Summary
En eksperimentel pipeline til kvantitativt at beskrive det bevægelige mønster af frit gående mus ved hjælp af MouseWalker (MW) værktøjskassen leveres, lige fra indledende videooptagelser og sporing til efterkvantificeringsanalyse. En rygmarvskontusionsskademodel i mus anvendes til at demonstrere nytten af MW-systemet.
Abstract
Udførelsen af komplekse og stærkt koordinerede motorprogrammer, såsom gang og løb, er afhængig af den rytmiske aktivering af spinal og supra-spinal kredsløb. Efter en thorax rygmarvsskade er kommunikationen med opstrøms kredsløb nedsat. Dette fører igen til tab af koordination med begrænset genopretningspotentiale. For bedre at evaluere graden af genopretning efter administration af lægemidler eller terapier er der derfor behov for nye, mere detaljerede og nøjagtige værktøjer til at kvantificere gang, lemmerkoordination og andre fine aspekter af lokomotorisk adfærd i dyremodeller af rygmarvsskade. Flere analyser er blevet udviklet gennem årene for kvantitativt at vurdere frigående adfærd hos gnavere; De mangler dog normalt direkte målinger relateret til tringangstrategier, fodaftryksmønstre og koordinering. For at afhjælpe disse mangler leveres en opdateret version af MouseWalker, som kombinerer en frustreret total intern refleksion (fTIR) gangbro med sporings- og kvantificeringssoftware. Dette open source-system er blevet tilpasset til at udtrække flere grafiske output og kinematiske parametre, og et sæt efterkvantificeringsværktøjer kan være at analysere de leverede outputdata. Dette manuskript viser også, hvordan denne metode, allieret med allerede etablerede adfærdstests, kvantitativt beskriver lokomotoriske underskud efter rygmarvsskade.
Introduction
Den effektive koordinering af fire lemmer er ikke unik for firbenede dyr. Forben-bagben-koordination hos mennesker er fortsat vigtig for at udføre flere opgaver, såsom svømning og ændringer i hastighed, mens de går1. Forskellige lemmerkinematiske2 og motoriske program 1,3,4 samt proprioceptive feedbackkredsløb5 bevares mellem mennesker og andre pattedyr og bør overvejes ved analyse af terapeutiske muligheder for motoriske lidelser, såsom rygmarvsskade (SCI)6,7,8.
For at kunne gå skal flere rygforbindelser fra forbenene og bagbenene være korrekt forbundet og rytmisk aktiveret, hvilket kræver input fra hjernen og feedback fra det somatosensoriske system 2,9,10. Disse forbindelser kulminerer i de centrale mønstergeneratorer (CPG'er), som er placeret på cervikal- og lændeniveau for henholdsvisforben og bagben 1,9,10. Ofte, efter SCI, begrænser forstyrrelsen af neuronal forbindelse og dannelsen af et hæmmende glialar12 genopretningen af lokomotorisk funktion, med resultater, der varierer fra total lammelse til begrænset funktion af en gruppe lemmer afhængigt af skadens sværhedsgrad. Værktøjer til præcis kvantificering af bevægelsesfunktionen efter SCI er afgørende for overvågning af helbredelse og evaluering af virkningerne af behandlinger eller andre kliniske indgreb6.
Standardmetrisk analyse for musekontusionsmodeller af SCI er Basso-museskalaen (BMS)13,14, en ikke-parametrisk score, der tager højde for trunkstabilitet, haleposition, plantartrin og koordination mellem forben og bagben i en arena med åbent felt. Selvom BMS er ekstremt pålidelig i de fleste tilfælde, kræver det mindst to erfarne raters at observere alle vinkler af dyrebevægelser for at tage højde for naturlig variabilitet og reducere bias.
Andre assays er også blevet udviklet til kvantitativ vurdering af motorens ydeevne efter SCI. Disse omfatter rotarod-testen, som måler tid brugt på en roterende cylinder15; den vandrette stige, der måler antallet af ubesvarede rækværk og positive stigegreb16,17; og strålegangstesten, som måler den tid, et dyr tager, og antallet af fejl, det laver, når det krydser en smal stråle18. På trods af at de afspejler en kombination af motoriske underskud, producerer ingen af disse tests direkte lokomotorisk information om koordination mellem forben og bagben.
For specifikt og mere grundigt at analysere gangadfærd er der udviklet andre assays til at rekonstruere trincyklusser og gangstrategier. Et eksempel er fodaftrykstesten, hvor et dyrs sværtede poter tegner et mønster over et ark hvidt papir19. Selvom det er enkelt i udførelsen, er det besværligt og unøjagtigt at udtrække kinematiske parametre som skridtlængde. Desuden begrænser manglen på dynamiske parametre, såsom varigheden af trincyklussen eller lovgivningsmæssig koordinering, dens anvendelser; Faktisk kan disse dynamiske parametre kun erhverves ved at analysere ramme-for-ramme-videoer af gnavere, der går gennem en gennemsigtig overflade. Til SCI-undersøgelser har forskere analyseret gangadfærd fra et lateralt billede ved hjælp af et løbebånd, herunder rekonstruktion af trincyklussen og måling af vinkelvariationerne i hvert benled 4,20,21. Selvom denne tilgang kan være yderst informativ6, forbliver den fokuseret på et specifikt sæt lemmer og mangler yderligere gangfunktioner, såsom koordinering.
For at udfylde disse huller udviklede Hamers og kolleger en kvantitativ test baseret på en optisk berøringssensor ved hjælp af frustreret total intern refleksion (fTIR)22. I denne metode formerer lys sig gennem glas via intern refleksion, bliver spredt ved potetryk og fanges til sidst af et højhastighedskamera. For nylig blev en open source-version af denne metode, kaldet MouseWalker, gjort tilgængelig, og denne tilgang kombinerer en fTIR-gangbro med en sporings- og kvantificeringssoftwarepakke23. Ved hjælp af denne metode kan brugeren udtrække et stort sæt kvantitative parametre, herunder trin-, rum- og gangmønstre, fodaftrykspositionering og koordination mellem forben og bagben samt visuelle output, såsom fodaftryksmønstre (efterligner den sværtede poteanalyse6) eller holdningsfaser i forhold til kropsaksen. Det er vigtigt, at nye parametre på grund af dets open source-karakter kan ekstraheres ved at opdatere MATLAB-scriptpakken.
Her opdateres den tidligere offentliggjorte samling af MouseWalker23-systemet . Der gives en beskrivelse af, hvordan du konfigurerer det, med alle de trin, der kræves for at opnå den bedste videokvalitet, sporingsbetingelser og parameteroptagelse. Yderligere efterkvantificeringsværktøjer deles også for at forbedre analysen af MouseWalker (MW) outputdatasættet. Endelig demonstreres nytten af dette værktøj ved at opnå kvantificerbare værdier for generel lokomotorisk ydeevne, specifikt trincyklusser og koordination mellem forben og bagben, i en rygmarvsskade (SCI) sammenhæng.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle håndterings-, kirurgiske og postoperative plejeprocedurer blev godkendt af Instituto de Medicina Molecular Internal Committee (ORBEA) og den portugisiske dyreetiske komité (DGAV) i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs retningslinjer (direktiv 2010/63/EU) og den portugisiske lov om dyrepleje (DL 113/2013) under licens 0421/000/000/2022. Hunmus i alderen 9 uger blev anvendt til dette studie. Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet af dyr og for at mindske lidelserne hos de dyr, der blev brugt i undersøgelsen. MATLAB-scriptet og den enkeltstående version af MW-softwaren er open source og er tilgængelige på GitHub
depot (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mens MW-softwaren blev udviklet i MATLAB R2012b, er den blevet tilpasset til at køre i MATLAB R2022b. Figur 1 illustrerer MW's analysearbejdsgang.
