Mätning av lipolyshastigheten i ex vivo murin fettvävnad och primära preadipocyter differentierade in vitro

Summary

Triglyceridlipolys i adipocyter är en viktig metabolisk process som resulterar i frigörelse av fria fettsyror och glycerol. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att mäta basal och stimulerad lipolys i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss.

Abstract

Adipocyter lagrar energi i form av triglycerider i lipiddroppar. Denna energi kan mobiliseras via lipolys, där fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt från glycerolryggraden, vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror och glycerol. På grund av det låga uttrycket av glycerolkinas i vita adipocyter är glycerolåterupptagshastigheterna försumbara, medan återupptaget av fettsyror dikteras av fettsyrabindningskapaciteten hos mediekomponenter såsom albumin. Både glycerol och fettsyrafrisättning i media kan kvantifieras med kolorimetriska analyser för att bestämma lipolytisk hastighet. Genom att mäta dessa faktorer vid flera tidpunkter kan man bestämma den linjära lipolyshastigheten med hög säkerhet. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för mätning av lipolys i in vitro-differentierade adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss. Detta protokoll kan också optimeras för andra preadipocytcellinjer eller fettvävnad från andra organismer; Överväganden och optimeringsparametrar diskuteras. Detta protokoll är utformat för att vara användbart för att bestämma och jämföra graden av adipocytlipolys mellan musmodeller och behandlingar.

Introduction

Överskott av näringsämnen lagras i vit fettvävnad i form av triglycerider i den neutrala lipidkärnan i lipiddroppar. Triglyceridförråd mobiliseras via lipolys, en process genom vilken fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt av fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL), vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror (FFA) och glycerolryggraden ^1,2. Lipolys aktiveras genom katekolaminsignalering i fettvävnaden. Sympatiska nervterminaler frisätter lokalt katekolaminer, som binder till β-adrenerga receptorer på adipocytplasmamembranet. Vid ligandbindning aktiverar dessa G-proteinkopplade receptorer (GPCR) adenylylcyklas via G_αs. Efterföljande aktivering av proteinkinas A (PKA) av cAMP resulterar i uppreglering av både ATGL och HSL. Fosforyleringen av perilipin-1 av PKA orsakar dissociation av ABHD5 (även känd som CGI-58), som binder och samaktiverar ATGL³. PKA fosforylerar HSL direkt, vilket främjar dess translokation från cytosolen till lipiddroppen, där interaktion med fosforylerad perilipin-1 ytterligare främjar dess lipasaktivitet 4,5,6,7. Det tredje lipaset som är involverat i lipolys, MGL, verkar inte regleras av katekolaminsignalering⁸. Viktigt är att triglyceridsyntes i adipocyter medieras av glycerollipidsyntesvägen, som inte involverar bildandet av monoglycerider som mellanprodukt; istället katalyserar glycerol-3-fosfatacyltransferaser bildningen av lysofosfatidinsyra, som kombineras med en annan fettacyl-CoA för att bilda fosfatidinsyra och sedan isomeriseras till diglycerider före den slutliga syntesen av triglycerider (figur 1) 9,10,11.

Figur 1: Lipolys och glycerol lipidsyntesvägar. Överst: Lipolytisk väg; enzymer som visas i rött: fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL). Botten: glycerol lipid syntes väg; enzymer som visas i grönt: diglyceridacyltransferas (DGAT), fosfatidsyrafosfatas (PAP), lysofosfatidsyraacyltransferas (LPAT, även känt som LPAAT) och glycerol-3-fosfatacyltransferas (GPAT). Lipider: triglycerid (TG), diglycerid (DG), monoglycerid (MG), fri fettsyra (FFA), fettacyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinsyra (LPA) och fosfatidinsyra (PA). Andra metaboliter: oorganiskt fosfat (Pi) och glycerol-3-fosfat (G3P). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Extracellulär adenosin är en annan viktig regulator för lipolys, som arbetar genom G_s– och G_i-kopplade GPCR för att påverka adenylcyklasaktivitet. Den dominerande adenosinreceptorn i adipocyter, ADORA1, hämmar adenylylcyklas och därmed lipolys genom aktivering av G_i¹². ADORA2A uttrycks vid lägre nivåer, och främst i bruna adipocyter, och aktiverar lipolys via G s-signalering¹³. ADORA1 påverkar både basal lipolys och svaret på adrenerga agonister. Effekten av adenosin på lipolys kan kontrolleras genom tillsats av adenosindeaminas för att neutralisera adenosin, liksom ADORA1-specifik agonist fenylisopropyladenosin^14,15. Hormonell aktivering av G_q-kopplade GPCR kan också påverka lipolys via aktivering av fosfolipas C och proteinkinas C^16,17,18,19. Inflammatoriska signaler påverkar också lipolytiska hastigheter. TLR4-aktivering av LPS (och andra endotoxiner) ökar den lipolytiska hastigheten genom att aktivera ERK, som fosforylerar perilipin-1 och HSL²⁰. TNF-α aktiverar också lipolys via ERK- och NF-κB-aktivering, samt transkriptionell nedreglering av fosfodiesteras PDE-3B och CIDEC^21,22,23. IL-6 har också associerats med ökad adipocytlipolys, särskilt i mesenterisk fettvävnad, vars FFA-frisättning påverkar leversteatos och glukoneogenes^24,25,26.

