Summary
En eksperimentell rørledning for kvantitativt å beskrive det lokomotoriske mønsteret til fritt gående mus ved hjelp av MouseWalker (MW) verktøykasse er gitt, alt fra innledende videoopptak og sporing til postkvantifiseringsanalyse. En ryggmargskontusjonsskademodell hos mus brukes til å demonstrere nytten av MW-systemet.
Abstract
Gjennomføringen av komplekse og høyt koordinerte motoriske programmer, som å gå og løpe, er avhengig av rytmisk aktivering av spinal- og supra-spinalkretser. Etter en thorax ryggmargsskade er kommunikasjonen med oppstrøms kretser svekket. Dette fører igjen til tap av koordinering, med begrenset utvinningspotensial. Derfor, for bedre å evaluere graden av utvinning etter administrering av legemidler eller terapier, er det behov for nye, mer detaljerte og nøyaktige verktøy for å kvantifisere gange, lemkoordinering og andre fine aspekter av lokomotorisk oppførsel i dyremodeller av ryggmargsskade. Flere analyser har blitt utviklet gjennom årene for å kvantitativt vurdere frittgående oppførsel hos gnagere; Imidlertid mangler de vanligvis direkte målinger relatert til trinnvise gangstrategier, fotavtrykksmønstre og koordinering. For å løse disse manglene, tilbys en oppdatert versjon av MouseWalker, som kombinerer en frustrert total intern refleksjon (fTIR) gangvei med sporings- og kvantifiseringsprogramvare. Dette open source-systemet er tilpasset for å trekke ut flere grafiske utganger og kinematiske parametere, og et sett med postkvantifiseringsverktøy kan være å analysere utdataene. Dette manuskriptet viser også hvordan denne metoden, alliert med allerede etablerte atferdstester, kvantitativt beskriver bevegelsesutfall etter ryggmargsskade.
Introduction
Den effektive koordineringen av fire lemmer er ikke unik for quadruped dyr. Forben-baklem-koordinasjon hos mennesker er fortsatt viktig for å utføre flere oppgaver, for eksempel svømming og hastighetsendringer mens du går1. Ulike lem kinematisk2 og motorprogram 1,3,4, samt proprioceptive tilbakemeldingskretser5, er konservert mellom mennesker og andre pattedyr og bør vurderes ved analyse av terapeutiske alternativer for motoriske lidelser, som ryggmargsskade (SCI) 6,7,8.
For å kunne gå, må flere spinalforbindelser fra forben og baklemmer være riktig kablet og rytmisk aktivert, noe som krever innganger fra hjernen og tilbakemelding fra det somatosensoriske systemet 2,9,10. Disse forbindelsene kulminerer i de sentrale mønstergeneratorene (CPG), som ligger på livmorhals- og lumbalnivå for forbenene og baklemmene, henholdsvis 1,9,10. Ofte, etter SCI, begrenser forstyrrelsen av nevronal tilkobling og dannelsen av et hemmende glialarr12 gjenopprettingen av lokomotorisk funksjon, med utfall som varierer fra total lammelse til begrenset funksjon av en gruppe lemmer avhengig av skadens alvorlighetsgrad. Verktøy for presis kvantifisering av bevegelsesfunksjon etter ryggmargsskade er avgjørende for å overvåke tilfriskning og evaluere effekten av behandlinger eller andre kliniske intervensjoner6.
Standard metrisk analyse for musekontusjonsmodeller av SCI er Basso-museskalaen (BMS) 13,14, en ikke-parametrisk poengsum som vurderer stammestabilitet, haleposisjon, plantartrapping og forben-bakben-koordinering i en åpen feltarena. Selv om BMS er ekstremt pålitelig i de fleste tilfeller, krever det minst to erfarne ratere å observere alle vinkler av dyrs bevegelse for å ta hensyn til naturlig variabilitet og redusere skjevhet.
Andre analyser er også utviklet for å vurdere motorens ytelse etter SCI kvantitativt. Disse inkluderer rotarod-testen, som måler tid brukt på en roterende sylinder15; den horisontale stigen, som måler antall tapte rekkverk og positiv stige griper16,17; og strålegangtesten, som måler tiden et dyr tar og antall feil det gjør når det krysser en smal bjelke18. Til tross for at de reflekterer en kombinasjon av motoriske underskudd, gir ingen av disse testene direkte lokomotorisk informasjon om koordinering mellom forben og baklem.
For å spesifikt og grundigere analysere gangadferd, har andre analyser blitt utviklet for å rekonstruere trinnsykluser og gangstrategier. Et eksempel er fotavtrykkstesten, der de blekkede potene til et dyr tegner et mønster over et ark med hvitt papir19. Selv om det er enkelt i utførelsen, er det tungvint og unøyaktig å trekke ut kinematiske parametere som skrittlengde. Videre begrenser mangelen på dynamiske parametere, for eksempel varigheten av trinnsyklusen eller koordinering av ben, dens applikasjoner; Faktisk kan disse dynamiske parametrene bare kjøpes ved å analysere ramme-for-ramme-videoer av gnagere som går gjennom en gjennomsiktig overflate. For SCI-studier har forskere analysert gangadferd fra en lateral visning ved hjelp av tredemølle, inkludert rekonstruksjon av trinnsyklusen og måling av vinkelvariasjonene i hvert benledd 4,20,21. Selv om denne tilnærmingen kan være ekstremt informativ6, forblir den fokusert på et bestemt sett med lemmer og mangler ekstra gangfunksjoner, for eksempel koordinering.
For å fylle disse hullene utviklet Hamers og kolleger en kvantitativ test basert på en optisk berøringssensor ved hjelp av frustrert total intern refleksjon (fTIR)22. I denne metoden forplanter lyset seg gjennom glass via intern refleksjon, blir spredt ved potepressing, og til slutt fanges det av et høyhastighetskamera. Mer nylig ble en åpen kildekode-versjon av denne metoden, kalt MouseWalker, gjort tilgjengelig, og denne tilnærmingen kombinerer en fTIR-gangvei med en sporings- og kvantifiseringsprogramvarepakke23. Ved hjelp av denne metoden kan brukeren trekke ut et stort sett med kvantitative parametere, inkludert trinn-, rom- og gangmønstre, fotavtrykksposisjonering og koordinering av forben-baklemmer, samt visuelle utganger, for eksempel fotavtrykkmønstre (etterligne blekkpoteanalysen6) eller holdningsfaser i forhold til kroppsaksen. Viktigere, på grunn av sin åpen kildekode-natur, kan nye parametere trekkes ut ved å oppdatere MATLAB-skriptpakken.
Her oppdateres den tidligere publiserte samlingen av MouseWalker23-systemet . Det gis en beskrivelse av hvordan du konfigurerer den, med alle trinnene som kreves for å oppnå best mulig videokvalitet, sporingsforhold og parameterinnhenting. Ytterligere postkvantifiseringsverktøy deles også for å forbedre analysen av MouseWalker (MW) utgangsdatasett. Til slutt demonstreres nytten av dette verktøyet ved å oppnå kvantifiserbare verdier for generell lokomotorisk ytelse, spesielt trinnsykluser og koordinering av forben-baklemmer, i en ryggmargsskade (SCI) kontekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for håndtering, kirurgi og postoperativ behandling ble godkjent av Instituto de Medicina Molecular Internal Committee (ORBEA) og den portugisiske dyreetikkkomiteen (DGAV) i samsvar med Det europeiske fellesskaps retningslinjer (direktiv 2010/63/EU) og den portugisiske loven om dyrepleie (DL 113/2013) under lisensen 0421/000/000/2022. Hunnmus C57Bl/6J i alderen 9 uker ble brukt i denne studien. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere antall dyr og for å redusere lidelsene til dyrene som ble brukt i studien. MATLAB-skriptet og den frittstående versjonen av MW-programvaren har åpen kildekode og er tilgjengelig på GitHub
depot (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mens MW-programvaren ble utviklet i MATLAB R2012b, har den blitt tilpasset for å kjøre i MATLAB R2022b. Figur 1 illustrerer analysearbeidsflyten til MW.