1. Opsætning af MouseWalker (MW) apparatet
- Saml MW-apparatet som beskrevet tidligere23, eller tilpas til de specifikke behov i det eksperimentelle design (se materialetabel og supplerende figur 1 for flere detaljer om opsætningen).
BEMÆRK: Gangarenaen kan gøres bredere for at rumme større dyr, såsom rotter. -
Kontroller, at plexiglasset, hvor dyrene går, er rent og ridsefrit. Brug en glat rengøringsklud, og minimer brugen af organiske opløsningsmidler såsom ammoniak eller ethanol i høje koncentrationer, hvilket kan beskadige plexiglasset (3% hydrogenperoxid, 7% ethanol eller ethvert kompatibelt og passende desinfektionsmiddel til plexiglas anbefales). Udskift om nødvendigt plexiglasset.
- Konfigurer højhastighedskameraet med et hurtigt objektiv og en stor blænde (dvs. mindre F-stopværdier) for at fange en stor mængde lys, da dette hjælper med at optage fTIR-signalerne (se materialetabel).
BEMÆRK: Objektivet må ikke generere optiske forvrængninger, især ikke i billedets kanter. Optiske forvrængninger kan testes ved at registrere et kendt mønster (f.eks. striber eller firkanter) og derefter måle størrelsen på blokkene på ImageJ/FIJI24 (brug linjeværktøjet, og klik derefter på Analysér > mål). For eksempel skal en firkant på 1 cm have de samme pixeldimensioner både i midten af billedet og på kanterne. Variationer skal være mindre end 5%. - Tænd den flerfarvede LED-lysstrimmel fra baggrundslysboksen.
- Tænd den hvide LED-lysstribe fra gangbroens lysboks.
BEMÆRK: En farvet LED kan også bruges25 til at lette sondringen mellem fodaftryk / krop / baggrund. - Når lyset i rummet er slukket, skal du kontrollere lysintensiteten af baggrundslysboksen og gangbroen. Juster intensiteten om nødvendigt ved hjælp af et potentiometer eller halvuigennemsigtig plast. Disse skal optimeres, så pixelintensiteten øges i følgende rækkefølge: dyrets krop < baggrund < fodspor.
- For at kontrollere pixelintensiteten af dyrets krop / baggrund / fodspor skal du åbne billedsekvensen på ImageJ / FIJI24 og klikke på Analyser > mål. Fodaftrykssignalet bør ikke overmættes, da dette forhindrer afgrænsningen af fodaftrykket i at blive defineret (dvs. tæer og fodpuder) (supplerende figur 2).
- Juster billedkontrasten på gangbroen på videooptagelsessoftwaren. Kontrasten kan justeres på to måder: ved at dæmpe eller øge belysningen på LED-strimlen eller ved at justere kameraets linseblænde.
- Placer objektivet korrekt, så det er i samme højde og i midten af det 45° reflekterende spejl og vinkelret (90°) på gangbroen. Dette vil generere et konstant proportionalt billede langs venstre-højre gangbro.
BEMÆRK: Undgå at ændre kamerapositionen (afstand, højde og retning) på tværs af de flere optagelsessessioner. Marker om nødvendigt gulvet, hvor stativet skal placeres. Dette bevarer billedfunktionerne. - Fokuser linsen på plexiglassets overflade. Dette kan testes ved hjælp af en ikke-skadelig genstand, der berører plexiglasets overflade.
BEMÆRK: Med lavere værdier for nødstopobjektiv bliver dybdeskarpheden mindre, hvilket gør fokuseringen sværere. - Sørg for, at alle indstillinger forbliver uændrede under analysen, da de kan ændre pixelintensiteten af de optagede videoer.
2. Video erhvervelse
- Sørg for, at musene er fortrolige med rummet og apparaturet inden test. Spar mindst 1 dag til tilvænning (dag 0). For at undgå overdreven træning skal du udføre MW-testen på en anden dag end de andre adfærdstest (helst dagen efter).
- I videooptagelsessoftwaren skal du sikre dig, at mindst 50 cm af gangbroen er synlig.
- Juster optagelsesindstillingerne for at afkorte gangbroområdet. Dette reducerer videostørrelsen og optimerer videooptagelsen.
- Tag et billede eller en kort video af en almindelig lineal før hver session. Antallet af pixels per centimeter vil senere blive brugt i "indstillingsvinduet" til at kalibrere videoerne.
- Start videooptagelsen, og placer dyret på kanten af gangbroen ved at tage fat i bunden af halen for at undgå skader. Sørg for, at dyrene bevæger sig fremad til platformens yderste kant. Udfør videooptagelserne med mindst 100 billeder / s for at sikre glatte gangovergange.
- Hvis det er nødvendigt, kan du motivere dyrene til at bevæge sig ved forsigtigt at banke på gangbrovæggen eller knipse/klappe med fingrene. Undgå dog fysisk nudging, da dette kan påvirke resultaterne.
- Gem videoerne direkte som billedsekvenser i TIFF (med LZW-komprimering), JPEG- eller PNG-format. Hvis kameraet optager som en rå MOV-fil, skal du konvertere videoerne til billedsekvenser ved at åbne filen i ImageJ / FIJI24 og klikke på File > Save as > Image sekvens (eller ved hjælp af anden software, såsom LosslessCut25).
BEMÆRK: De fleste dyr begynder at gå umiddelbart efter at være blevet sat i gangbroen; Derfor anbefales det at starte videooptagelsen, inden dyret placeres.
3. Forberedelse af videoer til MW-sporingssoftwaren
- Film nok komplette kørsler af hver enkelt mus. Antallet af dyr, der skal filmes pr. tilstand, og antallet af komplette kørsler skal afgøres i henhold til hvert forsøgsdesign. Et komplet løb er, når musen går hele 50 cm af gangbroen uden langvarige stop (i dette eksperiment blev der valgt tre komplette kørsler).
BEMÆRK: Afhængigt af billedoptagelsessoftwaren skal videoer muligvis beskæres til det mindste investeringsafkast. Dette vil øge hastigheden af sporing og outputgenerering. - I ImageJ/FIJI24 skal du vælge de rammer, hvor musen er på skærmen, ved at klikke på Image > Stack > Tools > Make a substack. Sporingen på MW kræver, at hoved og hale er synlige i alle rammerne. Det er dog muligt at lave flere substacks fra en enkelt videooptagelse, som senere vil repræsentere hver kørsel.
- Gem hver understak separat i forskellige mapper ved at klikke på Filer > Gem som > billedsekvens. MW-softwaren opretter senere automatisk en undermappe i hver mappe, hver gang man begynder at analysere en kørsel.
4. Sporing
- Åbn MATLAB, tilføj mappen, der indeholder MW-scriptet til arbejdsmappen, og kør "MouseWalker.m" på hovedkommandolinjen.
