Summary
En experimentell pipeline för att kvantitativt beskriva det rörelsetiska mönstret hos fritt gående möss med hjälp av verktygslådan MouseWalker (MW) tillhandahålls, allt från initiala videoinspelningar och spårning till postkvantifieringsanalys. En ryggmärgskontusionsskademodell hos möss används för att demonstrera användbarheten av MW-systemet.
Abstract
Genomförandet av komplexa och högt samordnade motorprogram, såsom promenader och löpning, är beroende av rytmisk aktivering av ryggrads- och supraspinalkretsar. Efter en ryggmärgsskada i bröstkorgen försämras kommunikationen med uppströmskretsar. Detta leder i sin tur till en förlust av samordning, med begränsad återhämtningspotential. För att bättre utvärdera graden av återhämtning efter administrering av läkemedel eller terapier finns det därför en nödvändighet av nya, mer detaljerade och exakta verktyg för att kvantifiera gång, lemkoordination och andra fina aspekter av rörelsebeteende i djurmodeller av ryggmärgsskada. Flera analyser har utvecklats under åren för att kvantitativt bedöma fritt gångbeteende hos gnagare; De saknar dock vanligtvis direkta mätningar relaterade till steggångstrategier, fotavtrycksmönster och samordning. För att åtgärda dessa brister tillhandahålls en uppdaterad version av MouseWalker, som kombinerar en frustrerad total intern reflektion (fTIR) gångväg med spårnings- och kvantifieringsprogramvara. Detta system med öppen källkod har anpassats för att extrahera flera grafiska utgångar och kinematiska parametrar, och en uppsättning efterkvantifieringsverktyg kan vara att analysera de utdata som tillhandahålls. Detta manuskript visar också hur denna metod, allierad med redan etablerade beteendetester, kvantitativt beskriver rörelsestörningar efter ryggmärgsskada.
Introduction
Den effektiva samordningen av fyra lemmar är inte unik för fyrbenta djur. Koordination mellan framben och bakben hos människor är fortfarande viktigt för att utföra flera uppgifter, såsom simning och hastighetsförändringar när man går1. Olika extremitetskinematiska2 och motoriska program 1,3,4, liksom proprioceptiva återkopplingskretsar5, bevaras mellan människor och andra däggdjur och bör beaktas vid analys av terapeutiska alternativ för motoriska störningar, såsom ryggmärgsskada (SCI) 6,7,8.
För att kunna gå måste flera ryggradsanslutningar från frambenen och bakbenen vara ordentligt kopplade och rytmiskt aktiverade, vilket kräver inmatningar från hjärnan och återkoppling från det somatosensoriska systemet 2,9,10. Dessa anslutningar kulminerar i de centrala mönstergeneratorerna (CPG), som är belägna på livmoderhals- och ländryggsnivå för frambenen respektivebakbenen 1,9,10. Ofta, efter SCI, begränsar störningen av neuronal anslutning och bildandet av ett hämmande glialärr12 återhämtningen av rörelsefunktionen, med resultat som varierar från total förlamning till begränsad funktion av en grupp lemmar beroende på skadans svårighetsgrad. Verktyg för att exakt kvantifiera rörelsefunktionen efter SCI är avgörande för att övervaka återhämtning och utvärdera effekterna av behandlingar eller andra kliniska ingrepp6.
Den metriska standardanalysen för muskontusionsmodeller av SCI är Basso-musskalan (BMS)13,14, en icke-parametrisk poäng som tar hänsyn till bålstabilitet, svansposition, plantarsteg och koordination mellan framben och bakben i en öppen fältarena. Även om BMS är extremt tillförlitligt i de flesta fall krävs det minst två erfarna bedömare för att observera alla vinklar av djurrörelser för att ta hänsyn till naturlig variation och minska bias.
Andra analyser har också utvecklats för att kvantitativt bedöma motorisk prestanda efter SCI. Dessa inkluderar rotarodtestet, som mäter tiden som spenderas på en roterande cylinder15; Den horisontella stegen, som mäter antalet missade räcken och positiva steggrepp16,17; och strålgångstestet, som mäter den tid ett djur tar och antalet fel det gör när man korsar en smal stråle18. Trots att de återspeglar en kombination av motoriska underskott ger inget av dessa tester direkt lokomotorisk information om koordinationen mellan framben och bakben.
För att specifikt och mer grundligt analysera gångbeteende har andra analyser utvecklats för att rekonstruera stegcykler och gångstrategier. Ett exempel är fotavtryckstestet, där ett djurs färgade tassar ritar ett mönster över ett vitt papper19. Även om det är enkelt att utföra är det besvärligt och felaktigt att extrahera kinematiska parametrar som steglängd. Dessutom begränsar avsaknaden av dynamiska parametrar, såsom varaktigheten av stegcykeln eller bentidskoordinationen, dess tillämpningar. Faktum är att dessa dynamiska parametrar endast kan förvärvas genom att analysera ram-för-ram-videor av gnagare som går genom en transparent yta. För SCI-studier har forskare analyserat gångbeteende från en sidovy med hjälp av ett löpband, inklusive rekonstruktion av stegcykeln och mätning av vinkelvariationerna i varje benled 4,20,21. Även om detta tillvägagångssätt kan vara extremt informativt6, förblir det fokuserat på en specifik uppsättning lemmar och saknar ytterligare gångfunktioner, såsom samordning.
För att fylla dessa luckor utvecklade Hamers och kollegor ett kvantitativt test baserat på en optisk beröringssensor med hjälp av frustrerad total intern reflektion (fTIR)22. I denna metod sprids ljus genom glas via intern reflektion, sprids vid tasspressning och fångas slutligen av en höghastighetskamera. På senare tid har en öppen källkodsversion av denna metod, kallad MouseWalker, gjorts tillgänglig, och detta tillvägagångssätt kombinerar en fTIR-gångväg med ett programvarupaket för spårning och kvantifiering23. Med hjälp av denna metod kan användaren extrahera en stor uppsättning kvantitativa parametrar, inklusive steg-, rums- och gångmönster, fotavtryckspositionering och koordination mellan framben och bakben, samt visuella utdata, såsom fotavtrycksmönster (efterliknar den färgade tassanalysen6) eller hållningsfaser i förhållande till kroppsaxeln. Viktigt, på grund av dess öppen källkod, kan nya parametrar extraheras genom att uppdatera MATLAB-skriptpaketet.
Här uppdateras den tidigare publicerade sammansättningen av MouseWalker23-systemet . En beskrivning av hur du ställer in den tillhandahålls, med alla steg som krävs för att uppnå bästa videokvalitet, spårningsförhållanden och parameterförvärv. Ytterligare postkvantifieringsverktyg delas också för att förbättra analysen av MouseWalker (MW) utdatadataset. Slutligen demonstreras användbarheten av detta verktyg genom att erhålla kvantifierbara värden för allmän rörelseförmåga, särskilt stegcykler och samordning mellan framben och bakben, i ett ryggmärgsskada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla hanterings-, kirurgiska och postoperativa vårdprocedurer godkändes av Instituto de Medicina Molecular Internal Committee (ORBEA) och den portugisiska djuretiska kommittén (DGAV) i enlighet med Europeiska gemenskapens riktlinjer (direktiv 2010/63/EU) och den portugisiska lagen om djurvård (DL 113/2013) under licensen 0421/000/000/2022. Kvinnliga C57Bl/6J-möss i åldern 9 veckor användes för den aktuella studien. Alla ansträngningar gjordes för att minimera antalet djur och för att minska lidandet hos de djur som användes i studien. MATLAB-skriptet och den fristående versionen av MW-programvaran har öppen källkod och finns på GitHub
databas (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Medan MW-programvaran utvecklades i MATLAB R2012b har den anpassats för att köras i MATLAB R2022b. Figur 1 illustrerar analysarbetsflödet för MW.