1. Sette opp MouseWalker-apparatet (MW)
- Monter MW-apparatet som beskrevet tidligere23, eller tilpass til de spesifikke behovene til eksperimentell design (se materialtabell og tilleggsfigur 1 for mer informasjon om oppsettet).
MERK: Vandrearenaen kan gjøres bredere for å imøtekomme større dyr, for eksempel rotter. -
Kontroller at pleksiglasset der dyrene går er rent og ripefritt. Bruk en glatt rengjøringsklut, og minimer bruken av organiske løsningsmidler som ammoniakk eller etanol i høye konsentrasjoner, noe som kan skade pleksiglasset (3% hydrogenperoksid, 7% etanol eller et hvilket som helst kompatibelt og passende desinfeksjonsmiddel for pleksiglass anbefales). Bytt om nødvendig pleksiglasset.
- Sett opp høyhastighetskameraet med et raskt objektiv og en stor blenderåpning (dvs. mindre F-stoppverdier) for å fange opp en stor mengde lys, da dette bidrar til å registrere fTIR-signalene (se materialfortegnelse).
MERK: Objektivet må ikke generere optiske forvrengninger, spesielt ikke i kantene av bildet. Optiske forvrengninger kan testes ved å registrere et kjent mønster (f.eks. striper eller firkanter) og deretter måle størrelsen på blokkene på ImageJ/FIJI24 (bruk linjeverktøyet, og klikk deretter på Analyser > mål). En firkant på 1 cm bør for eksempel ha samme bildepunktdimensjoner både midt i bildet og på kantene. Variasjoner bør være mindre enn 5%. - Lys opp den flerfargede LED-lysstripen fra bakgrunnslysboksen.
- Lys opp den hvite LED-lyslisten fra lysboksen på gangveien.
MERK: En farget LED kan også brukes25 for å lette skillet mellom fotavtrykk / kropp / bakgrunn. - Når lysene i rommet er av, må du kontrollere lysintensiteten til bakgrunnslysboksen og gangveien. Juster intensiteten, om nødvendig, ved hjelp av et potensiometer eller semi-ugjennomsiktig plast. Disse må optimaliseres slik at pikselintensiteten øker i følgende rekkefølge: dyrs kropp < bakgrunn < fotavtrykk.
- For å sjekke pikselintensiteten til dyrets kropp / bakgrunn / fotavtrykk, åpne bildesekvensen på ImageJ / FIJI24, og klikk på Analyser > mål. Fotavtrykksignalet bør ikke være overmettet, da dette vil forhindre at grensene for fotavtrykket blir definert (dvs. tær og fotputer) (tilleggsfigur 2).
- Juster bildekontrasten til gangveien på videoopptaksprogramvaren. Kontrasten kan justeres på to måter: ved å dimme eller øke belysningen på LED-stripen eller ved å justere kameralinsens blenderåpning.
- Plasser objektivet riktig slik at det er i samme høyde og i midten av det 45° reflekterende speilet og vinkelrett (90°) på gangveien. Dette vil generere et konstant proporsjonalt bilde langs gangveien mellom venstre og høyre.
MERK: Unngå å endre kameraposisjonen (avstand, høyde og retning) på tvers av flere opptaksøkter. Merk om nødvendig gulvet der stativet skal plasseres. Dette vil opprettholde bildefunksjonene. - Fokuser linsen på overflaten av pleksiglasset. Dette kan testes ved hjelp av et ikke-skadelig objekt som berører overflaten av pleksiglasset.
MERK: Med lavere F-stop-objektivverdier blir dybdeskarpheten mindre, og dermed blir fokuseringen vanskeligere. - Forsikre deg om at alle innstillingene forblir uendret under analysen, da de kan endre pikselintensiteten til de innspilte videoene.
2. Videooppkjøp
- Forsikre deg om at musene er kjent med rommet og apparatet før testing. Spar minst 1 dag til tilvenning (dag 0). For å unngå overdreven trening, utfør MW-testen på en annen dag enn de andre atferdstestene (helst dagen etter).
- I programvaren for videoopptak må du sørge for at minst 50 cm av gangveien er synlig.
- Juster opptaksinnstillingene for å avkorte gangveiområdet. Dette vil redusere videostørrelsen og optimalisere videooppkjøpet.
- Ta et bilde eller en kort video av en vanlig linjal før hver økt. Antall piksler per centimeter vil senere bli brukt i "innstillingsvinduet" for å kalibrere videoene.
- Start videoopptaket, og plasser dyret på kanten av gangveien ved å ta tak i bunnen av halen for å unngå skader. Sørg for at dyrene beveger seg fremover til den ekstreme kanten av plattformen. Utfør videoopptakene med minst 100 bilder / s for å sikre jevne gangoverganger.
- Om nødvendig, motiver dyrene til å bevege seg ved å trykke forsiktig på gangveiveggen eller knipse/klappe med fingrene. Unngå imidlertid fysisk nudging, da dette kan påvirke resultatene.
- Lagre videoene direkte som bildesekvenser i TIFF (med LZW-komprimering), JPEG eller PNG-format. Hvis kameraet tar opp som en rå MOV-fil, konverterer du videoene til bildesekvenser ved å åpne filen i ImageJ/FIJI24 og klikke på File > Save as > Image-sekvens (eller ved å bruke annen programvare, for eksempel LosslessCut25).
MERK: De fleste dyr begynner å gå umiddelbart etter å ha blitt satt i gangveien; Derfor anbefales det å starte videooppkjøpet før du plasserer dyret.
3. Klargjøre videoene for MW-sporingsprogramvaren
- Film nok komplette løp av hver enkelt mus. Antall dyr som skal filmes per tilstand og antall komplette løp må avgjøres i henhold til hvert eksperimentelt design. Et komplett løp er når musen går hele 50 cm av gangveien uten langvarige stopp (i dette eksperimentet ble tre komplette løp valgt).
MERK: Avhengig av programvaren for bildeanskaffelse, kan det hende at videoer må beskjæres til den minste avkastningen. Dette vil øke hastigheten på sporing og generering av utdata. - I ImageJ/FIJI24 velger du rammene musen er i på skjermen ved å klikke på Image > Stack > Tools > Make a substack. Sporingen på MW krever at hodet og halen er synlige i alle rammene. Det er imidlertid mulig å lage flere substacks fra et enkelt videoopptak, som senere vil representere hvert løp.
- Lagre hver delstakk separat i forskjellige mapper ved å klikke på Fil > Lagre som > bildesekvens. MW-programvaren oppretter senere en undermappe automatisk i hver katalog hver gang man begynner å analysere et løp.
4. Sporing
- Åpne MATLAB, legg til mappen som inneholder MW-skriptet i arbeidskatalogen, og kjør "MouseWalker.m" på hovedkommandolinjen.