BEMÆRK: Brug af MW-softwaren under MATLAB gør det muligt at se sporingsfejlmeddelelser på MATLABs hovedkonsol og vælge de ønskede outputdata (ved at åbne hovedscriptfilen "MouseEvaluation.m" og ændre output til enten 1 eller 0: Excel-filen, fodtrinsplot, holdningsspor og gangmønstre). - Indlæs videomappen som "Input directory". Man kan også vælge outputmappen; Dette er dog ikke et krav, da MW-softwaren automatisk opretter en ny mappe kaldet "Resultater" inde i "Input-mappen".
- Brug pilene "<<", "<", ">>" og ">" til at kontrollere, om videobillederne alle er indlæst korrekt inde i MW-softwaren.
- Gå til vinduet "Indstillinger", hvor alle kalibrerings- og tærskelparametre er placeret. Disse indstillinger kan ændre sig afhængigt af pixelintensiteten af baggrunden og fodaftrykkene samt den minimale størrelse af kroppen og fodaftrykkene blandt andre faktorer (se eksempel i supplerende figur 2). Test effekten af at ændre nogle parametre ved at klikke på knappen Preview .
- Brug de forskellige plotstile, herunder "krop + fødder + hale", "kun krop", "kun fødder" og "kun hale", for at hjælpe med at skelne kropsdele efter justering af tærskelparametrene.
- Udnyt værktøjerne på højre sidepanel til at foretage målinger af lysstyrke eller størrelse (ved hjælp af henholdsvis "lysstyrke" og "lineal" knapper). Alle indstillinger kan gemmes som "standard", så længe kameraafstanden forbliver den samme.
- Når du har justeret tærskelparametrene, skal du kontrollere, at videoen er klar til automatisk sporing. Gå til den første ramme, og klik på Auto for at starte sporing. Dette trin kan følges i realtid, og det tager et par minutter afhængigt af videoens størrelse og computerens ydeevne.
- Hvis den automatiske sporing markerer brødtekstfunktionerne forkert, skal du annullere den automatiske sporing, angive nye indstillinger og genstarte processen.
- Når sporingen er afsluttet, skal du kontrollere, om der er behov for en manuel korrektion. For at korrigere skal du bruge midterpanelet til at vælge eller fravælge og angive placeringen af højre forfod (RF), højre bagdel (RH), venstre forside (LF) og venstre bagside (LH) potefodspor, hoved, næse, krop (opdelt i to segmenter) og halepositioner (opdelt i fire segmenter). Gem ændringerne ved at trykke på knappen Gem .
BEMÆRK: Alle knapper og de fleste kommandoer har en nøglegenvej (se den tilhørende vejledning for detaljer23). For at lette videorulning og udførelse af tastaturgenveje kan en hardwarecontroller med programmerbare knapper og et shuttlehjul som Contour ShuttlePro V2 bruges. - Klik på Evaluer for at generere outputfilerne fra den sporede video. Afhængigt af det ønskede output (se trin 4.1) kan dette trin tage et par minutter.
- Kontroller, at alle grafiske outputdataplots er gemt i mappen "Resultater". Kontroller nøjagtigheden af sporingen ved at undersøge nogle af de grafiske output, såsom "Stance traces", hvor man kan kontrollere, om alle potepositionerne er konsistente.
- Hvis der identificeres en fejl, skal du manuelt rette sporingen (hvis det er muligt, ellers skal du fjerne mappen "Resultater" og udføre automatisk sporing igen med nye indstillinger) og klikke på kommandoen Evaluer igen.
- Kontroller, at alle de kvantitative målinger, der genereres af MW-softwaren, gemmes i et Excel-regneark og opsummeres på "1. Info_Sheet". Sørg for, at Excel-indstillingerne for formelafgrænsningerne svarer til scriptet. Decimalseparatoren skal være ",", og de tusind separatorer skal være ";".
- Brug scriptet "MouseMultiEvaluation.m" til at samle målingerne fra alle kørsler i en ny fil til analyse.
- For at begynde skal du generere en .txt fil, der indeholder mappestierne til alle videoerne (f.eks. "Videofiler.txt"). Sørg for, at hver linje svarer til en enkelt video.
- Skriv derefter "MouseMultiEvaluation ('Videofiles.txt')" i kommandolinjen. En Excel-fil med navnet "ResultSummary.xls" genereres i arbejdsmappen (se et eksempel i GitHub-lageret).
BEMÆRK: Figur 2 viser de grafiske output, som MW-softwaren har opnået fra videoerne af et optaget dyr.
5. Kinematisk dataanalyse arbejdsgang
- Rediger Excel-arket, der blev genereret i trin 4.10, som indeholder dataene til behandling ved hjælp af de medfølgende Python-scripts, i henhold til følgende forudsætninger.
- Angiv forsøgsbetingelsen i den første kolonneoverskrift. Navngiv hver linje efter gruppe-/betingelsesnavnet (personer fra de samme grupper skal have samme navn). Den første gruppe skal være kontrollen eller basislinjen (dette er kun obligatorisk for heatmap-plotning, trin 5.6).
- Angiv dyre-id'et i den anden kolonne. Dette er obligatorisk, selvom disse oplysninger ikke vil blive brugt til plotgenerering.
- I den tredje kolonne og fremad skal du vælge de motorparametre, der skal bruges til analysen. Sørg for, at den første linje er navnet på parameteren (disse navne vises senere i plottene).
- Åbn Anaconda Navigator, og udfør Spyder for at åbne de medfølgende Python-scripts.
BEMÆRK: Alle scripts blev udviklet med Python 3.9.13, blev udført med Spyder 5.2.2 i Anaconda Navigator 2.1.4 og er tilgængelige i materialetabellen og GitHub-lageret (hvor yderligere materialer er inkluderet, såsom et videoeksempel, en Excel-eksempelfil og et dokument med ofte stillede spørgsmål). Det er muligt at udføre scripts uden for Anaconda Navigator; Denne grafiske brugergrænseflade er dog mere brugervenlig. - Brug "Rawdata_PlotGenerator.py" til at generere de rå dataplot. Dette muliggør visualisering af hver parameter som en funktion af hastigheden.
- Åbn "Rawdata_PlotGenerator.py" i Spyder, og kør koden ved at klikke på knappen Afspil .
- Vælg den Excel-fil, der skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vindue. Hvis arknavnet ikke blev ændret, skal du skrive "Ark1".
- De rå dataplots vises i plotkonsollen (øverste højre panel). For at gemme plottene skal du klikke på knappen Gem billede eller Gem alle billeder i plotkonsollen.
- Brug scriptet "Residuals_DataAnalysis" til at beregne residualerne til dataanalyse. Dette script genererer en CSV-fil med beregningerne af resterne for alle motorparametrene.
BEMÆRK: Mange af de målte gangparametre, der ekstraheres af MW, varierer med hastigheden (f.eks. svinghastighed, trinlængde, stancevarighed, stance rethed og gangindeks). Det anbefales derfor at udføre en bedst egnet regressionsmodel for hver enkelt parameter versus hastighed for baseline-eksperimentet og derefter bestemme restværdierne for hver eksperimentel gruppe i forhold til denne regressionsmodel. Dataene udtrykkes derefter som forskellen fra den resterende normaliserede linje26.- Åbn "Residuals_DataAnalysis.py" i Spyder, og kør koden ved at klikke på knappen Afspil .
- Vælg den Excel-fil, der skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vindue. Hvis arknavnet ikke blev ændret, skal du skrive "Ark1".