1. Ställa in MouseWalker-apparaten (MW)
- Montera MW-apparaten enligt beskrivningen tidigare23, eller anpassa till de specifika behoven hos den experimentella designen (se materialtabell och kompletterande figur 1 för mer information om installationen).
OBS: Promenadarenan kan göras bredare för att rymma större djur, till exempel råttor. -
Kontrollera att plexiglaset där djuren går är rent och repfritt. Använd en slät rengöringsduk och minimera användningen av organiska lösningsmedel som ammoniak eller etanol i höga koncentrationer, vilket kan skada plexiglaset (3% väteperoxid, 7% etanol eller något kompatibelt och lämpligt desinfektionsmedel för plexiglas rekommenderas). Byt vid behov ut plexiglaset.
- Ställ in höghastighetskameran med ett snabbt objektiv och en stor bländare (dvs. mindre F-stoppvärden) för att fånga en stor mängd ljus, eftersom detta hjälper till att spela in fTIR-signalerna (se materialtabell).
OBS: Objektivet ska inte generera optiska förvrängningar, särskilt inte vid bildens kanter. Optiska förvrängningar kan testas genom att registrera ett känt mönster (t.ex. ränder eller rutor) och sedan mäta storleken på blocken på ImageJ / FIJI24 (använd linjeverktyget och klicka sedan på Analysera > Mät). Till exempel bör en kvadrat på 1 cm ha samma pixeldimensioner både i mitten av bilden och på kanterna. Variationerna bör vara mindre än 5%. - Tänd den mångfärgade LED-ljusremsan från bakgrundsljuslådan.
- Tänd den vita LED-ljusremsan från gångbanans ljuslåda.
OBS: En färgad LED kan också användas25 för att underlätta skillnaden mellan fotavtryck / kropp / bakgrund. - När rumsbelysningen är släckt, kontrollera ljusintensiteten hos bakgrundsljuslådan och gångvägen. Justera intensiteten, om nödvändigt, med en potentiometer eller halvogenomskinlig plast. Dessa måste optimeras så att pixelintensiteten ökar i följande ordning: djurets kropp < bakgrund < fotavtryck.
- För att kontrollera pixelintensiteten hos djurets kropp / bakgrund / fotavtryck, öppna bildsekvensen på ImageJ / FIJI24 och klicka på Analysera > Mät. Fotavtryckssignalen bör inte vara övermättad, eftersom detta förhindrar att gränserna för fotavtrycket definieras (dvs. tår och fotkuddar) (kompletterande figur 2).
- Justera bildkontrasten på gångvägen på videoinspelningsprogrammet. Kontrasten kan justeras på två sätt: genom att dimma eller öka belysningen på LED-remsan eller genom att justera kamerans linsbländare.
- Placera linsen korrekt så att den är i samma höjd och i mitten av den 45° reflekterande spegeln och vinkelrät (90°) mot gångbanan. Detta kommer att generera en ständigt proportionell bild längs vänster-höger gångväg.
Undvik att ändra kamerans position (avstånd, höjd och orientering) under flera inspelningssessioner. Markera vid behov golvet där stativet ska placeras. Detta kommer att behålla bildfunktionerna. - Fokusera linsen på plexiglasets yta. Detta kan testas med ett icke-skadligt föremål som berör plexiglasets yta.
OBS: Med lägre F-stoppsobjektivvärden blir skärpedjupet mindre, vilket gör fokuseringen svårare. - Se till att alla inställningar förblir oförändrade under analysen, eftersom de kan ändra pixelintensiteten för de inspelade videorna.
2. Videoupptagning
- Se till att mössen är bekanta med rummet och apparaten före testning. Spara minst 1 dag för tillvänjning (dag 0). För att undvika överdriven träning, utför MW-testet på en annan dag än de andra beteendetesterna (helst dagen efter).
- I videoinspelningsprogrammet, se till att minst 50 cm av gångvägen är synlig.
- Justera inspelningsinställningarna för att trunkera gångvägsregionen. Detta minskar videostorleken och optimerar videoförvärvet.
- Ta en bild eller en kort video av en vanlig linjal före varje session. Antalet pixlar per centimeter kommer senare att användas i "inställningsfönstret" för att kalibrera videorna.
- Starta videoförvärvet och placera djuret på kanten av gångvägen genom att ta tag i svansens botten för att undvika skador. Se till att djuren rör sig framåt till plattformens yttersta kant. Utför videoinspelningarna med minst 100 bilder / s för att säkerställa smidiga gångövergångar.
- Om det behövs, motivera djuren att röra sig genom att försiktigt knacka på gångvägsväggen eller knäppa / klappa fingrarna. Undvik dock fysisk nudging, eftersom det kan påverka resultaten.
- Spara videorna direkt som bildsekvenser i TIFF-format (med LZW-komprimering), JPEG eller PNG. Om kameran spelar in som en rå MOV-fil, konvertera videorna till bildsekvenser genom att öppna filen i ImageJ / FIJI24 och klicka på File > Save as > Image sequence (eller genom att använda annan programvara, till exempel LosslessCut25).
OBS: De flesta djur börjar gå omedelbart efter att ha satts i gångvägen; Därför rekommenderas att starta videoförvärvet innan djuret placeras.
3. Förbereda videorna för MW-spårningsprogramvaran
- Filma tillräckligt många kompletta körningar av varje enskild mus. Antalet djur som skall filmas per tillstånd och antalet kompletta omgångar skall bestämmas enligt varje försöksupplägg. En komplett körning är när musen går hela 50 cm av gångvägen utan långvariga stopp (i detta experiment valdes tre kompletta körningar).
OBS: Beroende på bildinsamlingsprogramvaran kan videor behöva beskäras till minsta avkastning. Detta kommer att öka hastigheten för spårning och generering av utdata. - I ImageJ/FIJI24 väljer du de ramar där musen är på skärmen genom att klicka på Image > Stack > Tools > Make a substack. Spårningen på MW kräver att huvudet och svansen är synliga i alla ramar. Det är dock möjligt att göra flera delstacks från en enda videoinspelning, som senare representerar varje körning.
- Spara varje delstack separat i olika mappar genom att klicka på Arkiv > Spara som > bildsekvens. MW-programvaran skapar senare en undermapp automatiskt i varje katalog varje gång man börjar analysera en körning.
4. Spårning
- Öppna MATLAB, lägg till mappen som innehåller MW-skriptet i arbetskatalogen och kör "MouseWalker.m" på huvudkommandoraden.
OBS: Genom att använda MW-programvaran under MATLAB kan spårningsfelmeddelanden visas på MATLAB: s huvudkonsol och önskade utdata väljas (genom att öppna huvudskriptfilen "MouseEvaluate.m" och ändra utgångarna till antingen 1 eller 0: excelfilen, fotstegsdiagram, hållningsspår och gångmönster). - Ladda videomappen som "Inmatningskatalog". Man kan också välja utdatamappen; Detta är dock inte ett krav eftersom MW-programvaran skapar en ny mapp som heter "Resultat" automatiskt inuti "Inmatningskatalogen".