MERK: Bruk av MW-programvaren under MATLAB gjør det mulig å vise sporingsfeilmeldinger på MATLABs hovedkonsoll og de ønskede utdatadataene som skal velges (ved å åpne hovedskriptfilen "MouseEvaluate.m" og endre utgangene til enten 1 eller 0: Excel-filen, fottrinnplott, holdningsspor og gangmønstre). - Last inn videomappen som "Input directory". Man kan også velge utdatamappen; Dette er imidlertid ikke et krav, da MW-programvaren oppretter en ny mappe kalt "Resultater" automatisk inne i "Input-katalogen".
- Bruk pilene "<<", "<", ">>" og ">" for å sjekke om alle videorammene er riktig lastet inn i MW-programvaren.
- Gå til "Innstillinger-vinduet" der alle kalibrerings- og terskelparametrene er plassert. Disse innstillingene kan endres avhengig av pikselintensiteten til bakgrunnen og fotavtrykkene, samt den minimale størrelsen på kroppen og fotavtrykkene, blant andre faktorer (se eksempel i tilleggsfigur 2). Test effekten av å endre noen parametere ved å klikke på Forhåndsvisning-knappen .
- Bruk de forskjellige plottstilene, inkludert "kropp + fot + hale", "bare kropp", "bare føtter" og "bare hale", for å diskriminere kroppsdeler etter justering av terskelparametrene.
- Dra nytte av verktøyene på høyre sidepanel for å ta målinger av lysstyrken eller størrelsen (ved hjelp av henholdsvis "lysstyrke" og "linjal" -knappene). Alle innstillinger kan lagres som "standard" så lenge kameraavstanden forblir den samme.
- Når du har justert terskelparametrene, må du kontrollere at videoen er klar for automatisk sporing. Gå til den første rammen, og klikk på Auto for å starte sporing. Dette trinnet kan følges i sanntid, og det tar noen minutter, avhengig av størrelsen på videoen og datamaskinens ytelse.
- Hvis den automatiske sporingen merker kroppsfunksjonene feil, må du avbryte automatisk sporing, angi nye innstillinger og starte prosessen på nytt.
- Etter at sporingen er fullført, sjekk om en manuell korreksjon er nødvendig. For å korrigere, bruk midtpanelet til å velge eller velge bort, og angi plasseringen av høyre forside (RF), høyre bakside (RH), venstre forside (LF) og venstre bakpotefotavtrykk, hode, nese, kropp (delt inn i to segmenter) og haleposisjoner (delt inn i fire segmenter). Lagre endringene ved å trykke på Lagre-knappen .
MERK: Alle knapper og de fleste kommandoer har en snarvei (se den tilhørende håndboken for detaljer23). For å lette videorulling og utførelse av hurtigtaster, kan en maskinvarekontroller med programmerbare knapper og et skyttelhjul som Contour ShuttlePro V2 brukes. - Klikk på Evaluer for å generere utdatafilene fra den sporede videoen. Avhengig av ønsket utgang som er valgt (se trinn 4.1), kan dette trinnet ta noen minutter.
- Kontroller at alle grafiske dataplott er lagret i mappen "Resultater". Bekreft nøyaktigheten av sporingen ved å undersøke noen av de grafiske utgangene, for eksempel "Stance-sporene", der man kan sjekke om alle poteposisjonene er konsistente.
- Hvis det oppdages en feil, må du korrigere sporingen manuelt (hvis mulig, ellers eliminere "Resultater" -mappen og utføre automatisk sporing igjen med nye innstillinger), og klikk på Evaluer-kommandoen igjen.
- Sjekk at alle kvantitative målinger generert av MW-programvaren er lagret på et Excel-regneark og oppsummert på "1. Info_Sheet". Kontroller at Excel-alternativene for formelskillelinjene samsvarer med skriptet. Desimalskilletegnet må være ",", og tusenskilletegnene må være ";".
- Bruk skriptet "MouseMultiEvaluate.m" for å samle målingene fra alle kjøringene i en ny fil for analyse.
- Til å begynne med genererer du en .txt-fil som inneholder mappebanene for alle videoene (f.eks.txt. Forsikre deg om at hver linje tilsvarer en enkelt video.
- Skriv deretter "MouseMultiEvaluate ('Videofiles.txt')" i kommandolinjen. En Excel-fil med navnet "ResultSummary.xls" vil bli generert i arbeidskatalogen (se et eksempel i GitHub-repositoriet).
MERK: Figur 2 representerer de grafiske utgangene oppnådd av MW-programvaren fra videoene til ett innspilt dyr.
5. Kinematisk dataanalyse arbeidsflyt
- Rediger Excel-arket som ble generert i trinn 4.10, som inneholder dataene for behandling ved hjelp av de medfølgende Python-skriptene, i henhold til følgende forutsetninger.
- I den første kolonneoverskriften angir du den eksperimentelle betingelsen. Gi navn til hver linje etter gruppe-/betingelsesnavnet (personer fra de samme gruppene må ha samme navn). Den første gruppen må være kontrollen eller grunnlinjen (dette er bare obligatorisk for heatmap-plotting, trinn 5.6).
- I den andre kolonnen angir du dyr-ID. Dette er obligatorisk, selv om denne informasjonen ikke vil bli brukt til tomtegenerering.
- I den tredje kolonnen og fremover velger du motorparametrene som skal brukes til analysen. Forsikre deg om at den første linjen er navnet på parameteren (disse navnene vises senere i plottene).
- Åpne Anaconda Navigator, og kjør Spyder for å åpne de medfølgende Python-skriptene.
MERK: Alle skriptene ble utviklet med Python 3.9.13, ble utført med Spyder 5.2.2 i Anaconda Navigator 2.1.4, og er tilgjengelige i materialfortegnelsen og GitHub-repositoriet (der tilleggsmateriale er inkludert, for eksempel et videoeksempel, en Excel-eksempelfil og et FAQs-dokument). Det er mulig å utføre skriptene utenfor Anaconda Navigator; Dette grafiske brukergrensesnittet er imidlertid mer brukervennlig. - Bruk "Rawdata_PlotGenerator.py" til å generere rådataplottene. Dette vil tillate visualisering av hver parameter som en funksjon av hastighet.
- Åpne "Rawdata_PlotGenerator.py" i Spyder, og kjør koden ved å klikke på Play-knappen .
- Velg Excel-filen som skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vinduet. Hvis arknavnet ikke ble endret, skriv "Ark1".
- Rådataplottene vises i plottkonsollen (øverst til høyre). For å lagre plottene, klikk på Lagre bilde eller Lagre alle bilder-knappen i plottkonsollen.
- Bruk skriptet "Residuals_DataAnalysis" for å beregne restene for dataanalyse. Dette skriptet vil generere en CSV-fil med beregningene av restene for alle motorparametrene.
MERK: Mange av de målte gangparametrene som trekkes ut av MW, varierer med hastigheten (f.eks. svinghastighet, skrittlengde, holdningsvarighet, holdningsretthet og gangindekser). Det anbefales derfor å utføre en best tilpasset regresjonsmodell av hver enkelt parameter kontra hastighet for basiseksperimentet og deretter bestemme restverdiene for hver eksperimentgruppe i forhold til denne regresjonsmodellen. Dataene uttrykkes da som forskjellen fra den gjenværende normaliserte linjen26.- Åpne "Residuals_DataAnalysis.py" i Spyder, og kjør koden ved å klikke på Play-knappen .
- Velg Excel-filen som skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vinduet. Hvis arknavnet ikke ble endret, skriv "Ark1".