- Gem CSV-filen i samme mappe som dataene. Det er obligatorisk, at kontrolelementet (eller grundlinjen) er den første gruppe i Excel-filen.
- Brug scriptet "PCA_PlotGenerator.py" til at udføre en hovedkomponentanalyse (PCA).
BEMÆRK: Denne metode til reduktion af dimensionalitet uden tilsyn bruges til at generere en mere kortfattet repræsentation af27,28,29 af dataene (figur 3A, B). PCA-scriptet indeholder følgende trin. Dataene forbehandles først ved centrering og skalering, hvorefter PCA-algoritmen beregner kovariansmatrixen for at bestemme korrelationerne mellem variablerne og beregne egenvektorerne og egenværdierne for kovariansmatrixen for at identificere hovedkomponenterne. De første to eller tre hovedkomponenter vælges til repræsentation af dataene i henholdsvis 2D- eller 3D-plot. Hver prik i plottene svarer til et dyr og repræsenterer en anden abstrakt variabel. Farvekodede prikker bruges til at skelne mellem de specifikke grupper. Som sådan afspejler klynger af prikker lignende gangmønstre, der deles af de tilsvarende individer.- Åbn "PCA_PlotGenerator.py" i Spyder, og kør koden ved at klikke på knappen Afspil .
- Vælg den Excel-fil, der skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vindue. Hvis arknavnet ikke blev ændret, skal du skrive "Ark1".
- Sørg for, at PCA 2D- og 3D-afbildningerne vises i afbildningskonsollen (øverste højre panel). Hver farve repræsenterer en anden gruppe, og forklaringen vises ud for plottet. For at gemme plottet skal du klikke på Gem billede i plotkonsollen.
- Brug "Heatmap_PlotGenerator.py" til at generere et varmekort. Sørg for, at varmekortgeneratoren opretter en tabel, der viser de statistiske forskelle mellem basislinjegruppen (eller kontrolgruppen) og de andre grupper for hver motorparameter27 (figur 4). Hver kolonne viser en gruppe, og hver linje vedrører en bestemt motorparameter.
BEMÆRK: Statistisk analyse blev udført med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test (for normale fordelinger) eller en Kruskal-Wallis ANOVA efterfulgt af Dunns post hoc-test (for ikke-normale distributioner). Afvigende værdier blev udelukket fra analysen. P-værdier repræsenteres af en farvekode, hvor røde og blå nuancer angiver henholdsvis en stigning eller et fald i forhold til kontrol (eller basislinje). Farvenuancen repræsenterer den statistiske signifikans, hvor mørkere farver viser en højere betydning, og lysere farver viser en lavere betydning. svarer til P < 0,001; ** svarer til P < 0,01; og * svarer til P < 0,05. Hvid angiver ingen variation.- Åbn "Heatmap_PlotGenerator.py" i Spyder, og kør koden ved at klikke på knappen Afspil .
- Vælg den Excel-fil, der skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vindue. Hvis arknavnet ikke blev ændret, skal du skrive "Ark1".
- Vælg datatypen i det andet automatiske vindue: rådata eller restdata. Hvis en indstilling ikke er valgt, er restdata standard.
- Varmekortet vises i plotkonsollen (øverste højre panel). For at gemme plottet skal du klikke på Gem billede i plotkonsollen.
BEMÆRK: Det er obligatorisk, at kontrolelementet (eller grundlinjen) er den første gruppe i Excel-filen.
- Brug "Boxplots_PlotGenerator.py" til at generere boxplots. Dette værktøj tillader generering af boxplots, der repræsenterer fordelingen af værdier for alle motorparametre for hver gruppe (figur 5, figur 6 og figur 7).
BEMÆRK: Hver boks indeholder medianen som midterlinje, og boksenes nedre og øvre kanter repræsenterer henholdsvis 25 % og 75 % kvartiler. Knurhårene repræsenterer rækkevidden af det fulde datasæt, eksklusive afvigende værdier. Outliers defineres som enhver værdi, der er 1,5 gange interkvartilområdet under eller over henholdsvis 25% og 75% kvartiler.- Åbn "Boxplots_PlotGenerator.py" i Spyder, og kør koden ved at klikke på knappen Afspil .
- Vælg den Excel-fil, der skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vindue. Hvis arknavnet ikke blev ændret, skal du skrive "Ark1".
- Vælg datatypen i det andet automatiske vindue: rådata eller restdata. Hvis en indstilling ikke er valgt, er restdata standard.
- Boksplottene vises i plotkonsollen (øverste højre panel). For at gemme plottene skal du klikke på knappen Gem billede eller Gem alle billeder i plotkonsollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standard-BMS-systemet beskriver bruttomotorunderskuddene efter SCI14. På grund af dets subjektive karakter udføres andre kvantitative assays generelt sammen med BMS for at producere en mere detaljeret og fin vurdering af bevægelse. Disse tests viser imidlertid ikke specifikke oplysninger om trincyklusser, trinmønstre og koordination mellem forben og bagben, hvilket er ekstremt vigtigt for at forstå, hvordan rygsøjlekredsløbet opretholder funktion og tilpasser sig en ufuldstændig SCI. Dette afsnit viser, hvordan MW-værktøjskassen kan hjælpe med at overvåge genopretningen af bevægelsesfunktionen efter SCI og tilføje relevant information om gangadfærd.
Undersøgelsesprøven blev opdelt i to grupper af C57Bl/6J-hunmus i alderen 9 uger gamle: en SCI-forsøgsgruppe (n = 11), hvor dyrene gennemgik laminektomi efterfulgt af en moderat til svær kontusionsskade på niveauet af T9/T10-rygsøjlen ved hjælp af en uendelig horisontslaglegeme (se materialetabel); og en skamskadet kontrolgruppe (n = 10), hvor kun laminektomien blev udført på samme kolonneniveau (figur 1, trin 1). Den lokomotoriske opførsel af SCI og sham-skadede dyr blev overvåget i 30 dage. MW-testen blev udført på tilvænningsdagen før operationen (baseline) og 15 dage, 22 dage og 30 dage efter skaden (dpi) (figur 1, trin 2). For sammenligningens skyld blev musene udsat for BMS-testen parallelt før operationen og ved 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi og 30 dpi (supplerende figur 3). Efter sporing af alle de videoer, der blev opnået med MW, blev der derefter genereret to typer outputfiler: grafiske output, der viser visuelle repræsentationer af flere parametre efter hver kørsel, og kinematiske output, der opsummerer alle de målbare motorparametre (figur 1, trin 3 og trin 4).
Ved hjælp af et sæt Python-scripts (se materialetabel og GitHub-lagerlinket) blev rådataplottene derfor opnået (figur 1, trin 5). Da de fleste parametre påvirkes af dyrets hastighed, blev der udført en regressionsmodel af baselinegruppen før skaden sammen med de målte restværdier for hver tilstand (figur 1, trin 6). For at kontrollere for kinematiske profiler og signifikante forskelle mellem kontrolgrupperne (sham) og eksperimentelle grupper (SCI) blev alle de kinematiske parametre (i alt 79) udsat for en treordens hovedkomponentanalyse (PCA), og der blev genereret et varmekort med en samling motorparametre, der bedst beskrev datasættet (i alt 33) (figur 1, trin 7a, b). Endelig blev specifikke motorparametre, der blev påvirket efter forsyningskædeinitiativet, sammenlignet med basisscenariet før skaden (figur 1, trin 7c).