- Använd pilarna "<<", "<", ">>" och ">" kontrollera om videoramarna är korrekt laddade i MW-programvaran.
- Gå till fönstret "Inställningar" där alla kalibrerings- och tröskelparametrar finns. Dessa inställningar kan ändras beroende på pixelintensiteten för bakgrunden och fotavtrycken, samt den minimala storleken på kroppen och fotavtrycken, bland andra faktorer (se exempel i kompletterande figur 2). Testa effekten av att ändra vissa parametrar genom att klicka på knappen Förhandsgranska .
- Använd de olika plotstilarna, inklusive "kropp + fötter + svans", "endast kropp", "endast fötter" och "endast svans", för att hjälpa till att diskriminera kroppsdelar efter justering av tröskelparametrarna.
- Dra nytta av verktygen på panelen till höger för att mäta ljusstyrkan eller storleken (med knapparna "ljusstyrka" respektive "linjal"). Alla inställningar kan sparas som "standard" så länge kameraavståndet förblir detsamma.
- När du har justerat tröskelparametrarna kontrollerar du att videon är redo för automatisk spårning. Gå till den första ramen och klicka på Auto för att börja spåra. Detta steg kan följas i realtid, och det tar några minuter, beroende på storleken på videon och datorns prestanda.
- Om autospårningen felaktigt märker kroppsfunktionerna avbryter du den automatiska spårningen, anger nya inställningar och startar om processen.
- När spårningen är klar, kontrollera om en manuell korrigering behövs. För att korrigera, använd mittpanelen för att välja eller avmarkera och ange platsen för höger framsida (RF), höger bak (RH), vänster fram (LF) och vänster bak (LH) tassfotavtryck, huvud, näsa, kropp (uppdelad i två segment) och svanspositioner (uppdelad i fyra segment). Spara ändringarna genom att trycka på knappen Spara .
OBS: Alla knappar och de flesta kommandon har en kortkommando (se tillhörande manual för detaljer23). För att underlätta videorullning och körning av kortkommandon kan en hårdvarustyrenhet med programmerbara knappar och ett skyttelhjul som Contour ShuttlePro V2 användas. - Klicka på Utvärdera för att generera utdatafilerna från den spårade videon. Beroende på önskade utdata (se steg 4.1) kan det här steget ta några minuter.
- Kontrollera att alla grafiska utdataplottar sparas i mappen "Resultat". Kontrollera noggrannheten i spårningen genom att undersöka några av de grafiska utgångarna, till exempel "Stance traces", där man kan kontrollera om alla tasspositioner är konsekventa.
- Om ett fel identifieras, korrigera spårningen manuellt (om möjligt, annars eliminerar du mappen "Resultat" och utför automatisk spårning igen med nya inställningar) och klickar på kommandot Utvärdera igen.
- Kontrollera att alla kvantitativa mätningar som genereras av MW-programvaran sparas på ett Excel-kalkylblad och sammanfattas på "1. Info_Sheet". Kontrollera att Excel-alternativen för formelavgränsningarna matchar skriptet. Decimaltecknet måste vara "," och tusentalsavgränsarna måste vara ";".
- Använd skriptet "MouseMultiEvaluate.m" för att samla måtten från alla körningar i en ny fil för analys.
- Börja med att generera en .txt fil som innehåller mappvägarna för alla videor (t.ex. "Videofiler.txt"). Se till att varje rad motsvarar en enda video.
- Skriv sedan "MouseMultiEvaluate ('Videofiles.txt')"I kommandoraden. En Excel-fil med namnet "ResultSummary.xls" genereras i arbetskatalogen (se ett exempel på GitHub-lagringsplatsen).
OBS: Figur 2 representerar de grafiska utdata som erhållits av MW-programvaran från videor av ett inspelat djur.
5. Arbetsflöde för kinematisk dataanalys
- Redigera Excel-arket som genererades i steg 4.10, som innehåller data för bearbetning med de medföljande Python-skripten, enligt följande förutsättningar.
- I den första kolumnrubriken anger du experimentvillkoret. Namnge varje rad efter grupp-/villkorsnamnet (individer från samma grupper måste ha samma namn). Den första gruppen måste vara kontrollen eller baslinjen (detta är endast obligatoriskt för värmekartplottning, steg 5.6).
- I den andra kolumnen anger du djurets ID. Detta är obligatoriskt, även om denna information inte kommer att användas för generering av tomter.
- I den tredje kolumnen och framåt väljer du de motorparametrar som ska användas för analysen. Se till att den första raden är namnet på parametern (dessa namn kommer senare att visas i tomterna).
- Öppna Anaconda Navigator och kör Spyder för att öppna de medföljande Python-skripten.
Alla skript har utvecklats med Python 3.9.13, kördes med Spyder 5.2.2 i Anaconda Navigator 2.1.4 och finns tillgängliga i materialförteckningen och GitHub-arkivet (där ytterligare material ingår, till exempel ett videoexempel, en Excel-exempelfil och ett FAQ-dokument). Det är möjligt att köra skripten utanför Anaconda Navigator; Detta grafiska användargränssnitt är dock mer användarvänligt. - Använd "Rawdata_PlotGenerator.py" för att generera rådatadiagrammen. Detta möjliggör visualisering av varje parameter som en funktion av hastigheten.
- Öppna "Rawdata_PlotGenerator.py" i Spyder och kör koden genom att klicka på Play-knappen .
- Välj Excel-filen som ska analyseras och arknamnet i det automatiska fönstret. Om arknamnet inte har ändrats skriver du "Sheet1".
- Rådatadiagrammen visas i diagramkonsolen (övre högra panelen). För att spara tomterna, klicka på knappen Spara bild eller Spara alla bilder i plotkonsolen.
- Använd skriptet "Residuals_DataAnalysis" för att beräkna resterna för dataanalys. Detta skript genererar en CSV-fil med beräkningarna av resterna för alla motorparametrar.
OBS: Många av de uppmätta gångparametrarna som extraheras av MW varierar med hastigheten (t.ex. svänghastighet, steglängd, hållningslängd, hållningsrakhet och gångindex). Därför rekommenderas det att utföra en bäst anpassad regressionsmodell för varje enskild parameter kontra hastighet för baslinjeexperimentet och att sedan bestämma restvärdena för varje experimentgrupp i förhållande till denna regressionsmodell. Data uttrycks sedan som skillnaden från den återstående normaliserade linjen26.- Öppna "Residuals_DataAnalysis.py" i Spyder och kör koden genom att klicka på Play-knappen .
- Välj Excel-filen som ska analyseras och arknamnet i det automatiska fönstret. Om arknamnet inte har ändrats skriver du "Sheet1".
- Spara CSV-filen i samma mapp som data. Det är obligatoriskt att kontrollen (eller baslinjen) är den första gruppen i Excel-filen.
- Använd skriptet "PCA_PlotGenerator.py" för att utföra en principalkomponentanalys (PCA).