- Lagre CSV-filen i samme mappe som dataene. Det er obligatorisk at kontrollen (eller grunnlinjen) er den første gruppen i Excel-filen.
- Bruk "PCA_PlotGenerator.py"-skriptet til å utføre en prinsipal komponentanalyse (PCA).
MERK: Denne uovervåkede dimensjonalitetsreduksjonsmetoden brukes til å generere en mer kortfattet representasjon 27,28,29 av dataene (figur 3A, B). PCA-skriptet inneholder følgende trinn. Dataene blir først forhåndsbehandlet ved sentrering og skalering, hvoretter PCA-algoritmen beregner kovariansmatrisen for å bestemme korrelasjonene mellom variablene og beregne egenvektorene og egenverdiene til kovariansmatrisen for å identifisere hovedkomponentene. De to første eller tre hovedkomponentene er valgt for representasjon av dataene i henholdsvis 2D- eller 3D-plott. Hver prikk i plottene tilsvarer et dyr og representerer en annen abstrakt variabel. Fargekodede prikker brukes til å skille de spesifikke gruppene. Som sådan reflekterer klynger av prikker lignende gangmønstre som deles av de tilsvarende individene.- Åpne "PCA_PlotGenerator.py" i Spyder, og kjør koden ved å klikke på Play-knappen .
- Velg Excel-filen som skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vinduet. Hvis arknavnet ikke ble endret, skriv "Ark1".
- Kontroller at PCA 2D- og 3D-plottene vises i tegnekonsollen (øverst til høyre). Hver farge representerer en annen gruppe, og forklaringen vises ved siden av tegnet. For å lagre plottet, klikk på Lagre bilde i plottkonsollen.
- Bruk "Heatmap_PlotGenerator.py" for å generere et varmekart. Sørg for at varmekartgeneratoren lager en tabell som viser de statistiske forskjellene mellom basisgruppen (eller kontrollgruppen) og de andre gruppene for hver motorparameter27 (figur 4). Hver kolonne viser en gruppe, og hver linje er relatert til en bestemt motorparameter.
MERK: Statistisk analyse ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller en Kruskal-Wallis ANOVA etterfulgt av Dunns post hoc-test (for ikke-normale fordelinger). Uteliggere ble ekskludert fra analysen. P-verdier representeres av en fargekode, med røde og blå sjatteringer som indikerer en økning eller reduksjon i forhold til henholdsvis kontroll (eller grunnlinje). Fargeskyggen representerer den statistiske signifikansen, med mørkere farger som viser høyere signifikans, og lysere farger som viser lavere signifikans. tilsvarer P < 0,001; ** tilsvarer P < 0,01; og * tilsvarer P < 0,05. Hvitt indikerer ingen variasjon.- Åpne "Heatmap_PlotGenerator.py" i Spyder, og kjør koden ved å klikke på Play-knappen .
- Velg Excel-filen som skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vinduet. Hvis arknavnet ikke ble endret, skriv "Ark1".
- Velg datatypen i det andre automatiske vinduet: rådata eller gjenværende data. Hvis et alternativ ikke er valgt, er gjenværende data standard.
- Varmekartet vises i plottkonsollen (øverst til høyre). For å lagre plottet, klikk på Lagre bilde i plottkonsollen.
Det er obligatorisk at kontrollen (eller grunnlinjen) er den første gruppen i Excel-filen.
- Bruk "Boxplots_PlotGenerator.py" for å generere boxplots. Dette verktøyet tillater generering av boksplott som representerer fordelingen av verdier for alle motorparametrene for hver gruppe (figur 5, figur 6 og figur 7).
MERK: Hver boks inneholder medianen som midtlinje, og de nedre og øvre kantene av boksene representerer henholdsvis 25% og 75% kvartiler. Værhårene representerer rekkevidden til det fullstendige datasettet, unntatt avvik. Uteliggere er definert som enhver verdi som er 1,5 ganger interkvartilområdet under eller over henholdsvis 25 % og 75 % kvartil.- Åpne "Boxplots_PlotGenerator.py" i Spyder, og kjør koden ved å klikke på Play-knappen .
- Velg Excel-filen som skal analyseres, og arknavnet i det automatiske vinduet. Hvis arknavnet ikke ble endret, skriv "Ark1".
- Velg datatypen i det andre automatiske vinduet: rådata eller gjenværende data. Hvis et alternativ ikke er valgt, er gjenværende data standard.
- Boksplottene vises i tegnekonsollen (øverst til høyre). For å lagre plottene, klikk på Lagre bilde eller Lagre alle bilder-knappen i plottkonsollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standard BMS-system beskriver brutto motoriske underskudd etter SCI14. På grunn av sin subjektive natur utføres andre kvantitative analyser vanligvis sammen med BMS for å produsere en mer detaljert og fin vurdering av bevegelse. Imidlertid klarer ikke disse testene å vise spesifikk informasjon om trinnsykluser, trinnmønstre og koordinering av forben-baklemmer, noe som er ekstremt viktig for å forstå hvordan ryggkretsen opprettholder funksjon og tilpasser seg en ufullstendig SCI. Denne delen viser hvordan MW-verktøykassen kan bidra til å overvåke gjenoppretting av bevegelsesfunksjon etter ryggmargsskade og legge til relevant informasjon om gangatferd.
Studieprøven ble delt inn i to grupper av kvinnelige C57Bl/6J-mus i alderen 9 uker gamle: en SCI-eksperimentell gruppe (n = 11), der dyrene gjennomgikk laminektomi etterfulgt av en moderat til alvorlig kontusjonsskade i nivå med T9/T10-virvelsøylen ved bruk av en Infinite Horizon Impactor (se materialfortegnelse); og en narreskadd kontrollgruppe (n = 10), der kun laminektomi ble utført på samme kolonnenivå (figur 1, trinn 1). Den lokomotoriske oppførselen til SCI og skamskadde dyr ble overvåket i 30 dager. MW-testen ble utført dagen før operasjonen (baseline) og 15 dager, 22 dager og 30 dager etter skaden (dpi) (figur 1, trinn 2). For sammenligningens skyld ble musene utsatt for BMS-testen parallelt før operasjonen og ved 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi og 30 dpi (tilleggsfigur 3). Etter å ha sporet alle videoene som ble oppnådd med MW, ble to typer utdatafiler generert: grafiske utganger, som viser visuelle representasjoner av flere parametere etter hver kjøring, og kinematiske utganger, som oppsummerer alle målbare motorparametere (figur 1, trinn 3 og trinn 4).