Lipolys undertrycks under matningstillståndet av insulin. AKT fosforylerar och aktiverar PDE-3B för att undertrycka cAMP-signalering och förhindra PKA-aktivering²⁷. Insulin nedreglerar också ATGL²⁸ via transkription. Fetma främjar katekolaminresistens genom en mängd olika mekanismer, inklusive nedreglering av β-adrenerga receptorer i adipocyter 29,30,31,32,33. Adipocyter uttrycker alla tre β-adrenerga receptorer (β-1, β-2 och β-3). Medan β-1 och β-2 adrenerga receptorer uttrycks allestädes närvarande, uttrycks β-3-adrenerga receptorn huvudsakligen i adipocyter hos möss^34,35. Adrb3-uttryck induceras av C / EBPα under adipogenesis³⁶. Den β-3 adrenerga receptorn uttrycks starkt i mogna adipocyter. Aktiveringen av β-1 och β-2 adrenerga receptorer är självbegränsande på grund av återkopplingshämning av β-arrestin³⁷. Återkopplingshämning av β-3-adrenerga receptorn medieras av andra signalvägar, vilket minskar Adrb3-uttrycket ^33,38,39.

Många föreningar kan användas för att aktivera adipocytlipolys. Katekolaminer är viktiga fysiologiska aktivatorer av lipolys. Noradrenalin (eller noradrenalin) och adrenalin (eller adrenalin) aktiverar alla tre β-adrenerga receptorer⁴⁰. Noradrenalin och adrenalin påverkar också lipolys via aktivering av α-adrenerg receptorsignalering⁴¹. Vanliga β-adrenerga receptoragonister inkluderar isoproterenol, som är en icke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, och β-3-adrenerga receptoragonister CL-316,243 och mirabegron⁴². Med tanke på att adipocyter huvudsakligen uttrycker den β-3-adrenerga receptorn använder vi CL-316,243 som ett exempel här. Dess specificitet för β-3-adrenerga receptorn gör den också till en relativt specifik aktivator av adipocytkatekolaminsignalering, som också säkert kan användas in vivo. Observera att den vanliga koncentrationen av 10 μM CL-316,243 i cellodling är storleksordningar högre än den ~ 0,1 μM dos som krävs för att uppnå ett maximalt svar³³. Forskolin kringgår adrenerga receptorn, direkt aktivera adenylylcyklas och nedströms lipolytisk signalering. Det finns många fler aktivatorer, liksom suppressorer av lipolys. Vid val av en förening för att stimulera lipolys bör receptorspecificiteten och nedströms signalvägar noggrant övervägas inom den experimentella designen.