OBS: Denna oövervakade dimensionalitetsreduktionsmetod används för att generera en mer kortfattad representation 27,28,29 av data (figur 3A, B). PCA-skriptet innehåller följande steg. Data förbehandlas först genom centrering och skalning, varefter PCA-algoritmen beräknar kovariansmatrisen för att bestämma korrelationerna mellan variablerna och beräkna egenvektorerna och egenvärdena för kovariansmatrisen för att identifiera huvudkomponenterna. De första två eller tre huvudkomponenterna väljs för representation av data i 2D- respektive 3D-diagram. Varje punkt i diagrammen motsvarar ett djur och representerar en annan abstrakt variabel. Färgkodade prickar används för att skilja de specifika grupperna. Som sådan återspeglar kluster av prickar liknande gångmönster som delas av motsvarande individer.- Öppna "PCA_PlotGenerator.py" i Spyder och kör koden genom att klicka på Play-knappen.
- Välj Excel-filen som ska analyseras och arknamnet i det automatiska fönstret. Om arknamnet inte har ändrats skriver du "Sheet1".
- Kontrollera att PCA 2D- och 3D-diagrammen visas i ritkonsolen (övre högra panelen). Varje färg representerar en annan grupp och förklaringen visas bredvid diagrammet. För att spara tomten, klicka på Spara bild i plotkonsolen.
- Använd "Heatmap_PlotGenerator.py" för att generera en värmekarta. Se till att värmekartgeneratorn skapar en tabell som visar de statistiska skillnaderna mellan baslinjegruppen (eller kontrollgruppen) och de andra grupperna för varje motorparameter27 (figur 4). Varje kolumn visar en grupp, och varje rad relaterar till en specifik motorparameter.
OBS: Statistisk analys utfördes med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test (för normala fördelningar) eller en Kruskal-Wallis ANOVA följt av Dunns post hoc-test (för icke-normala fördelningar). Avvikande värden uteslöts från analysen. P-värden representeras av en färgkod, med röda och blå nyanser som indikerar en ökning eller minskning i förhållande till kontroll (eller baslinje). Färgnyansen representerar den statistiska signifikansen, med mörkare färger som visar en högre signifikans och ljusare färger som visar en lägre signifikans. motsvarar P < 0,001; ** motsvarar P < 0,01; och * motsvarar P < 0,05. Vitt indikerar ingen variation.- Öppna "Heatmap_PlotGenerator.py" i Spyder och kör koden genom att klicka på Play-knappen .
- Välj Excel-filen som ska analyseras och arknamnet i det automatiska fönstret. Om arknamnet inte har ändrats skriver du "Sheet1".
- Välj typ av data i det andra automatiska fönstret: rådata eller restdata. Om ett alternativ inte är markerat är restdata standard.
- Värmekartan visas i plottkonsolen (övre högra panelen). För att spara tomten, klicka på Spara bild i plotkonsolen.
Det är obligatoriskt att kontrollen (eller baslinjen) är den första gruppen i Excel-filen.
- Använd "Boxplots_PlotGenerator.py" för att generera boxplots. Detta verktyg gör det möjligt att generera boxplots som representerar fördelningen av värden för alla motorparametrar för varje grupp (figur 5, figur 6 och figur 7).
Varje ruta innehåller medianen som mittlinjen, och rutornas nedre och övre kanter representerar kvartilerna på 25 % respektive 75 %. Morrhåren representerar intervallet för den fullständiga datauppsättningen, exklusive extremvärden. Avvikande värden definieras som ett värde som är 1,5 gånger interkvartilintervallet under eller över kvartilerna på 25 % respektive 75 %.- Öppna "Boxplots_PlotGenerator.py" i Spyder och kör koden genom att klicka på Play-knappen .
- Välj Excel-filen som ska analyseras och arknamnet i det automatiska fönstret. Om arknamnet inte har ändrats skriver du "Sheet1".
- Välj typ av data i det andra automatiska fönstret: rådata eller restdata. Om ett alternativ inte är markerat är restdata standard.
- Boxplottarna visas i plotkonsolen (övre högra panelen). För att spara tomterna, klicka på knappen Spara bild eller Spara alla bilder i plotkonsolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BMS-standardsystemet beskriver bruttomotorunderskotten efter SCI14. På grund av dess subjektiva natur utförs i allmänhet andra kvantitativa analyser tillsammans med BMS för att ge en mer detaljerad och fin bedömning av rörelse. Dessa tester misslyckas dock med att visa specifik information om stegcykler, stegmönster och samordning mellan framben och bakben, vilket är extremt viktigt för att förstå hur ryggradskretsarna upprätthåller funktion och anpassar sig till en ofullständig SCI. Det här avsnittet visar hur MW-verktygslådan kan hjälpa till att övervaka återhämtningen av rörelsefunktionen efter SCI och lägga till relevant information om gångbeteende.
Studieprovet delades in i två grupper av kvinnliga C57Bl/6J-möss i åldern 9 veckor gamla: en SCI-experimentell grupp (n = 11), där djuren genomgick laminektomi följt av en måttlig till svår kontusionsskada vid nivån av T9 / T10-ryggraden med hjälp av en oändlig horisontslaganordning (se materialtabell); och en skenskadad kontrollgrupp (n = 10), där endast laminektomi utfördes på samma kolonnnivå (figur 1, steg 1). Det lokomotoriska beteendet hos SCI och skamskadade djur övervakades i 30 dagar. MW-testet utfördes på tillvänjningsdagen före operationen (baslinjen) och 15 dagar, 22 dagar och 30 dagar efter skada (dpi) (figur 1, steg 2). För jämförelsens skull utsattes mössen för BMS-testet parallellt före operationen och vid 1 dpi, 3 dpi, 7 dpi, 14 dpi, 21 dpi och 30 dpi (kompletterande figur 3). Efter att ha spårat alla videor som erhållits med MW genererades sedan två typer av utdatafiler: grafiska utgångar, som visar visuella representationer av flera parametrar efter varje körning, och kinematiska utgångar, som sammanfattar alla mätbara motorparametrar (figur 1, steg 3 och steg 4).
Med hjälp av en uppsättning Python-skript (se Materialförteckning och GitHub-lagringsplatslänken) erhölls därför rådatadiagrammen (figur 1, steg 5). Eftersom de flesta parametrar påverkas av djurets hastighet utfördes en regressionsmodell av baslinjegruppen före skadan tillsammans med de uppmätta restvärdena för varje tillstånd (figur 1, steg 6). För att kontrollera kinematiska profiler och signifikanta skillnader mellan kontroll- (sham) och experimentgrupperna (SCI) utsattes alla kinematiska parametrar (totalt 79) för en tre-ordningens huvudkomponentanalys (PCA), och en värmekarta genererades med en samling motorparametrar som bäst beskrev datasetet (totalt 33) (figur 1, steg 7a, b). Slutligen jämfördes specifika motorparametrar som påverkades efter leverantörskedjeinitiativet med utgångsvärdet före skadan (figur 1, steg 7c).