Ved hjelp av et sett med Python-skript (se Materialfortegnelse og lenken til GitHub-depotet) ble rådataplottene følgelig oppnådd (figur 1, trinn 5). Siden de fleste parametere påvirkes av dyrets hastighet, ble det utført en regresjonsmodell av baselinegruppen før skaden sammen med de målte restverdiene for hver tilstand (figur 1, trinn 6). For å kontrollere for kinematiske profiler og signifikante forskjeller mellom kontrollgruppen (sham) og eksperimentelle grupper (SCI), ble alle kinematiske parametere (totalt 79) utsatt for en treordens hovedkomponentanalyse (PCA), og et varmekart ble generert med en samling motorparametere som best beskrev datasettet (totalt 33) (figur 1, trinn 7a, b). Til slutt ble spesifikke motoriske parametere som ble påvirket etter ryggmargsskaden, sammenlignet med baseline før skaden (figur 1, trinn 7c).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av analysearbeidsflyten til MW. (1) Dyrene selekteres for laminektomi (narrekontrollgruppe) eller laminektomi etterfulgt av ryggmargsskade (eksperimentgruppe). (2) Dyrene blir deretter utsatt for en atferdsanalyse dagen før skaden og på dagene 15, 22 og 30 etter skaden. (3) MW genererer to typer utgangsdata: (a) grafiske visualiseringer av flere parametere, for eksempel holdningsspor, ganglag og trinnmønstre, og (b) et kinematisk sammendrag av alle målbare motorparametere. (4) Alle kontroll- og eksperimentelle data samles i en enkelt fil ved hjelp av "MouseMultiEvaluate.m" -skriptet på MATLAB. (5) "RawData_PlotGenerator" -skriptet for Python genererer en visuell representasjon av hvordan alle målbare motorparametere varierer i henhold til hastighet. Hvis parametrene ikke korrelerer med hastighet, kan man hoppe til (7); Men siden de fleste parametere etter SCI er sterkt avhengig av hastighet, bør en modell genereres (6) ved hjelp av "Residual_DataAnalysis" -skriptet for Python. Etter generering av restverdiene for hver motorparameter utføres dataanalyse (7): (a) en hovedkomponentanalyse (PCA) utføres ved hjelp av et utvalg parametere med et "PCA_PlotGenerator" -skript; (b) et varmekart er opprettet med et "Heatmap_PlotGenerator" -skript for å vise de statistisk signifikante forskjellene mellom forholdene for forskjellige parametere; og c) flere individuelle parametere som endres etter SCI, evalueres med "BoxPlot_PlotGenerator"-skriptet. Alle skript er tilgjengelige i Materialfortegnelse og GitHub-repositoriumkobling. Manusene vises i rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fra de grafiske utgangsdataene samlet fra MW, var det mulig å bekrefte den velkjente brå endringen i den visuelle visningen av fotsporene etter SCI. I analysen "Digital-ink" generert av MW ble det påvist manglende støtte for bakpotene (figur 2A), sammen med en reduksjon i fotavtrykksområdet for både venstre og høyre bakpote (figur 2B), som ble opprettholdt fra 15 dpi og utover (data ikke vist). I tillegg, innenfor hver trinnsyklus, beregner MW parametere relatert til holdningsfasen (dvs. tiden mellom potens touchdown og før løft) og svingfasen (dvs. tiden lemmen er av bakken). Som sådan kan MW generere visuelle "holdningsspor", som tar hensyn til posisjonen til kroppens senter og akse i forhold til hvert ben og deres fotavtrykksenter i holdningsfasene23. De samlede holdningssporene som ble oppnådd for hvert dyr, viste flere unike egenskaper (figur 2C). Disse dataene viste at etter SCI hadde bakpotene kortere holdningsspor og mer tilfeldig poteposisjonering ved både touchdown og lift-off fra 15 dpi og utover (figur 2C).
Figur 2: Representative grafiske utdata oppnådd av MW-programvaren fra sporingsvideoene. (A) "Digitalt blekk" utskrifter for ett SCI-dyr som viser hver pote med en annen farge: rød (høyre foran), gul (venstre foran), grønn (høyre bak) og blå (venstre bak) på flere tidspunkter. (B) Fotavtrykk for venstre forside (LF), venstre bakre (LH), høyre forside (RF) og høyre bakre (RH) til ett SCI-dyr ved 15 dpi. (C) "Holdningsspor" for ett SCI-dyr på flere tidspunkter. AEP og PEP for ett av bena er illustrert i det første panelet. "Footprint clustering" for både AEP og PEP tilsvarer standardavviket til de gjennomsnittlige AEP- eller PEP-koordinatene i hver video. Forkortelser: dpi = dager etter skade; cm = centimeter; px = piksel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter ble de kinematiske utgangene analysert etter å ha blitt beregnet av MW (figur 3 og figur 4). For å få en mer kortfattet avbildning av datasettet og teste om de kinematiske motorparametrene oppnådd fra MW var nok til å skildre lokomotoriske underskudd funnet i SCI-dyr over tid, ble en PCA27 utført. Det er verdt å merke seg at 40 % av variansen i dataene kunne forklares i den første komponenten (PC1: 40,1 %), som skilte gruppen av dyr som hadde en SCI fra resten, med en p-verdi lavere enn 0,001 basert på en enveis ANOVA-test (figur 3A,B) ved alle tidspunkter (15 dpi, 22 dpi og 30 dpi). Det var også et dårlig bidrag fra de andre komponentene (PC2: 11% og PC3:8.6%). Den tildelte vekten av hvert motorparameterbidrag for hver komponent er illustrert i tilleggsfigur 4. Videre var variansen i datasettet ikke nok til å gjenspeile forskjeller over tid (dvs. mellom 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi), som replikerer det tidligere beskrevne platået for lokomotorisk gjenoppretting14. Samlet sett indikerer disse resultatene at de kinematiske parametrene oppnådd fra MW sterkt beskriver motorunderskuddene observert etter SCI over alle tidspunkter.
Figur 3: Hovedkomponentanalyse av alle kinematiske motorparametere (79) oppnådd av MW-programvaren etter restdataanalysen. (A) En 3D-visualisering av trekomponent PCA-analysen. (B) En 2D-visualisering med sirkler som representerer 50% av innsamlede data. I PC1, som forklarte over 40 % av variansen, var SCI-gruppen ved 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi signifikant forskjellig fra simuleringsgruppen og baseline (før skade), med en p-verdi < 0,001, bestemt av en enveis ANOVA. Hver enkelt liten prikk eller trekant representerer gjennomsnittet av tre videoer for hvert dyr, mens de større prikkene eller trekantene representerer gjennomsnittspunktet (n = 10-11 per tilstand, n = 21 for basisgruppen). Bidraget til hver komponent er angitt i hver akse. Forkortelser: dpi = dager etter skade; SCI = ryggmargsskade; PC = hovedkomponent. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter ble en samling motorparametere valgt basert på hvor sterkt det beskrev datasettet (33 totalt), og et varmekart ble generert (figur 4). Faktisk viste de fleste lokomotoriske parametere en drastisk endring etter SCI på alle tidspunkter (15 dpi, 22 dpi og 30 dpi), mens de skadet kontrollene bare viste signifikante endringer ved 30 dpi. Disse endringene i sham-gruppen kan forklares med en generell reduksjon i svinghastighet, muligens på grunn av testtilvenning, som vil bli diskutert senere.
Det var merkbart at SCI-dyrene gikk langsommere enn de skamskadde kontrollene (data ikke vist). Uavhengig av hastighet, både ved 15 dpi og 30 dpi, viste SCI-dyrene imidlertid en høyere svingvarighet, lavere holdningsvarighet og en lavere arbeidsfaktorindeks, som relaterer seg til holdningsvarigheten/trinnperioden23. Disse resultatene indikerer at endringene i benposisjonering beskrevet ovenfor er karakteristiske for SCI, som sett i andre dyremodeller30,31,32, og er ikke relatert til endringer i tempo (figur 4).
Det bør også nevnes at venstre og høyre synkronisering ikke ble påvirket, da det ikke ble observert en signifikant endring i "fase" -indeksene for forben og baklemmer10,23 (figur 4), noe som indikerer intakt kobling mellom venstre og høyre lemmer.