Figur 1: Skematisk gengivelse af MW's analysearbejdsgang. (1) Dyrene udvælges på grund af laminektomi (skinkontrolgruppe) eller laminektomi efterfulgt af en rygmarvsskade (forsøgsgruppe). (2) Dyrene udsættes derefter for en adfærdsanalyse dagen før skaden og på dag 15, 22 og 30 efter skaden. (3) MW genererer to typer outputdata: a) grafiske visualiseringer af flere parametre, såsom holdningsspor, gangarter og trinmønstre, og b) en kinematisk oversigt over alle de målbare motorparametre. (4) Alle kontrol- og eksperimentelle data samles i en enkelt fil ved hjælp af scriptet "MouseMultiEvaluation.m" på MATLAB. (5) "RawData_PlotGenerator" -scriptet til Python genererer en visuel repræsentation af, hvordan alle de målbare motorparametre varierer alt efter hastighed. Hvis parametrene ikke korrelerer med hastighed, kan man springe til (7); Men da de fleste parametre efter SCI i høj grad afhænger af hastigheden, bør der genereres en model (6) ved hjælp af scriptet "Residual_DataAnalysis" til Python. Efter generering af restværdierne for hver motorparameter udføres dataanalyse (7): a) der udføres en analyse af hovedkomponenten (PCA) ved hjælp af et udvalg af parametre med et "PCA_PlotGenerator"-script; b) der oprettes et varmekort med et "Heatmap_PlotGenerator"-script for at vise de statistisk signifikante forskelle mellem betingelserne for forskellige parametre og c) flere individuelle parametre, der ændres efter SCI, evalueres med scriptet "BoxPlot_PlotGenerator". Alle scripts er tilgængelige i Link of Materials og GitHub-lager. Scripts vises med rødt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Fra de grafiske outputdata indsamlet fra MW var det muligt at bekræfte den velkendte pludselige ændring i den visuelle visning af fodsporene efter SCI. I "Digital-ink" -analysen genereret af MW blev der påvist manglende støtte til bagpoterne (figur 2A) sammen med et fald i fodaftryksområdet for både venstre og højre bagpote (figur 2B), som blev opretholdt fra 15 dpi og fremefter (data ikke vist). Derudover beregner MW inden for hver trincyklus parametre relateret til holdningsfasen (dvs. tiden mellem pote-touchdown og før lift-off) og svingfasen (dvs. den tid, lemmen er væk fra jorden). Som sådan kan MW generere visuelle "stance traces", som tager højde for placeringen af kroppens centrum og akse i forhold til hvert ben og deres fodaftrykscenter i holdningsfaserne23. De overordnede holdningsspor, der blev opnået for hvert dyr, viste flere unikke træk (figur 2C). Disse data viste, at bagpoterne efter SCI havde kortere holdningsspor og mere tilfældig potepositionering ved både touchdown og lift-off fra 15 dpi og fremad (figur 2C).
Figur 2: Repræsentative grafiske output opnået af MW-softwaren fra sporingsvideoerne. A) "Digitalblæk"-udskrifter for et SCI-dyr, der viser hver pote med en anden farve: rød (højre for), gul (venstre for), grøn (højre bag) og blå (venstre bag) på flere tidspunkter. B) Fodspor for venstre forside (LF), venstre bagside (LH), højre forside (RF) og højre bagdel (RH) af et SCI-dyr ved 15 dpi. C) "Stancespor" for ét LAF-dyr på flere tidspunkter. AEP og PEP for et af benene er illustreret i det første panel. "Footprint clustering" for både AEP og PEP svarer til standardafvigelsen for de gennemsnitlige AEP- eller PEP-koordinater i hver video. Forkortelser: dpi = dage efter skade; cm = centimeter; px = pixel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Dernæst blev de kinematiske output analyseret efter beregning af MW (figur 3 og figur 4). For at opnå en mere kortfattet afbildning af datasættet og teste, om de kinematiske motorparametre opnået fra MW var nok til at skildre lokomotoriske underskud fundet i SCI-dyr over tid, blev der udført en PCA27 . Det er bemærkelsesværdigt, at 40 % af variansen i dataene kunne forklares i den første komponent (PC1: 40,1 %), som adskilte gruppen af dyr, der havde en SCI fra resten, med en p-værdi lavere end 0,001 baseret på en envejs ANOVA test (figur 3A, B) på alle tidspunkter (15 dpi, 22 dpi og 30 dpi). Der var også et dårligt bidrag fra de andre komponenter (PC2: 11% og PC3: 8,6%). Den tildelte vægt af hvert motorparameterbidrag for hver komponent er illustreret i supplerende figur 4. Desuden var variansen i datasættet ikke tilstrækkelig til at afspejle forskelle over tid (dvs. mellem 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi), hvilket replikerer det tidligere beskrevne plateau for lokomotorisk genopretning14. Alt i alt indikerer disse resultater, at de kinematiske parametre opnået fra MW stærkt beskriver de motorunderskud, der observeres efter SCI på tværs af alle tidspunkter.
Figur 3: Hovedkomponentanalyse af alle kinematiske motorparametre (79) opnået af MW-softwaren efter restdataanalysen . (A) En 3D-visualisering af PCA-analysen med tre komponenter. (B) En 2D-visualisering med cirkler, der repræsenterer 50% af de indsamlede data. I PC1, som forklarede over 40% af variansen, var SCI-gruppen ved 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi signifikant forskellig fra sham-gruppen og baseline (før skade) med en p-værdi < 0,001, bestemt af en envejs ANOVA. Hver enkelt lille prik eller trekant repræsenterer gennemsnittet af tre videoer for hvert dyr, mens de større prikker eller trekanter repræsenterer gennemsnitspunktet (n = 10-11 pr. tilstand, n = 21 for basislinjegruppen). Bidraget fra hver komponent er angivet i hver akse. Forkortelser: dpi = dage efter skade; SCI = rygmarvsskade; PC = hovedkomponent. Klik her for at se en større version af denne figur.
Derefter blev en samling motorparametre valgt baseret på, hvor stærkt den beskrev datasættet (33 i alt), og der blev genereret et varmekort (figur 4). Faktisk viste de fleste lokomotoriske parametre en drastisk ændring efter SCI på alle tidspunkter (15 dpi, 22 dpi og 30 dpi), mens de skamskadede kontroller kun viste signifikante ændringer ved 30 dpi. Disse ændringer i skingruppen kan forklares ved et generelt fald i svinghastigheden, muligvis på grund af testtilvænning, som vil blive diskuteret senere.
Det var bemærkelsesværdigt, at SCI-dyrene gik langsommere end de skamskadede kontroller (data ikke vist). Uafhængigt af hastigheden udviste SCI-dyrene imidlertid ved både 15 dpi og 30 dpi en højere svingvarighed, lavere holdningsvarighed og et lavere arbejdsfaktorindeks, der vedrører holdningsvarigheden/skridtperioden23. Disse resultater indikerer, at ændringerne i benpositionering beskrevet ovenfor er karakteristiske for SCI, som det ses i andre dyremodeller30,31,32, og er ikke relateret til ændringer i tempo (figur 4).
Det skal også nævnes, at venstre og højre synkroni ikke blev påvirket, da der ikke blev observeret en signifikant ændring i "fase" -indekserne for forben og bagben10,23 (figur 4), hvilket indikerer intakt kobling mellem venstre og højre lemmer.