Figur 1: Schematisk representation av MW: s analysarbetsflöde. (1) Djuren väljs ut för laminektomi (skenkontrollgrupp) eller laminektomi följt av ryggmärgsskada (experimentgrupp). (2) Djuren genomgår sedan en beteendeanalys dagen före skadan och dag 15, 22 och 30 efter skadan. (3) MW genererar två typer av utdata: (a) grafiska visualiseringar av flera parametrar, såsom hållningsspår, gång- och stegmönster, och (b) en kinematisk sammanfattning av alla mätbara motorparametrar. (4) Alla kontroll- och experimentella data samlas i en enda fil med skriptet "MouseMultiEvaluate.m" på MATLAB. (5) Skriptet "RawData_PlotGenerator" för Python genererar en visuell representation av hur alla mätbara motorparametrar varierar beroende på hastighet. Om parametrarna inte korrelerar med hastighet kan man hoppa till (7); Men eftersom de flesta parametrar efter SCI starkt beror på hastighet, bör en modell genereras (6) med skriptet "Residual_DataAnalysis" för Python. Efter generering av restvärdena för varje motorparameter utförs dataanalys (7): a) En huvudkomponentanalys (PCA) utförs med hjälp av ett urval av parametrar med ett "PCA_PlotGenerator" -skript; b) En värmekarta skapas med ett skript med beteckningen "Heatmap_PlotGenerator" för att visa de statistiskt signifikanta skillnaderna mellan villkoren för olika parametrar. och c) flera enskilda parametrar som ändras efter att SCI har utvärderats med skriptet "BoxPlot_PlotGenerator". Alla skript är tillgängliga i Materialförteckning och GitHub lagringsplatslänk. Skripten visas i rött. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Från de grafiska utdata som samlats in från MW var det möjligt att bekräfta den välkända plötsliga förändringen i den visuella visningen av fotavtrycken efter SCI. I "Digital-ink" -analysen som genererades av MW upptäcktes brist på stöd för baktassarna (figur 2A), tillsammans med en minskning av fotavtrycksområdet för både vänster och höger baktassar (figur 2B), som bibehölls från 15 dpi och framåt (data visas inte). Dessutom, inom varje stegcykel, beräknar MW parametrar relaterade till hållningsfasen (dvs. tiden mellan tasstouchdown och före lyft) och svängfasen (dvs. den tid lemmen är från marken). Som sådan kan MW generera visuella "hållningsspår", som tar hänsyn till positionen för kroppens centrum och axel i förhållande till varje ben och deras fotavtryckscentrum under hållningsfaserna23. De övergripande hållningsspåren som erhölls för varje djur uppvisade flera unika egenskaper (figur 2C). Dessa data visade att efter SCI hade baktassarna kortare hållningsspår och mer slumpmässig tasspositionering vid både touchdown och lyft från 15 dpi och framåt (figur 2C).
Figur 2: Representativa grafiska utdata som erhållits av MW-programvaran från spårningsvideorna. A) "Digitala bläck"-utskrifter för ett djur av leverantörskedjeintresse som visar varje tass med olika färg: rött (höger fram), gult (vänster fram), grönt (höger bak) och blått (vänster bak) vid flera tidpunkter. (B) Fotavtryck för vänster för (LF), vänster bak (LH), höger för (RF) och höger bak (RH) hos ett djur av gemenskapsintresse vid 15 dpi. c) "Ställningsspår" för ett djur av gemenskapsintresse vid flera tidpunkter. AEP och PEP för ett av benen illustreras i den första panelen. "Fotavtrycksklustring" för både AEP och PEP motsvarar standardavvikelsen för de genomsnittliga AEP- eller PEP-koordinaterna i varje video. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; cm = centimeter; px = pixel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Därefter analyserades de kinematiska utgångarna efter att ha beräknats av MW (figur 3 och figur 4). För att få en mer kortfattad bild av datasetet och testa om de kinematiska motorparametrarna erhållna från MW var tillräckliga för att skildra rörelseunderskott som hittades hos SCI-djur över tid, utfördes en PCA27. Märkbart kunde 40% av variansen i data förklaras i den första komponenten (PC1: 40,1%), som separerade gruppen djur som hade ett SCI från resten, med ett p-värde lägre än 0,001 baserat på ett enkelriktat ANOVA-test (figur 3A,B) vid alla tidpunkter (15 dpi, 22 dpi och 30 dpi). Det fanns också ett dåligt bidrag från de andra komponenterna (PC2: 11% och PC3: 8.6%). Den tilldelade vikten för varje motorparameterbidrag för varje komponent illustreras i kompletterande figur 4. Dessutom var variansen i datasetet inte tillräcklig för att återspegla skillnader över tid (dvs. mellan 15 dpi, 22 dpi och 30 dpi), vilket replikerar den tidigare beskrivna platån för lokomotorisk återhämtning14. Sammantaget indikerar dessa resultat att de kinematiska parametrarna som erhållits från MW starkt beskriver de motorunderskott som observerats efter SCI över alla tidpunkter.
Figur 3: Huvudkomponentanalys av alla kinematiska motorparametrar (79) som erhållits av MW-programvaran efter restdataanalysen. (A) En 3D-visualisering av trekomponents PCA-analys. (B) En 2D-visualisering med cirklar som representerar 50% av insamlade data. I PC1, som förklarade över 40% av variansen, skilde sig SCI-gruppen vid 15 dpi, 22 dpi och 30 dpi signifikant från skengruppen och baslinjen (före skada), med ett p-värde < 0,001, vilket bestämdes av en enkelriktad ANOVA. Varje enskild liten punkt eller triangel representerar medelvärdet av tre videor för varje djur, medan de större prickarna eller trianglarna representerar medelpunkten (n = 10-11 per tillstånd, n = 21 för baslinjegruppen). Bidraget från varje komponent anges i varje axel. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; SCI = ryggmärgsskada; PC = huvudkomponent. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Därefter valdes en samling motorparametrar baserat på hur starkt den beskrev datasetet (totalt 33) och en värmekarta genererades (figur 4). Faktum är att de flesta lokomotoriska parametrar visade en drastisk förändring efter SCI vid alla tidpunkter (15 dpi, 22 dpi och 30 dpi), medan de skenskadade kontrollerna endast visade signifikanta förändringar vid 30 dpi. Dessa förändringar i skengruppen kan förklaras av en total minskning av svinghastigheten, möjligen på grund av testtillvänjning, som kommer att diskuteras senare.
Det märktes att SCI-djuren gick långsammare än de skamskadade kontrollerna (data visas inte). Oberoende av hastighet, vid både 15 dpi och 30 dpi, uppvisade dock SCI-djuren en högre svängningstid, lägre hållningstid och ett lägre arbetsfaktorindex, vilket hänför sig till hållningsvaraktigheten/stegningsperioden23. Dessa resultat indikerar att de förändringar i benpositionering som beskrivs ovan är karakteristiska för SCI, som ses i andra djurmodeller30,31,32, och inte är relaterade till förändringar i takt (figur 4).
Det bör också nämnas att vänster och höger synkronisering inte påverkades, eftersom en signifikant förändring av "fas"-index för frambenen och bakbenen inte observerades10,23 (figur 4), vilket indikerar intakt koppling mellan vänster och höger extremitet.
Dessutom uppvisade SCI-mössen ett lägre index för "hållningsrakhet" (förskjutning/banlängd) i både frambenen och bakbenen (figur 4). Denna parameter mäter hur linjära spåren är i förhållande till det ideala tillståndet, vilket skulle vara en rak linje (från 0 till 1, vilket indikerar ett linjärt spår)27. Därför indikerar dessa resultat en stark oförmåga att gå rakt i denna grupp.