Videre viste SCI-musene en lavere "stance straightness" -indeks (forskyvning / banelengde) i både forben og baklemmer (figur 4). Denne parameteren måler hvor lineære sporene er i forhold til den ideelle tilstanden, som ville være en rett linje (fra 0 til 1, noe som indikerer et lineært spor)27. Derfor indikerer disse resultatene en sterk manglende evne til å gå rett i denne gruppen.
For hver holdningsfase tegner MW en rekonstruksjon av kroppens svingninger, som starter ved pote touchdown - den fremre ekstreme posisjonen, eller AEP - og slutter før lift-off - den bakre ekstreme posisjonen, eller PEP (se eksemplet i figur 2C). "Footprint clustering" av både AEP og PEP måler standardavviket til de gjennomsnittlige AEP- eller PEP-koordinatene i hver video. SCI-dyrene viste en økning i bakpote-klynger for AEP ved alle tidspunkter, og en signifikant effekt ble bare observert for den narreskadde gruppen ved 15 dpi (figur 4). Dette illustrerer at SCI-dyrene ikke kunne plassere baklemmene riktig ved touchdown etter svingen. I tillegg ble det sett en reduksjon i "footprint clustering" for forepaw for PEP, sammen med en reduksjon i klynger av bakpoteavtrykk for PEP, ved 30 dpi (figur 4). Disse resultatene er i samsvar med det som observeres i de tegnede "holdningssporene" og antyder at forpotenes posisjon blir mer begrenset etter skade.
Til slutt, og i samsvar med endringene i poteposisjonen, var det endringer i gangstrategiene og "trykket" fremkalt av potene, målt ved gjennomsnittlig lysstyrke over området (figur 4), som vil bli nærmere diskutert.
Figur 4: Heatmap-plott som viser en samling av signifikant endrede lokomotoriske parametere som sammenligner SCI-dyr og humbugskadde dyr i forhold til dagen før operasjonen, som oppnådd av MW etter gjenværende dataanalyse. n = 10-11 per tilstand; Basisgruppen omfatter alle dyrene dagen før operasjonen, n = 21. Data uttrykkes av p-verdien etter statistisk analyse med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post hoc-test (for ikke-normale fordelinger). P-verdiene representeres av en fargekode, med røde og blå nyanser som indikerer henholdsvis en reduksjon eller økning i forhold til grunnlinjen. Fargeskyggen representerer den statistiske signifikansen, med mørkere farger som indikerer en høyere signifikans og lysere farger som indikerer en lavere signifikans; P < 0,001; **P < 0,01; * P < 0,05. Hvitt indikerer ingen variasjon. Forkortelser: dpi = dager etter skade; SCI = ryggmargsskade; s = sekund; ms = millisekund; gjennomsnittlig = gjennomsnittlig; F = foran; H = bak; AEP = fremre ekstrem posisjon; PEP = bakre ekstrem posisjon; LF = venstre forgrunn; LH = venstre bak; RF = høyre foran; RH = høyre bak. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter søkte vi å forstå hvilke individuelle parametere som ville være best for å beskrive de lokomotoriske underskuddene til SCI-dyr på forskjellige stadier av skaden (dvs. 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi). Vi startet med å undersøke stegsyklusparametrene som viste forskjeller mellom forben og baklem etter hvert som baklemmene gikk fra total lammelse til partiell funksjon (figur 5). Mens gjennomsnittlig svinghastighet økte signifikant for forbenene i forhold til baseline (før skade), endret ikke bakekstremitetens svinghastighet signifikant (selv om det var en tendens til at den var lavere enn baseline) (figur 5A,B). Parallelt sank den gjennomsnittlige skrittlengden på forbenene, uten signifikante endringer for baklemmene (figur 5C,D). Ikke overraskende viste de skadde musene redusert forbenets svingvarighet og en omvendt økning i varigheten av bakbensvingningene ved 15 dpi og utover (figur 5E,F). Samlet sett indikerer disse resultatene at forbenene vedtok en raskere rytme, med to forbenssykluser for hver baklemsyklus. Dette syklusforholdet på 2:1 har blitt beskrevet tidligere etter SCI-hemiseksjon hos rotter1,33 og illustrerer et viktig aspekt ved defekt koordinasjon av forben-baklemmer, som ikke gjenfinnes etter 30 dpi hos mus.
Figur 5: Trinnsyklusparametere for forlabbene og bakpotene ved flere tidspunkter 1 dag før skaden og ved 15 dpi, 22 dpi og 30 dpi hos ryggmargsskadede dyr (n = 11). (A,B) Den gjennomsnittlige svinghastigheten til forpotene og bakpotene i forhold til grunnlinjen. (C,D) Den gjennomsnittlige trinnlengden på forpotene og bakpotene i forhold til grunnlinjen. (E,F) Den gjennomsnittlige svingvarigheten for forpotene og bakpotene i forhold til grunnlinjen. I boksplottene er medianen representert av midtlinjen, og de nedre og øvre kantene av boksene representerer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Værhårene representerer rekkevidden til hele datasettet. Outliers er representert av enkle prikker. Statistisk analyse ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post hoc-test (for ikke-normale fordelinger). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dager etter skade; SCI = ryggmargsskade; cm = centimeter; s = andre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MW-programvaren er også i stand til å beregne trinnmønstrene til mus ved å måle brøkdelen av rammer tildelt en bestemt benkombinasjon, og dette fungerer som en proxy for tilstedeværelsen av spesifikke gangstrategier. Ved lavere hastigheter har uskadde mus en tendens til å vedta en "gangart", der de fleste rammer har en ettbenssving (uavhengig av poteposisjonen). Ved mellomhastigheter, mest vanlige på rullebanen, skifter mus til en travgang, der den mest representative konfigurasjonen er diagonalbensvingen. Til slutt, ved høyere hastigheter, bruker mus en "galoppgang", med tre ben som svinger samtidig23,34. Andre mindre vanlige konfigurasjoner inkluderer pacing gangart, hovedsakelig representert av lateral-leg swing (enten både venstre eller høyre ben), og "bundet / hopping gangart", med enten både baklemmer eller forben svingende samtidig10. Imidlertid bør man huske på at i sammenheng med en SCI, kan noen av disse konfigurasjonene, for eksempel trebenssvingen, gjenspeile defekt bakbenpoteposisjonering og dermed ikke samsvarer nøyaktig med en bestemt gangstrategi - i dette tilfellet galoppen. Derfor ble analysen forenklet ved å sammenligne benkonfigurasjonene alene.
Etter å ha utført restanalysen ble det lagt merke til at det var en nedgang i forekomsten av diagonale svingninger ledsaget av en reduksjon i enkeltsvingninger på alle tidspunkter (figur 6A,B). Mer interessant var det en økning i forekomsten av laterale svingninger (figur 6C). Den tempolignende gangen er ikke typisk for en vanlig C57BL/6J-mus; Det er imidlertid allerede rapportert å forekomme etter ryggmargsinfeksjon hos rotter1. Dette fasemønsteret var ikke prevalent nok til å endre faseindeks for forben eller baklem (som vist i figur 3), men illustrerer defekt ryggtilbakemelding fra baklemmer til forben. I tillegg var det en naturlig økning i forekomsten av forbens-/bakbenssvingninger (figur 6D), muligens på grunn av feil plantartråkk i bakbenet og en økning i trebenssvingninger (figur 6E).
