med økt adipocytlipolyse, spesielt i mesenterisk fettvev, hvis FFA-frigjøring påvirker leverstatose og glukoneogenese^24,25,26.

Lipolyse undertrykkes i matet tilstand av insulin. AKT fosforylerer og aktiverer PDE-3B for å undertrykke cAMP-signalering og forhindre PKA-aktivering²⁷. Insulin nedregulerer også ATGL²⁸ transkripsjonelt. Fedme fremmer katekolaminresistens gjennom en rekke mekanismer, inkludert nedregulering av β-adrenerge reseptorer i adipocytter 29,30,31,32,33. Adipocytter uttrykker alle tre β-adrenerge reseptorer (β-1, β-2 og β-3). Mens β-1 og β-2 adrenerge reseptorer er allestedsnærværende uttrykt, er β-3 adrenerg reseptor hovedsakelig uttrykt i adipocytter hos mus^34,35. Adrb3-ekspresjon induseres av C/EBPα under adipogenese³⁶. Den β-3 adrenerge reseptoren uttrykkes sterkt i modne adipocytter. Aktiveringen av β-1 og β-2 adrenerge reseptorer er selvbegrensende på grunn av tilbakemeldingshemming ved β-arrestin³⁷. Tilbakemeldingshemming av β-3 adrenerg reseptor medieres av andre signalveier, noe som reduserer Adrb3-ekspresjon^33,38,39.

Tallrike forbindelser kan brukes til å aktivere adipocytlipolyse. Katekolaminer er store fysiologiske aktivatorer av lipolyse. Noradrenalin (eller noradrenalin) og adrenalin (eller adrenalin) aktiverer alle tre β-adrenerge reseptorer⁴⁰. Noradrenalin og adrenalin påvirker også lipolyse via aktivering av α-adrenerg reseptorsignalering⁴¹. Vanlige β-adrenerge reseptoragonister inkluderer isoproterenol, som er en ikke-selektiv β-adrenerg reseptoragonist, og β-3-adrenerge reseptoragonister CL-316,243 og mirabegron⁴². Gitt at adipocytter hovedsakelig uttrykker β-3 adrenerg reseptor, bruker vi CL-316,243 som et eksempel her. Dens spesifisitet for β-3 adrenerg reseptor gjør den også til en relativt spesifikk aktivator av adipocytkatekolaminsignalering, som også trygt kan brukes in vivo. Merk at den vanlige konsentrasjonen på 10 μM CL-316,243 i cellekultur er størrelsesordener høyere enn ~0,1 μM-dosen som kreves for å oppnå maksimal respons³³. Forskolin omgår adrenerge reseptoren, direkte aktivere adenylylsyklase og nedstrøms lipolytisk signalering. Det er mange flere aktivatorer, så vel som undertrykkere av lipolyse. Ved valg av en forbindelse for å stimulere lipolyse, bør reseptorspesifisiteten og nedstrøms signalveier vurderes nøye innenfor eksperimentell design.

Graden av lipolyse i hvitt fettvev er en viktig metabolsk faktor som påvirker kuldetoleranse og næringstilgjengelighet under faste eller trening^43,44,45,46. Formålet med denne protokollen er å måle graden av lipolyse i adipocytter og fettvev, noe som vil lette forståelsen av adipocyttmetabolisme og hvordan det kan påvirke den metabolske fenotypen til forskjellige murinmodeller. For å kvantifisere lipolytisk hastighet måler vi utseendet til lipolytiske produkter i media (dvs. FFA og glyserol). Metoden er avhengig av frigjøring av lipolytiske produkter fra adipocytter inn i mediet. Siden hvite adipocytter uttrykker lave nivåer av glyserolkinase, er glyserolopptakshastighetene lave⁴⁷. Omvendt bør produksjon av FFA og glyserol ved andre metabolske veier enn lipolyse også vurderes. Adipocytter ser ut til å uttrykke en fosfatase med aktivitet mot glyserol-3-fosfat, noe som muliggjør produksjon av glyserol fra glyserol-3-fosfat avledet fra glukose^48,49,50. Glykolyse er en kilde til glyserol-3-fosfat som brukes til FFA-reesterifisering i hvite adipocytter. Når glukosenivået er begrenset, krever glyseronogenese andre 3-karbonkilder, som laktat og pyruvat⁵¹. Kanaliseringen av FFAer frigjort av lipolyse i cellen og deres metabolske skjebne er dårlig forstått; FFA frigjort av lipolyse må omdannes til fettacyl-CoA, før de blir re-esterified eller gjennomgår β-oksidasjon. Det ser ut til at FFAer utgitt av lipolyse sannsynligvis forlater cellen før de tas opp igjen og omdannes til fettacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA kan sekvestreres utenfor cellen av albumin. Det er viktig at langkjedede FFAer er kjent for å feedback-hemme lipolyse hvis de ikke er sekvestrert av albumin 63,64,65,66,67. Dermed er optimalisering av FFA-bufferkapasiteten til media under lipolyseanalysen kritisk. Prosedyren beskrevet her ligner tidligere publiserte metoder for å måle lipolytisk hastighet i adipocytter og ex vivo fettvev fra mus og mennesker 15,68,69,70,71. Denne protokollen skiller seg ut ved bruk av seriell prøvetaking; Ved å utføre seriell prøvetaking kan vi internt validere at lipolyse måles i den lineære fasen og bruke flere målinger for å beregne lipolysehastigheten, og dermed redusere målefeil for å øke tilliten til den endelige beregnede verdien. Ulempen med seriell prøvetaking er at analysen krever mer tid og reagenser; Den lengre tidsrammen reduserer imidlertid virkningen av målefeil på standardfeilen i estimatene for satsen. I tillegg måler denne protokollen både FFA- og glyserolfrigivelse, og vurderer forholdet mellom FFA: glyserolfrigivelse med målet om å oppnå et 3: 1-forhold, som forventes fra fullstendig lipolyse og frigjøring av lipolytiske produkter i media⁷².

Protocol

Bruken av alle dyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medical College of Cornell University. 1. Klargjøring av buffere og oppsamlingsplater Lag 5% bovint serumalbumin (BSA) ved å oppløse 5 g BSA i 100 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle’s medium (DMEM) uten fenolrødt. Rør BSA forsiktig for å løse opp (risting virker mot sin hensikt). Når BSA er fullstendig oppløst, filtrersteriliser mediet med et 0,2 μm fi…

Representative Results

Vi målte den basale og stimulerte lipolytiske hastigheten av in vitro differensierte adipocytter. Primære preadipocytter fra inguinalt hvitt fettvev ble differensiert til adipocytter ved behandling av konfluente celler med 5 μM deksametason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin og 1 μM troglitason i 4 dager, etterfulgt av ytterligere 3 dagers behandling med 1 μg/ml insulin. Cellene ble inkubert i medier uten insulin i 24 timer før lipolyseanalysen. På tid = 0h ble cellene vasket en gang med PBS, deretter ble fen…

Discussion

Her gir vi en grunnleggende protokoll for måling av graden av lipolyse i adipocytter og ex vivo fettvev. For å kvantifisere lipolyse er det viktig å måle lipolytisk hastighet i den lineære fasen. Vi bruker en seriell prøvetakingsteknikk, der en stor del av mediene samles inn og erstattes med ferske medier med jevne mellomrom. Denne semikonservative metoden tillater tillegg av fersk BSA med FFA-bufferkapasitet og forsinker tilbakemeldingshemming, noe som forlenger varigheten av lineær lipolyse. Denne ekspe…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work