För varje hållningsfas drar MW en rekonstruktion av kroppens svängningar, med början vid tasstouchdown - den främre extrema positionen, eller AEP - och slutar före lyft - den bakre extrema positionen, eller PEP (se exemplet i figur 2C). "Fotavtrycksklustringen" för både AEP och PEP mäter standardavvikelsen för de genomsnittliga AEP- eller PEP-koordinaterna i varje video. SCI-djuren visade en ökning av kluster av baktassavtryck för AEP vid alla tidpunkter, och en signifikant effekt observerades endast för den skamskadade gruppen vid 15 dpi (figur 4). Detta illustrerar att SCI-djuren inte kunde placera bakbenen korrekt vid touchdown efter gungan. Dessutom sågs en minskning av "klustring av fotavtryck" för PEP, tillsammans med en minskning av klustring av baktassavtryck för PEP, vid 30 dpi (figur 4). Dessa resultat överensstämmer med vad som observeras i de ritade "hållningsspåren" och tyder på att framtassarnas position blir mer begränsad efter skada.
Slutligen, och i enlighet med förändringarna i tasspositioneringen, fanns det förändringar i gångstrategierna och "trycket" som framkallades av tassarna, mätt med den genomsnittliga ljusstyrkan över området (figur 4), som kommer att diskuteras ytterligare.
Figur 4: Värmekartdiagram som visar en samling av signifikant förändrade lokomotoriska parametrar som jämför SCI-djur och skamskadade djur i förhållande till dagen före operationen, som erhållits av MW efter restdataanalys. n = 10-11 per tillstånd; Baslinjegruppen inkluderar alla djur dagen före operationen, n = 21. Data uttrycks med p-värdet efter statistisk analys med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test (för normalfördelningar) eller Dunns post hoc-test (för icke-normala fördelningar). P-värdena representeras av en färgkod, med röda och blå nyanser som indikerar en minskning eller ökning i förhållande till baslinjen. Färgskuggan representerar den statistiska signifikansen, med mörkare färger som indikerar en högre signifikans och ljusare färger som indikerar en lägre signifikans; P < 0,001; **P < 0,01; *P < 0,05. Vitt indikerar ingen variation. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; SCI = ryggmärgsskada; s = sekund; ms = millisekund; avg = genomsnitt; F = för; H = bak; AEP = främre extrem position; PEP = bakre extremposition; LF = vänster fram; LH = vänster bak; RF = höger fram; RH = höger bak. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Därefter försökte vi förstå vilka enskilda parametrar som skulle vara bäst för att beskriva rörelseunderskottet hos SCI-djur i olika stadier av skadan (dvs. 15 dpi, 22 dpi och 30 dpi). Vi började med att undersöka stegcykelparametrarna som visade skillnader mellan frambenen och bakbenen när bakbenen utvecklades från total förlamning till partiell funktion (figur 5). Medan den genomsnittliga svänghastigheten ökade signifikant för frambenen i förhållande till baslinjen (före skada), förändrades inte bakbenens svänghastighet signifikant (även om det fanns en tendens att den var lägre än baslinjen) (figur 5A, B). Samtidigt minskade frambenens genomsnittliga steglängd, utan några signifikanta förändringar för bakbenen (figur 5C,D). Inte överraskande visade de skadade mössen minskad svängningstid för frambenen och en omvänd ökning av varaktigheten av deras bakbenssvängningar vid 15 dpi framåt (figur 5E, F). Sammantaget indikerar dessa resultat att frambenen antog en snabbare rytm, med två frambenscykler för varje bakbenscykel. Detta 2:1-cykelförhållande har beskrivits tidigare efter SCI-hemisektion hos råtta 1,33 och illustrerar en viktig aspekt av defekt koordination mellan framben och bakben, som inte återvinns efter 30 dpi hos möss.
Figur 5: Stegcykelparametrar för framtassar och baktassar vid flera tidpunkter 1 dag före skadan och vid 15 dpi, 22 dpi och 30 dpi hos djur av gemenskapsintresse (n = 11). (A,B) Den genomsnittliga svänghastigheten för framtassar och baktassar i förhållande till baslinjen. (C,D) Den genomsnittliga steglängden för framtassarna och bakpotarna i förhållande till baslinjen. (E,F) Den genomsnittliga svängtiden för framtassar och baktassar i förhållande till baslinjen. I boxplottarna representeras medianen av mittlinjen, och rutornas nedre och övre kanter representerar 25% respektive 75% kvartiler; Morrhåren representerar intervallet för den fullständiga datauppsättningen. Outliers representeras av enstaka punkter. Statistisk analys utfördes med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test (för normala fördelningar) eller Dunns post hoc-test (för icke-normala fördelningar). *P < 0,05; **P < 0,01; P < 0,001. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; SCI = ryggmärgsskada; cm = centimeter; s = sekund. Klicka här för att se en större version av denna figur.
MW-programvaran kan också beräkna stegmönster hos möss genom att mäta fraktionen av ramar som tilldelats en specifik benkombination, och detta fungerar som en proxy för närvaron av specifika gångstrategier. Vid långsammare hastigheter tenderar oskadade möss att anta en "gånggång", där de flesta ramar har en enbenssvängning (oavsett tassposition). Vid mellanhastigheter, vanligast på landningsbanan, byter möss till en travgång, där den mest representativa konfigurationen är diagonalbensvingen. Slutligen, vid högre hastigheter, använder möss en "galoppgång", med tre ben som svänger samtidigt23,34. Andra mindre vanliga konfigurationer inkluderar pacinggången, mestadels representerad av sidobensvingen (antingen både vänster eller höger ben) och den "bundna / hoppande gången", med antingen både bakbenen eller frambenen svängande samtidigt10. Man bör dock komma ihåg att i samband med ett SCI kan vissa av dessa konfigurationer, såsom trebensvingen, återspegla defekt bakbenstassposition och därmed inte exakt matcha med en specifik gångstrategi - i detta fall galoppen. Därför förenklades analysen genom att enbart benkonfigurationerna jämfördes.
Efter att ha utfört den återstående analysen noterades att det fanns en minskning av förekomsten av diagonala svängningar åtföljd av en minskning av enstaka svängningar vid alla tidpunkter (figur 6A, B). Mer intressant var det en ökning av förekomsten av laterala svängningar (figur 6C). Den pacingliknande gången är inte typisk för en vanlig C57BL / 6J-mus; Det har dock redan rapporterats inträffa efter SCI-hemisektion hos råttor1. Detta fasmönster var inte tillräckligt vanligt för att ändra frambenens eller bakbenens fasindex (som ses i figur 3) men illustrerar defekt ryggradsåterkoppling från bakbenen till frambenen. Dessutom skedde en naturlig ökning av prevalensen av gungor i framben/bakben (figur 6D), möjligen på grund av felaktig fotstegning i bakbenen, och en ökning av gungor med tre ben (figur 6E).