Figur 6: Gjennomsnittsindeksene for ulike trinnvise svingkonfigurasjoner . (A) Diagonal, (B) singel, (C) lateral, (D) for/bak, og (E) trebenssving på flere tidspunkter hos SCI-dyr (n = 11) er vist. I boksplottene er medianen representert av midtlinjen, og de nedre og øvre kantene av boksene representerer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Værhårene representerer rekkevidden til hele datasettet. Outliers er representert av enkle prikker. Statistisk analyse ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post hoc-test (for ikke-normale fordelinger). **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dager etter skade; SCI = ryggmargsskade; NA = ikke aktuelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Til slutt, en annen avlesning som kan trekkes ut fra MW er "trykk" som et mål på lysstyrke / område. Med høyere hastigheter reduseres kontaktområdet med bakken, og trykket øker, så en lineær regresjon av basisdataene ble utført, og restverdiene for hver tilstand ble målt. Det ble lagt merke til at trykket på forpotene økte betydelig over alle tidspunkter, men styrken av denne effekten hadde en tendens til å avta over tid, da endringen for venstre forpote allerede mistet statistisk signifikans ved 30 dpi (figur 7A, C). Denne spesifikke effekten på venstre side kunne forklares av en lateralisert skade, som fortrinnsvis kunne ha påvirket høyre side av ryggmargen i denne studien. Likevel ble trykket som ble utøvd av bakpotene redusert hos skadede mus, som forventet, over alle tidspunkter, uten tendens til økning (figur 7B,D).
Figur 7: Trykk fremkalt av bak- og forpotene ved flere tidspunkter hos ryggmargsskadede dyr (n = 11). Trykk fremkalt av (A) venstre forpote, (B) venstre bakpote, (C) høyre forpote og (D) høyre bakpote, vist som relative forskjeller til baseline (dagen før skaden). I boksplottene er medianen representert som midtlinjen, og de nedre og øvre kantene av boksene representerer henholdsvis 25% og 75% kvartiler; Værhårene representerer rekkevidden til hele datasettet. Outliers er representert av enkle prikker. Statistisk analyse ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test (for normalfordelinger) eller Dunns post hoc-test (for ikke-normale fordelinger). **P < 0,01; P < 0,001. Forkortelser: dpi = dager etter skade; SCI = ryggmargsskade; cm = centimeter; px = piksel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Samlet illustrerer denne studien kraften i MW-systemet for kvantitativt å beskrive motoriske svekkelser forårsaket av SCI som noen ganger kan ignoreres på grunn av andre testbegrensninger. Videre understreker det den utvilsomt begrensede funksjonelle gjenopprettingen over tid i kontusjonsmusemodellen til SCI.
Tilleggsfigur 1: MW-maskinvarekomponentene. (A) Dette oppsettet er delt som følger: I - fTIR gangvei; II - fTIR støttebase og innlegg; III - gangvei vegg; IV - 45° speil; og V - bakgrunnsbelysning. (B) Nærbilder av Base-U-kanalen og gangveien sidelinjen. (C) Utforming av gangveiveggen. (D) Nærbilde av 45° speiloppsettet. Forkortelse: cm = centimeter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Ett enkelt bilde i en fTIR-video der pikselintensiteten og regionområdene er angitt. Pikselintensitetene for brødteksten, bakgrunnen og fotavtrykkene som ble brukt til videoanalysen i denne studien, presenteres mellom parenteser og er angitt i rødt, alt optimalisert for bildeklarhet. Lysintensiteten bør justeres for å oppnå riktig diskriminering mellom de forskjellige regionene. Relative områder av kroppen og fotavtrykk er indikert med stiplede gule linjer. Både områdene og pikselintensiteten ble samlet inn i ImageJ/FIJI. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: (A) BMS totalskår og (B) subscore av musene analysert i denne studien (n = 10-11). Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse ble utført med toveis gjentatte målinger ANOVA etterfulgt av Bonferronis post hoc-test; P < 0,001. Forkortelse: BMS = Basso museskala. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: Den tildelte vekten av hvert motorparameterbidrag for hver komponent. Den tildelte vekten til hver motorparameter (79 totalt) etter restanalysen for (A) PC1, (B) PC2 og (C) PC3 i PCA. Grenselinjen ble trukket ved 0,04 ms og -0,04. Forkortelser: ms = millisekund; gjennomsnittlig = gjennomsnittlig; SD = standardavvik; F = foran; H = bak; AEP = fremre ekstrem posisjon; PEP = bakre ekstrem posisjon; LF = venstre forgrunn; LH = venstre bak; RF = høyre foran; RH = høyre bak; Trykk = trykk. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstreres potensialet til MouseWalker-metoden ved å analysere lokomotorisk oppførsel etter SCI. Det gir ny innsikt i spesifikke endringer i stepping, fotavtrykk og gangmønstre som ellers ville bli savnet av andre standardtester. I tillegg til å gi en oppdatert versjon av MW-pakken, beskrives også dataanalyseverktøy ved hjelp av de medfølgende Python-skriptene (se trinn 5).
Siden MW genererer et stort datasett og en samling kinematiske parametere som reflekterer en høydimensjonal lokomotorisk prosess, ble en PCA anvendt; PCA har faktisk blitt mye brukt i andre kinematiske datasett som ligner på dette 27,35,36 (figur 3). Denne dimensjonalitetsreduksjonsteknikken er en enkel og robust metode med minimale forutsetninger som gjør det mulig å kvantitativt identifisere kinematiske profiler og raskt skille dem fra kontroll- eller grunnlinjeforhold. I tillegg ble varmekart generert for raskt å identifisere parametrene som var statistisk forskjellige fra baseline (figur 4), som senere kunne analyseres individuelt (figur 5, figur 6 og figur 7).
Deretter ble det vist hvordan spesifikke parametere som kan ekstraheres fra MW illustrerer de robuste lokomotoriske underskuddene sett i SCI-dyr, for eksempel koordinering. Koordinering er evnen til å bruke hver lem på en organisert måte for å utføre en oppgave. Ofte måles koordinasjonen indirekte ved antall feil/positive hendelser på en stige 16,17 eller tiden brukt på rotarod15. Tydelig beregner MW både variasjonen i poteposisjonering under trinnsyklusen (fotavtrykksmønster) og "holdningsretthet" -indeksen27. Det ble vist at begge parametrene var signifikant påvirket av skaden (figur 4).
Videre tillater MW brukeren å trekke ut parametere relatert til tidsdynamikk. En signifikant forstyrrelse av sving-/holdningsvarigheten hos ryggmargsdyr ble sett (figur 4), og man fant at SCI-musene kompenserte for tap av støtte på baklemmene ved å akselerere forbenets stegsyklus, og dermed redusere forbenets steglengde og gjennomsnittlig svingtid (figur 5). Denne effekten kan forholde seg til skiftet i tyngdepunktet, noe som tvinger forpotene til å tåle mer kroppsvekt1. På samme måte kan det tilskrives tapet av de lange stigende propriospinale banene, som er ansvarlige for den synergetiske interaksjonen mellom forbenet og bakbenet CPG 1,9,32, som til slutt fører til forben-baklem rytmedissosiasjon.
Egenskapene til trinngang kan illustrere den modulære organiseringen av lokomotoriske nettverk 1,34. Selv om skrittmønstre ikke er en direkte proxy for gangstrategiene som ble valgt i dette tilfellet23, kan det likevel trekkes noen viktige observasjoner. Viktige endringer ble sett i trinnmønstrene til SCI-mus (figur 6). De skadde dyrene begynte å adoptere laterale svinger (pacing-lignende gangarter), og det var også en nedgang i diagonale svingninger. Disse tilpasningene ser ut til å være forbundet med et forsøk på å koordinere forbenene og baklemmene, som igjen demonstrerer dissosiasjonen mellom ryggsporene under og over skaden, som ikke gjenoppretter 1,9,32.