Desuden viste SCI-musene et lavere indeks for "stance straightness" (forskydning/banelængde) i både forbenene og bagbenene (figur 4). Denne parameter måler, hvor lineære sporene er i forhold til den ideelle tilstand, som ville være en lige linje (fra 0 til 1, hvilket indikerer et lineært spor)27. Derfor indikerer disse resultater en stærk manglende evne til at gå lige i denne gruppe.
For hver holdningsfase tegner MW en rekonstruktion af kroppens svingninger, der starter ved pote-touchdown - den forreste ekstreme position eller AEP - og slutter før lift-off - den bageste ekstreme position eller PEP (se eksemplet i figur 2C). "Footprint clustering" af både AEP og PEP måler standardafvigelsen for de gennemsnitlige AEP- eller PEP-koordinater i hver video. SCI-dyrene viste en stigning i klynger af bagpotefodaftryk for AEP på alle tidspunkter, og der blev kun observeret en signifikant effekt for den skamskadede gruppe ved 15 dpi (figur 4). Dette illustrerer, at SCI-dyrene ikke kunne placere deres bagben korrekt ved touchdown efter svinget. Derudover blev der set et fald i forpote "footprint clustering" for PEP sammen med et fald i bagpote footprint clustering for PEP ved 30 dpi (figur 4). Disse resultater er i overensstemmelse med det, der observeres i de tegnede "holdningsspor" og tyder på, at forpoternes position bliver mere begrænset efter skade.
Endelig og i overensstemmelse med ændringerne i potepositioneringen var der ændringer i gangstrategierne og "trykket" fremkaldt af poterne, målt ved den gennemsnitlige lysstyrke over området (figur 4), som vil blive diskuteret yderligere.
Figur 4: Heatmap-plot, der viser en samling af de signifikant ændrede lokomotoriske parametre, der sammenligner SCI-dyr og skamskadede dyr i forhold til dagen før operationen, som opnået af MW efter restdataanalyse. n = 10-11 pr. tilstand; Baselinegruppen omfatter alle dyrene dagen før operationen, n = 21. Data udtrykkes ved p-værdien efter statistisk analyse med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post-hoc-test (for ikke-normale fordelinger). P-værdierne er repræsenteret af en farvekode, hvor røde og blå nuancer angiver henholdsvis et fald eller en stigning i forhold til grundlinjen. Farveskyggen repræsenterer den statistiske signifikans, hvor mørkere farver angiver en højere betydning og lysere farver angiver en lavere betydning; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Hvid angiver ingen variation. Forkortelser: dpi = dage efter skade; SCI = rygmarvsskade; s = sekund; ms = millisekund; gns. = gennemsnit; F = fore; H = hind; AEP = forreste ekstreme position; PEP = bageste ekstreme position; LF = venstre foran; LH = venstre bagside; RF = højre for; RH = højre bagside. Klik her for at se en større version af denne figur.
Derefter søgte vi at forstå, hvilke individuelle parametre der ville være bedst til at beskrive LSCI-dyrs lokomotoriske underskud på forskellige stadier af skaden (dvs. 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi). Vi startede med at undersøge trincyklusparametrene, der viste forskelle mellem forbenene og bagbenene, da bagbenene udviklede sig fra total lammelse til delvis funktion (figur 5). Mens den gennemsnitlige svinghastighed steg signifikant for forbenene i forhold til baseline (før skade), ændrede bagbenets svinghastighed sig ikke signifikant (selvom der var en tendens til, at den var lavere end baseline) (figur 5A, B). Parallelt faldt den gennemsnitlige trinlængde af forbenene uden signifikante ændringer for bagbenene (figur 5C, D). Ikke overraskende viste de skadede mus nedsat varighed af sving i forbenene og en omvendt stigning i varigheden af deres bagbenssvingninger ved 15 dpi og fremad (figur 5E, F). Samlet set indikerer disse resultater, at forbenene vedtog en hurtigere rytme med to forbencyklusser for hver bagbencyklus. Dette 2:1 cyklusforhold er tidligere beskrevet efter SCI hemisektion hos rotter 1,33 og illustrerer et centralt aspekt af defekt koordination mellem forben og bagben, som ikke genvindes efter 30 dpi hos mus.
Figur 5: Trincyklusparametre for forpoter og bagpoter på flere tidspunkter 1 dag før skaden og ved 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi hos SCI-dyr (n = 11). (A,B) Den gennemsnitlige svinghastighed for forpoter og bagpoter i forhold til basislinjen. (C,D) Den gennemsnitlige trinlængde af forpoterne og bagpoterne i forhold til basislinjen. (E,F) Den gennemsnitlige svingvarighed for forpoter og bagpoter i forhold til basislinjen. I boxplots er medianen repræsenteret af midterlinjen, og boksens nedre og øvre kanter repræsenterer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Knurhårene repræsenterer rækkevidden af det fulde datasæt. Outliers er repræsenteret af enkelte prikker. Statistisk analyse blev udført med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post-hoc-test (for ikke-normale distributioner). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dage efter skade; SCI = rygmarvsskade; cm = centimeter; s = sekund. Klik her for at se en større version af denne figur.
MW-softwaren er også i stand til at beregne musenes trinmønstre ved at måle brøkdelen af rammer, der er tildelt en bestemt benkombination, og dette fungerer som en proxy for tilstedeværelsen af specifikke gangstrategier. Ved langsommere hastigheder har uskadte mus tendens til at vedtage en "ganggang", hvor de fleste rammer har et enkeltbensving (uanset potepositionen). Ved mellemhastigheder, mest almindelige på landingsbanen, skifter mus til en travgang, hvor den mest repræsentative konfiguration er diagonalbensvinget. Endelig bruger mus ved højere hastigheder en "galopgang", hvor tre ben svinger på samme tid23,34. Andre mindre almindelige konfigurationer omfatter pacing gangart, for det meste repræsenteret af lateral-ben sving (enten både venstre eller højre ben), og "bundet / hoppende gang", med enten både bagben eller forben svingende samtidig10. Man skal dog huske på, at i forbindelse med en SCI kan nogle af disse konfigurationer, såsom trebenssvinget, afspejle defekt bagbenspotepositionering og dermed ikke nøjagtigt matche med en bestemt gangstrategi - i dette tilfælde galoppen. Derfor blev analysen forenklet ved at sammenligne benkonfigurationerne alene.
Efter udførelse af restanalysen blev det bemærket, at der var et fald i forekomsten af diagonale svingninger ledsaget af et fald i enkeltgynger på alle tidspunkter (figur 6A, B). Mere interessant var der en stigning i forekomsten af laterale svingninger (figur 6C). Den pacing-lignende gang er ikke typisk for en normal C57BL/6J mus; Det er dog allerede rapporteret at forekomme efter SCI-hemisektion hos rotter1. Dette in-fase mønster var ikke udbredt nok til at ændre forbenet eller bagbenets faseindeks (som det ses i figur 3), men illustrerer defekt spinal feedback fra bagbenene til forbenene. Derudover var der en naturlig stigning i forekomsten af forben/bagbensgynger (figur 6D), muligvis på grund af forkert bagbensplantartrin, og en stigning i trebenssvingninger (figur 6E).