Figur 6: Medelvärdet för olika stegsvängningskonfigurationer . (A) diagonal, (B) enkel, (C) lateral, (D) fram/bak och (E) trebensvinga vid flera tidpunkter hos SCI-djur (n = 11) visas. I boxplottarna representeras medianen av mittlinjen, och rutornas nedre och övre kanter representerar 25% respektive 75% kvartiler; Morrhåren representerar intervallet för den fullständiga datauppsättningen. Outliers representeras av enstaka punkter. Statistisk analys utfördes med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test (för normala fördelningar) eller Dunns post hoc-test (för icke-normala fördelningar). **P < 0,01; P < 0,001. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; SCI = ryggmärgsskada; NA = ej tillämpligt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen är en annan avläsning som kan extraheras från MW "tryck" som ett mått på ljusstyrka / area. Med högre hastigheter minskar kontaktområdet med marken och trycket ökar, så en linjär regression av baslinjedata utfördes och restvärdena för varje tillstånd mättes. Det noterades att trycket på framtassarna ökade signifikant över alla tidpunkter, men styrkan i denna effekt tenderade att minska med tiden, eftersom förändringen för vänster framtass redan förlorade statistisk signifikans vid 30 dpi (figur 7A, C). Denna specifika effekt på vänster sida kunde förklaras av en lateraliserad skada, som företrädesvis kunde ha påverkat höger sida av ryggmärgen i denna studie. Ändå minskade trycket från bakpoten hos skadade möss, som förväntat, över alla tidpunkter, utan tendens till en ökning (figur 7B, D).
Figur 7: Tryck som framkallas av bak- och framtassarna vid flera tidpunkter hos djur av gemenskapsintresse (n = 11). Tryck framkallat av (A) vänster framtass, (B) vänster baktass, (C) höger framtass och (D) höger baktass, visas som relativa skillnader mot baslinjen (dagen före skada). I boxplottarna representeras medianen som mittlinjen, och rutornas nedre och övre kanter representerar 25% respektive 75% kvartiler; Morrhåren representerar intervallet för den fullständiga datauppsättningen. Outliers representeras av enstaka punkter. Statistisk analys utfördes med en enkelriktad ANOVA följt av Tukeys post hoc-test (för normala fördelningar) eller Dunns post hoc-test (för icke-normala fördelningar). **P < 0,01; P < 0,001. Förkortningar: dpi = dagar efter skada; SCI = ryggmärgsskada; cm = centimeter; px = pixel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Sammantaget illustrerar denna studie MW-systemets kraft för att kvantitativt beskriva de motoriska funktionsnedsättningar som orsakas av SCI som ibland kan ignoreras på grund av andra testbegränsningar. Dessutom understryker det den otvivelaktigt begränsade funktionella återhämtningen över tid i kontusionsmusmodellen av SCI.
Kompletterande figur 1: MW-hårdvarukomponenter. (A) Denna inställning är uppdelad enligt följande: I - fTIR gångväg; II - fTIR-stödbas och inlägg; III - gångvägsvägg; IV - 45° spegel; och V - bakgrundsbelysning. (B) Närbilder av Base-U-kanalen och gångvägens sidolinjer. (C) Utformning av gångvägsväggen. (D) Närbild av 45° spegelinställningen. Förkortning: cm = centimeter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: En enda bildruta i en fTIR-video där pixelintensitet och regionområden anges. Pixelintensiteterna för kropp, bakgrund och fotavtryck som används för videoanalysen i denna studie presenteras mellan parenteser och indikeras med rött, alla optimerade för bildklarhet. Ljusintensiteten bör justeras för att uppnå korrekt diskriminering mellan de olika regionerna. Relativa områden av kroppen och fotavtryck indikeras med streckade gula linjer. Både områdena och pixelintensiteten förvärvades i ImageJ/FIJI. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: (A) BMS totalpoäng och (B) delpoäng för mössen som analyserades i denna studie (n = 10-11). Alla data uttrycktes som medelvärde ± SEM. Statistisk analys utfördes med en tvåvägs upprepad åtgärd ANOVA följt av Bonferronis post hoc-test; P < 0,001. Förkortning: BMS = Basso musskala. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Den tilldelade vikten för varje motorparameterbidrag för varje komponent. Den tilldelade vikten för varje motorparameter (totalt 79) efter restanalysen för (A) PC1, (B) PC2 och (C) PC3 i PCA. Brytlinjen drogs vid 0,04 ms och −0,04. Förkortningar: ms = millisekund; avg = genomsnitt; SD = standardavvikelse; F = för; H = bak; AEP = främre extrem position; PEP = bakre extremposition; LF = vänster fram; LH = vänster bak; RF = höger fram; RH = höger bak; Tryck = tryck. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här demonstreras potentialen hos MouseWalker-metoden genom att analysera lokomotoriskt beteende efter SCI. Det ger nya insikter i specifika förändringar i steg-, fotavtrycks- och gångmönster som annars skulle missas av andra standardtester. Förutom att tillhandahålla en uppdaterad version av MW-paketet beskrivs även dataanalysverktyg med hjälp av de medföljande Python-skripten (se steg 5).
Eftersom MW genererar ett stort dataset och en samling kinematiska parametrar som återspeglar en högdimensionell lokomotorisk process, användes en PCA; PCA har faktiskt använts i stor utsträckning i andra kinematiska dataset som liknar den här 27,35,36 (figur 3). Denna teknik för dimensionsreduktion är en enkel och robust metod med minimala antaganden som möjliggör kvantitativt identifiering av kinematiska profiler och snabbt särskiljande av dem från kontroll- eller baslinjeförhållanden. Dessutom genererades värmekartor för att snabbt identifiera de parametrar som statistiskt skilde sig från baslinjen (figur 4), som senare kunde analyseras individuellt (figur 5, figur 6 och figur 7).
Därefter visades hur specifika parametrar som kan extraheras från MW illustrerar de robusta rörelseunderskotten som ses hos SCI-djur, såsom samordning. Samordning är förmågan att använda varje lem på ett organiserat sätt för att utföra en uppgift. Ofta mäts koordinationen indirekt av antalet misstag/positiva händelser på en stege 16,17 eller tiden på rotarod15. MW beräknar både variationen i tasspositionering under stegcykeln (fotavtrycksmönster) och "stance straightness" index27. Det visades att båda parametrarna påverkades signifikant av skadan (figur 4).
Dessutom tillåter MW användaren att extrahera parametrar relaterade till tidsdynamik. En signifikant störning av gungnings-/hållningstiden hos SCI-djur sågs (figur 4), och det konstaterades att SCI-mössen kompenserade för förlusten av stöd på bakbenen genom att påskynda deras frambensstegscykel, vilket minskade frambenens steglängd och genomsnittliga svängtid (figur 5). Denna effekt kan relatera till förskjutningen i tyngdpunkten, vilket tvingar framtassarna att tåla mer kroppsvikt1. På samma sätt kan det hänföras till förlusten av de långa stigande propriospinalvägarna, som är ansvariga för den synergiska interaktionen mellan frambenen och bakbenet CPG 1,9,32, vilket i slutändan leder till dissociation av framben-bakbensrytmen.
Egenskaperna hos steggångar kan illustrera den modulära organisationen av lokomotoriska nätverk 1,34. Även om stegmönster inte är en direkt proxy för de gångstrategier som antagits i detta fall23, kan vissa viktiga observationer fortfarande dras. Viktiga förändringar sågs i stegmönstren hos SCI-möss (figur 6). De skadade djuren började anta laterala gungor (pacing-liknande gångarter), och det fanns också en minskning av diagonala gungor. Dessa anpassningar verkar vara förknippade med ett försök att samordna frambenen och bakbenen, vilket återigen visar dissociationen mellan ryggradsspåren under och ovanför skadan, som inte återhämtar sig 1,9,32.