Den begrensede restitusjonen etter ryggmargsskade ble også verifisert ved redusert muskelkraft i bakekstremitetene, målt ved gjennomsnittstrykket (figur 7). Følgelig er forbenene tvunget til å støtte mer kroppsvekt, noe som øker trykket. Mens mange parametere relatert til muskeldynamikk ikke ble analysert her (dvs. flexor og extensor muskelkoordinasjon 7,21), kan denne kvantitative målingen gi en direkte avlesning av mengden lemstøtte.
Denne MW-analysen kan også kombineres med standard BMS-test, som måler rotasjon av lemmer, poteplassering, haleposisjon og trinnfeil. Generelt oppnår SCI-mus en maksimal score på 4-5, med en maksimal subscore på 3, noe som betyr at de kan utføre sporadiske til hyppige trinn, men for det meste rotere ved poteløft og/eller touchdown14 (tilleggsfigur 2). Det blir klart hvorfor AEP-verdiene for bakpotene ble signifikant endret i SCI-gruppen, da den ikke-parallelle plasseringen av lemmer i svingfasen kan påvirke potekoordinatene. I tillegg, i BMS, er bagasjerommet vanligvis klassifisert som alvorlig på grunn av tilstedeværelsen av forekomster eller hendelser som forhindrer stepping, for eksempel rumpe ned og hopping14. Selv om det ikke var mulig å kvantifisere rumpe-ned-atferd eller tilfeller som forhindret tråkking, ble det påvist begrenset bakpote-tråkk i MW, med høyere svingvarighet (figur 5F), økt trebensving (figur 6E) og lavere trykk (figur 7B-D). I tillegg ble det observert en signifikant økning i for-/baksvingninger (figur 6D). Det kan være to komplementære forklaringer på denne atferdsmessige manifestasjonen. Først ble den hoppelignende gangen målt, noe som allerede kunne observeres i BMS-testen. Imidlertid kan denne oppførselen også være relatert til mangel på riktig plantartrinn i begge baklemmer, noe som resulterer i fotdrag eller dorsalplassering. Samlet sett støtter disse observasjonene påstanden om at stammestabiliteten er alvorlig skadet etter SCI. Til slutt er et av kravene for å score høyere enn 5 i BMS-testen koordinering14, og for dette må minst tre tilgjengelige passeringer overholdes av raterne under testen. Av disse må to av de tre eller flere tilgjengelige passene klassifiseres som koordinerte (dvs. forben og bakben vekslende). Fra MW-dataene kan man trekke ut objektive målinger, holdningsretthetsindeksen og klynger av fotavtrykk, som direkte kvantifiserer koordinering uavhengig av dyrs hastighet eller tilgjengelige pass (figur 4). I tillegg kan vekslingen mellom lemmer kvantifiseres objektivt ved å måle trinnstrategiene (figur 6). Disse parametrene illustrerer tydelig at SCI-mus konsekvent ikke kan gå i rette linjer og plassere baklemmene.
Mens MW-verktøykassen er en nyttig strategi for å studere lokomotoriske defekter etter SCI, bør man vurdere noen av begrensningene. For det første er det viktig å være konsistent med oppkjøpsparametrene (dvs. kameraposisjon, fokus, lysintensitet) slik at bildefunksjonene mellom tidspunktene opprettholdes. For det andre ble det lagt merke til at repetisjon førte til tilvenning, noe som igjen førte til redusert hastighet. Dette bidro også til økt oppdretts- / grooming-atferd og stopp midt i løpet. For skadde dyr var det også en tendens til å lene seg på gangveiveggene og et økt antall stopp midt i løpet. Siden disse atferdene ikke er en del av den lokomotoriske vurderingen, må de ikke vurderes. Fortrinnsvis bør forskerne velge videoer der dyrene går kontinuerlig med hodet pekende rett. For å motvirke påvirkning av disse atferdene på resultatene av denne studien, ble mus registrert kontinuerlig i minst fire eller fem løp og fikk lov til å løpe i begge retninger langs gangveien. Etterpå ble de tre beste registrerte løpene valgt ut og justert til samme retning på ImageJ/FIJI24 (180° rotasjon). Dermed var hvert dyr representert med et gjennomsnitt på tre løp samlet sammen per tidspunkt. Et større antall dyr per tilstand kan også redusere den forventede variabiliteten. Videre skal det bemerkes at denne lokomotoriske testen kun anbefales etter at plantartrapping er oppnådd, da sporingssystemet ble designet for finjustert lokomotorisk vurdering. I denne studien ble det bemerket at før 15 dpi var MW-testen ikke fordelaktig for lokomotorisk vurdering på grunn av økte fotdrag og feil plantarplassering, noe som kunne påvirke sporingen (data ikke vist). Til slutt er noen parametere (for eksempel klynger av fotavtrykk) svært følsomme for ekstrapoleringene gjort av regresjonsmodellen som genereres. Derfor ble koden justert tilsvarende (se dokumentasjonen i skriptet i GitHub-lenken).
Samlet sett ble det vist at MW sterkt kunne diskriminere SCI-dyr fra falske skadede kontroller, og MW kunne også samarbeide med etablerte tester som en verdifull metode for å studere lokomotoriske defekter etter SCI. Videre ble det vist at kvantitative utganger enkelt kunne genereres fra MW-datasettet ved hjelp av de medfølgende Python-skriptene. Disse verktøyene gir en effektiv eksperimentell rørledning for å generere et rikt og mangfoldig sett med kvantitative og grafiske utganger som utfyller de opprinnelige MW-utdatafilene og kan endres for å oppfylle forskerens mål når det gjelder type analyse og grafisk representasjon.
Denne verktøykassen er en verdifull metode for å studere andre motorrelaterte sykdommer eller motoriske dysfunksjoner, ikke bare de som er relatert til ryggmargsskade. Skarlatou et al.10 har allerede vist at en spesifikk mutasjon i Afadin, et viktig stillasprotein under utvikling, forårsaket en avvikende fenotype i ryggmargen ved å generere to sentrale kanaler. Denne defekten resulterte i tap av høyre-venstre lemmerveksling og en høyere forekomst av lemsynkronisering, typisk for en hoppende gangart. Stauch et al.10 illustrerte også at denne typen systemer kan tilpasses brukerens behov. I dette tilfellet ble det brukt til å studere spesifikke atferdsunderskudd i en rotte Parkinsons sykdomsmodell. Dermed har denne verktøykassen et bredt spekter av applikasjoner i forskjellige modeller der motorforstyrrelser forventes og kan kombineres med allerede etablerte atferdsprotokoller i feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Laura Tucker og Natasa Loncarevic for deres kommentarer til manuskriptet og støtten gitt av Rodent Facility ved Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Forfatterne ønsker å anerkjenne økonomisk støtte fra Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) til LS og CSM Dette arbeidet ble støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 og UIDP/04462/2020), og LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) til C.S.M. L.S. ble støttet av en CEEC Individual Principal Investigator-kontrakt (2021.02253.CEECIND). AFI ble støttet av et doktorgradsstipend fra FCT (2020.08168.BD). A.M.M. ble støttet av en doktorgradsstipendiat fra FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. ble støttet av et postdoktorstipend fra FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. ble støttet av en doktorgradsstipendiat fra FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