Figur 6: De gennemsnitlige indekser for forskellige trinsvingkonfigurationer . (A) diagonal, (B) enkelt, (C) lateral, (D) for/bag, og (E) trebenet sving på flere tidspunkter hos SCI-dyr (n = 11) vises. I boxplots er medianen repræsenteret af midterlinjen, og boksens nedre og øvre kanter repræsenterer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Knurhårene repræsenterer rækkevidden af det fulde datasæt. Outliers er repræsenteret af enkelte prikker. Statistisk analyse blev udført med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post-hoc-test (for ikke-normale distributioner). **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dage efter skade; SCI = rygmarvsskade; NA = ikke relevant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Endelig er en anden aflæsning, der kan udvindes fra MW, "tryk" som et mål for lysstyrke / areal. Med højere hastigheder falder kontaktområdet med jorden, og trykket stiger, så der blev udført en lineær regression af basislinjedataene, og restværdierne for hver tilstand blev målt. Det blev bemærket, at trykket på forpoterne steg betydeligt på tværs af alle tidspunkter, men styrken af denne effekt havde tendens til at falde over tid, da ændringen for venstre forpote allerede mistede statistisk signifikans ved 30 dpi (figur 7A, C). Denne specifikke effekt på venstre side kunne forklares ved en lateraliseret skade, som fortrinsvis kunne have påvirket højre side af rygmarven i denne undersøgelse. Ikke desto mindre blev trykket fra bagpoterne som forventet reduceret hos skadede mus på tværs af alle tidspunkter uden tendens til en stigning (figur 7B, D).
Figur 7: Tryk fremkaldt af bag- og forpoterne på flere tidspunkter hos SCI-dyr (n = 11). Tryk fremkaldt af (A) venstre forpote, (B) venstre bagpote, (C) højre forpote og (D) højre bagpote, vist som relative forskelle i forhold til baseline (dagen før skaden). I boxplottene er medianen repræsenteret som midterlinjen, og boksenes nedre og øvre kanter repræsenterer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Knurhårene repræsenterer rækkevidden af det fulde datasæt. Outliers er repræsenteret af enkelte prikker. Statistisk analyse blev udført med en envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post-hoc-test (for ikke-normale distributioner). **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dage efter skade; SCI = rygmarvsskade; cm = centimeter; px = pixel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Samlet set illustrerer denne undersøgelse MW-systemets evne til kvantitativt at beskrive de motoriske svækkelser forårsaget af SCI, som undertiden kan ses bort fra på grund af andre testbegrænsninger. Desuden understreger det den utvivlsomt begrænsede funktionelle genopretning over tid i kontusionsmusemodellen af SCI.
Supplerende figur 1: MW-hardwarekomponenterne. (A) Denne opsætning er opdelt som følger: I - fTIR gangbro; II - fTIR-støttebase og stillinger III - gangbro væg; IV - 45° spejl; og V - baggrundsbelysning. (B) Nærbilleder af Base-U-kanalen og gangbroens sidelinje. (C) Design af gangbrovæggen. (D) Nærbillede af 45° spejlopsætningen. Forkortelse: cm = centimeter. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Et enkelt billede af en fTIR-video, hvor pixelintensiteten og områdeområderne er angivet. Pixelintensiteterne for kroppen, baggrunden og fodsporene, der bruges til videoanalysen i denne undersøgelse, præsenteres mellem parenteser og angivet med rødt, alt sammen optimeret til billedklarhed. Lysintensiteten bør justeres for at opnå passende skelnen mellem de forskellige regioner. Relative områder af kroppen og fodspor er angivet med stiplede gule linjer. Både arealerne og pixelintensiteten blev erhvervet i ImageJ/FIJI. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: (A) BMS total score og (B) subscore af musene analyseret i denne undersøgelse (n = 10-11). Alle data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse blev udført med en tovejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af Bonferronis post hoc-test; P < 0,001. Forkortelse: BMS = Basso museskala. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Den tildelte vægt af hvert motorparameterbidrag for hver komponent. Den tildelte vægt af hver motorparameter (79 i alt) efter restanalysen for (A) PC1, (B) PC2 og (C) PC3 i PCA. Afskæringslinjen blev trukket ved 0, 04 ms og -0, 04. Forkortelser: ms = millisekund; gns. = gennemsnit; SD = standardafvigelse; F = fore; H = hind; AEP = forreste ekstreme position; PEP = bageste ekstreme position; LF = venstre foran; LH = venstre bagside; RF = højre for; RH = højre hind; Tryk på = tryk. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstreres potentialet i MouseWalker-metoden ved at analysere bevægelsesadfærd efter SCI. Det giver ny indsigt i specifikke ændringer i trin-, fodaftryks- og gangmønstre, som ellers ville blive overset af andre standardtests. Ud over at levere en opdateret version af MW-pakken beskrives dataanalyseværktøjer også ved hjælp af de medfølgende Python-scripts (se trin 5).
Da MW genererer et stort datasæt og en samling kinematiske parametre, der afspejler en meget dimensionel lokomotorisk proces, blev der anvendt en PCA; faktisk er PCA blevet brugt i vid udstrækning i andre kinematiske datasæt svarende til denne 27,35,36 (figur 3). Denne dimensionsreduktionsteknik er en enkel og robust metode med minimale antagelser, der giver mulighed for kvantitativt at identificere kinematiske profiler og hurtigt skelne dem fra kontrol- eller baselineforhold. Derudover blev der genereret varmekort for straks at identificere de parametre, der var statistisk forskellige fra baseline (figur 4), som senere kunne analyseres individuelt (figur 5, figur 6 og figur 7).
Efterfølgende blev det vist, hvordan specifikke parametre, der kan udvindes fra MW, illustrerer de robuste bevægelige underskud, der ses hos SCI-dyr, såsom koordination. Koordinering er evnen til at bruge hvert lem på en organiseret måde til at udføre en opgave. Ofte måles koordination indirekte ved antallet af fejl/positive hændelser på en stige 16,17 eller tiden brugt på rotarod15. Tydeligt beregner MW både variabiliteten i potepositionering under trincyklussen (fodaftryksmønster) og indekset "stance straightness"27. Det blev påvist, at begge parametre var signifikant påvirket af skaden (figur 4).
Desuden giver MW brugeren mulighed for at udtrække parametre relateret til tidsmæssig dynamik. Der blev observeret en signifikant forstyrrelse af sving-/holdningsvarigheden hos SCI-dyr (figur 4), og det blev konstateret, at SCI-musene kompenserede for tabet af støtte på bagbenene ved at fremskynde deres forbens trincyklus og dermed reducere forbenets trinlængde og gennemsnitlige svingtid (figur 5). Denne effekt kan relateres til skiftet i tyngdepunktet, hvilket tvinger forpoterne til at udholde mere kropsvægt1. Ligeledes kan det tilskrives tabet af de lange stigende propriospinale veje, som er ansvarlige for den synergetiske interaktion mellem forbenet og bagbenet CPG'er 1,9,32, hvilket i sidste ende fører til rytmedissociation mellem forben og bagben.
Karakteristika for tringang kan illustrere den modulære organisering af lokomotoriske netværk 1,34. Selv om trædemønstre ikke er en direkte proxy for de gangstrategier, der er vedtaget i dette tilfælde23, kan der stadig drages nogle vigtige observationer. Der blev set vigtige ændringer i SCI-musenes trædemønstre (figur 6). De skadede dyr begyndte at vedtage laterale svingninger (pacing-lignende gangarter), og der var også et fald i diagonale gynger. Disse tilpasninger synes at være forbundet med et forsøg på at koordinere forbenene og bagbenene, hvilket igen demonstrerer dissociationen mellem rygmarvssporene under og over skaden, som ikke genvinder 1,9,32.