Graden av lipolys i vit fettvävnad är en viktig metabolisk faktor som påverkar kalltolerans och näringstillgänglighet under fasta eller träning^43,44,45,46. Syftet med detta protokoll är att mäta graden av lipolys i adipocyter och fettvävnad, vilket kommer att underlätta förståelsen av adipocytmetabolism och hur det kan påverka den metaboliska fenotypen av olika murina modeller. För att kvantifiera den lipolytiska hastigheten mäter vi utseendet på lipolytiska produkter i media (dvs FFA och glycerol). Metoden bygger på frisättning av lipolytiska produkter från adipocyten i media. Eftersom vita adipocyter uttrycker låga nivåer av glycerolkinas är glycerolåterupptagshastigheterna låga⁴⁷. Omvänt bör produktion av FFA och glycerol genom andra metaboliska vägar än lipolys också övervägas. Adipocyter verkar uttrycka ett fosfatas med aktivitet mot glycerol-3-fosfat, vilket möjliggör produktion av glycerol från glycerol-3-fosfat härrörande från glukos^48,49,50. Glykolys är en källa till glycerol-3-fosfat som används för FFA-reesterifiering i vita adipocyter. När glukosnivåerna är begränsade kräver glyceroneogenes andra 3-kolkällor, såsom laktat och pyruvat⁵¹. Kanaliseringen av FFA som frigörs genom lipolys i cellen och deras metaboliska öde är dåligt förstådd; FFA som frigörs genom lipolys måste omvandlas till fettacyl-CoA innan de förestras eller genomgår β-oxidation. Det verkar som om FFA som frigörs genom lipolys sannolikt lämnar cellen innan de tas upp igen och omvandlas till fettacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA kan sekvestreras utanför cellen med albumin. Viktigt är att långkedjiga FFA är kända för att återkopplingshämma lipolys om de inte sekvestreras av albumin 63,64,65,66,67. Således är optimering av medias FFA-buffertkapacitet under lipolysanalysen kritisk. Proceduren som beskrivs här liknar tidigare publicerade metoder för att mäta den lipolytiska hastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss och människor 15,68,69,70,71. Detta protokoll skiljer sig genom användning av seriell provtagning; Genom att utföra seriell provtagning kan vi internt validera att lipolys mäts i den linjära fasen och använda flera mätningar för att beräkna lipolyshastigheten, vilket minskar mätfelet för att öka förtroendet för det slutliga beräknade värdet. Nackdelen med seriell provtagning är att analysen kräver mer tid och reagens; Den längre tidsramen minskar dock mätfelets inverkan på standardfelet i uppskattningarna av frekvensen. Dessutom mäter detta protokoll både FFA- och glycerolfrisättning och beaktar förhållandet mellan FFA: glycerolfrisättning med målet att uppnå ett 3: 1-förhållande, vilket kan förväntas från fullständig lipolys och frisättning av lipolytiska produkter i media⁷².

Protocol

Användningen av alla djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Weill Cornell Medical College of Cornell University. 1. Förberedelse av buffertar och uppsamlingsplattor Gör 5% bovint serumalbumin (BSA) genom att lösa upp 5 g BSA i 100 ml Dulbeccos modifierade Eagle’s medium (DMEM) utan fenolrött. Rör försiktigt BSA för att lösa upp (skakning är kontraproduktivt). När BSA är helt upplöst, filtersterilisera mediet med ett 0,…

Representative Results

Vi mätte den basala och stimulerade lipolytiska hastigheten för in vitro differentierade adipocyter. Primära preadipocyter från vit fettvävnad differentierades till adipocyter genom behandling av konfluenta celler med 5 μM dexametason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin och 1 μM troglitazon i 4 dagar, följt av ytterligare 3 dagars behandling med 1 μg/ml insulin. Cellerna inkuberades i media utan insulin i 24 timmar före lipolysanalysen. Vid tiden = 0h tvättades cellerna en gång med PBS, sedan tillsattes f…

Discussion

Här tillhandahåller vi ett grundläggande protokoll för att mäta lipolyshastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad. För att kvantifiera lipolys är det viktigt att mäta lipolytisk hastighet i den linjära fasen. Vi använder en seriell provtagningsteknik, där en stor del av media samlas in och ersätts med färska medier med jämna mellanrum. Denna semikonservativa metod möjliggör tillsats av färsk BSA med FFA-buffertkapacitet och fördröjer återkopplingshämning, vilket förlänger varaktighet…

Materials

24-Well tissue culture treated plate	Corning Inc	3527	Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353078	Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid	Corning Inc	353046	Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate	USA sceintific	1402-9100	Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9418	FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243	Sigma Aldrich	C5976	CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator	PHCBI	MCO-170AICUVH	CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red	Thermofischer	11054020	Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin	Equitech-Bio, Inc,	BAH66
Free Glycerol Reagent	Sigma Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma Aldrich	G7793	This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution	Fujifilm	276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A	Fujifilm	999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B	Fujifilm	991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A	Fujifilm	995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B	Fujifilm	993-35191
Microbiological Incubator	Fischer Scientific	S28668	Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates	Thermo Scientific	269620	Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat	VWR	76045-300	Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader	Molecular devices	SpectraMax i3x	Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	810531
WypAll X70 Wipers	Kimberly-Clark	41200	Any high quality paper towel will work