Den begrænsede restitution efter SCI blev også verificeret ved et fald i muskelkraft i bagbenene, målt ved gennemsnitstrykket (figur 7). Derfor er forbenene tvunget til at understøtte mere kropsvægt, hvilket øger trykket. Mens mange parametre relateret til muskeldynamik ikke blev analyseret her (dvs. flexor og extensor muskelkoordination 7,21), kan denne kvantitative måling give en direkte aflæsning af mængden af lemmer.
Denne MW-analyse kan også kombineres med standard BMS-testen, som måler lemmernes rotation, poteplacering, haleposition og trinfejl. Generelt opnår SCI-mus en maksimal score på 4-5 med en maksimal underscore på 3, hvilket betyder, at de kan udføre lejlighedsvise til hyppige trin, men for det meste rotere ved poteløft og / eller touchdown14 (supplerende figur 2). Det bliver klart, hvorfor AEP-værdierne for bagpoterne blev signifikant ændret i SCI-gruppen, da den ikke-parallelle placering af lemmerne under svingfasen kan påvirke potekoordinaterne. Derudover klassificeres bagagerummet i BMS normalt som alvorligt på grund af tilstedeværelsen af forekomster eller begivenheder, der forhindrer trinping, såsom røv ned og hopping14. Selvom det ikke var muligt at kvantificere stødadfærd eller tilfælde, der forhindrede trin, blev der påvist begrænset bagpotetrin i MW med højere svingvarighed (figur 5F), øget tre bensving (figur 6E) og lavere tryk (figur 7B-D). Derudover blev der observeret en signifikant stigning i for-/baggynger (figur 6D). Der kan være to komplementære forklaringer på denne adfærdsmæssige manifestation. Først blev den hoppelignende gang målt, hvilket allerede kunne observeres i BMS-testen. Denne adfærd kan dog også være relateret til mangel på korrekt plantar i begge bagben, hvilket resulterer i fodtræk eller dorsal placering. Samlet set understøtter disse observationer påstanden om, at trunkstabiliteten er alvorligt beskadiget efter SCI. Endelig er et af kravene for at score højere end 5 i BMS-testen koordinering14, og til dette skal mindst tre tilgængelige pas overholdes af raterne under testen. Af disse skal to ud af de tre eller flere tilgængelige pas klassificeres som koordinerede (dvs. skiftevis forben og bagben). Fra MW-dataene kan man udtrække objektive målinger, stance straightness index og footprint clustering, som direkte kvantificerer koordination uafhængigt af dyrehastighed eller tilgængeligt pas (figur 4). Derudover kan vekslingen mellem lemmer kvantificeres objektivt ved at måle trinstrategierne (figur 6). Disse parametre illustrerer tydeligt, at SCI-mus konsekvent ikke kan gå i lige linjer og forlægge deres bagben.
Mens MW-værktøjskassen er en nyttig strategi til at studere lokomotoriske defekter efter SCI, bør man overveje nogle af dens begrænsninger. For det første er det afgørende at forblive i overensstemmelse med anskaffelsesparametrene (dvs. kameraposition, fokus, lysintensitet), så billedfunktionerne mellem tidspunkterne opretholdes. For det andet blev det bemærket, at gentagelse førte til habituation, hvilket igen førte til en nedsat hastighed. Dette bidrog også til øget opdræt / plejeadfærd og stopper midt i løbet. For tilskadekomne dyr var der også en tendens til at læne sig på gangbroens vægge og et øget antal stop midt i løbet. Da denne adfærd ikke er en del af den lokomotoriske vurdering, skal de ikke overvejes. Fortrinsvis bør forskere vælge videoer, hvor dyrene går kontinuerligt med hovedet pegende lige. For at modvirke indflydelsen af denne adfærd på resultaterne af denne undersøgelse blev mus registreret kontinuerligt i mindst fire eller fem løb og fik lov til at løbe i begge retninger langs gangbroen. Derefter blev de tre bedst registrerede kørsler udvalgt og justeret til samme retning på ImageJ/FIJI24 (180° rotation). Således var hvert dyr repræsenteret af et gennemsnit på tre kørsler samlet sammen pr. Tidspunkt. Et større antal dyr pr. tilstand kan også reducere den forventede variabilitet. Desuden skal det bemærkes, at denne lokomotoriske test kun anbefales, når plantar trin er opnået, da sporingssystemet er designet til finjusteret lokomotorisk vurdering. I denne undersøgelse blev det bemærket, at MW-testen før 15 dpi ikke var fordelagtig til lokomotorisk vurdering på grund af den øgede fodtræk og forkerte plantarplacering, hvilket kunne påvirke sporingen (data ikke vist). Endelig er nogle parametre (såsom fodaftryksklynger) meget følsomme over for ekstrapolationerne foretaget af den genererede regressionsmodel. Derfor blev koden justeret i overensstemmelse hermed (se dokumentationen i scriptet i GitHub-linket).
Samlet set blev det vist, at MW i høj grad kunne skelne SCI-dyr fra skamskadede kontroller, og MW kunne også samarbejdes med etablerede tests som en værdifuld metode til at studere lokomotoriske defekter efter SCI. Desuden blev det vist, at kvantitative output let kunne genereres fra MW-datasættet ved hjælp af de medfølgende Python-scripts. Disse værktøjer giver en effektiv eksperimentel pipeline til at generere et rigt og forskelligartet sæt kvantitative og grafiske output, der supplerer de originale MW-outputfiler og kan ændres for at opfylde forskerens mål med hensyn til typen af analyse og grafisk repræsentation.
Denne værktøjskasse er en værdifuld metode til at studere andre motorrelaterede sygdomme eller motoriske dysfunktioner, ikke kun dem, der er relateret til rygmarvsskade. Skarlatou et al.10 viste allerede, at en specifik mutation i Afadin, et vigtigt stilladsprotein under udvikling, forårsagede en afvigende fænotype i rygmarven ved at generere to centrale kanaler. Denne defekt resulterede i tab af højre-venstre lemmer vekslen og en højere forekomst af lemmer synkronisering, typisk for en hoppende gang. Stauch et al.10 illustrerede også, at denne type system kan tilpasses efter brugerens behov. I dette tilfælde blev det anvendt til at studere specifikke adfærdsmæssige underskud i en rotte Parkinsons sygdomsmodel. Denne værktøjskasse har således en bred vifte af anvendelser i forskellige modeller, hvor motoriske forstyrrelser forventes og kan kombineres med allerede etablerede adfærdsprotokoller i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Laura Tucker og Natasa Loncarevic for deres kommentarer til manuskriptet og støtten fra gnaveranlægget ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Forfatterne ønsker at anerkende økonomisk støtte fra Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for forskning i rygmarvsskade (MC-36/2020) til L.S. og CSM. Dette arbejde blev støttet af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 og UIDP/04462/2020) og LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) til C.S.M. L.S. blev støttet af en kontrakt med CEEC Individual Principal Investigator (2021.02253.CEECIND). A.F.I. blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (2020.08168.BD). AMM blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (PD / BD / 128445 / 2017). I.M. blev støttet af et postdoktoralt stipendium fra FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. blev støttet af et ph.d.-stipendium fra FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