Den begränsade återhämtningen efter SCI verifierades också av en minskning av muskelkraften i bakbenen, mätt med medeltrycket (figur 7). Följaktligen tvingas frambenen att stödja mer kroppsvikt, vilket ökar trycket. Medan många parametrar relaterade till muskeldynamik inte analyserades här (dvs. flexor och extensor muskelkoordination 7,21), kan denna kvantitativa mätning ge en direkt avläsning av mängden lemstöd.
Denna MW-analys kan också kombineras med standard BMS-testet, som mäter lemrotation, tassplacering, svansposition och stegfel. I allmänhet uppnår SCI-möss en maximal poäng på 4-5, med en maximal delpoäng på 3, vilket innebär att de kan utföra enstaka till frekventa steg men mestadels rotera vid tasslyft och / eller touchdown14 (kompletterande figur 2). Det blir klart varför AEP-värdena för bakpotarna ändrades signifikant i SCI-gruppen, eftersom den icke-parallella positioneringen av lemmarna under svängfasen kan påverka tasskoordinaterna. Dessutom klassificeras bagageutrymmet i BMS vanligtvis som allvarligt på grund av förekomsten av fall eller händelser som förhindrar steg, såsom rumpa ner och hoppning14. Även om det inte var möjligt att kvantifiera rumpningsbeteende eller fall som förhindrade stegning, upptäcktes begränsad baktassning i MW, med högre svängningstid (figur 5F), ökad tre bensvängning (figur 6E) och lägre tryck (figur 7B-D). Dessutom observerades en signifikant ökning av fram-/baksvängningar (figur 6D). Det kan finnas två kompletterande förklaringar till denna beteendemässiga manifestation. Först mättes den hoppliknande gången, vilket redan kunde observeras i BMS-testet. Detta beteende kan dock också relateras till brist på korrekt plantarsteg i båda bakbenen, vilket resulterar i fotdrag eller dorsal placering. Sammantaget stöder dessa observationer påståendet att bålstabiliteten skadas allvarligt efter leverantörskedjeinitiativet. Slutligen är ett av kraven för att få högre poäng än 5 i BMS-testet koordination14, och för detta måste minst tre tillgängliga pass observeras av bedömarna under testet. Av dessa måste två av de tre eller flera tillgängliga passen klassificeras som samordnade (dvs. framben och bakben omväxlande). Från MW-data kan man extrahera objektiva mätningar, stance straightness index och footprint clustering, som direkt kvantifierar koordination oberoende av djurhastighet eller tillgängligt pass (figur 4). Dessutom kan växlingen mellan lemmarna kvantifieras objektivt genom att mäta stegstrategierna (figur 6). Dessa parametrar illustrerar tydligt att SCI-möss konsekvent inte kan gå i raka linjer och förlägga bakbenen.
Medan MW-verktygslådan är en användbar strategi för att studera lokomotoriska defekter efter SCI, bör man överväga några av dess begränsningar. För det första är det viktigt att vara konsekvent med förvärvsparametrarna (dvs. kameraposition, fokus, ljusintensitet) så att bildfunktionerna mellan tidpunkterna bibehålls. För det andra noterades att upprepning ledde till tillvänjning, vilket i sin tur ledde till minskad hastighet. Detta bidrog också till ökade uppfödnings-/skötselbeteenden och stopp mitt i loppet. För skadade djur fanns det också en tendens att luta sig mot gångbanans väggar och ett ökat antal stopp mitt i körningen. Eftersom dessa beteenden inte ingår i den lokomotoriska bedömningen får de inte beaktas. Företrädesvis bör forskare välja videor där djuren går kontinuerligt med huvudet pekande rakt. För att motverka påverkan av dessa beteenden på resultaten av denna studie registrerades möss kontinuerligt i minst fyra eller fem körningar och fick springa i vardera riktningen längs gångvägen. Därefter valdes de tre bästa registrerade körningarna och justerades till samma riktning på ImageJ / FIJI24 (180 ° rotation). Således representerades varje djur av ett medelvärde av tre körningar sammanslagna per tidpunkt. Ett större antal djur per tillstånd kan också minska den förväntade variationen. Dessutom bör det noteras att detta lokomotoriska test endast rekommenderas efter att plantarstegning har uppnåtts, eftersom spårningssystemet var utformat för finjusterad lokomotorisk bedömning. I denna studie noterades att före 15 dpi var MW-testet inte fördelaktigt för lokomotorisk bedömning på grund av de ökade fotdragen och felaktig plantarplacering, vilket kan påverka spårningen (data visas inte). Slutligen är vissa parametrar (t.ex. fotavtrycksklustring) mycket känsliga för extrapoleringarna som görs av den regressionsmodell som genereras. Därför justerades koden i enlighet med detta (se dokumentationen i skriptet i GitHub länken).
Sammantaget visades att MW starkt kunde diskriminera SCI-djur från skenskadade kontroller, och MW kunde också samarbeta med etablerade tester som en värdefull metod för att studera lokomotoriska defekter efter SCI. Dessutom visades att kvantitativa utdata enkelt kunde genereras från MW-datasetet med hjälp av de medföljande Python-skripten. Dessa verktyg ger en effektiv experimentell pipeline för att generera en rik och varierad uppsättning kvantitativa och grafiska utgångar som kompletterar de ursprungliga MW-utdatafilerna och kan ändras för att uppfylla forskarens mål när det gäller typ av analys och grafisk representation.
Denna verktygslåda är en värdefull metod för att studera andra motorrelaterade sjukdomar eller motoriska dysfunktioner, inte bara de som är relaterade till ryggmärgsskada. Skarlatou et al.10 visade redan att en specifik mutation i Afadin, ett viktigt ställningsprotein under utveckling, orsakade en avvikande fenotyp i ryggmärgen genom att generera två centrala kanaler. Denna defekt resulterade i förlust av höger vänster lem växling och en högre förekomst av lemsynkronisering, typiskt för en hoppande gång. Stauch et al.10 illustrerade också att denna typ av system kan anpassas efter användarens behov. I det här fallet tillämpades det för att studera specifika beteendemässiga underskott i en råtta Parkinsons sjukdomsmodell. Således har denna verktygslåda ett brett spektrum av applikationer i olika modeller där motoriska störningar förväntas och kan kombineras med redan etablerade beteendeprotokoll i fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Laura Tucker och Natasa Loncarevic för deras kommentarer till manuskriptet och stödet från gnagareanläggningen vid Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Författarna vill uppmärksamma ekonomiskt stöd från Prémios Santa Casa Neurociências - Prize Melo e Castro for Spinal Cord Injury Research (MC-36/2020) till L.S. och C.S.M. Detta arbete stöddes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 och UIDP/04462/2020) och LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) till C.S.M. L.S. stöddes av ett kontrakt med den central- och östeuropeiska enskilda forskningsledaren (2021.02253.CEECIND). AFI stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (2020.08168.BD). A.M.M. stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. stöddes av ett postdoktoralt stipendium från FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (SFRH/BD/138636/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45º Mirror | |||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 16 cm height, 1 on each side | Misumi | ||
| 2 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 on each side | Misumi | ||
| 1 aluminum extrusion (2 x 2 cm), 83 cm long | Misumi | ||
| 87 x 23 cm mirror | General glass supplier | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | We used 2, one with 69 x 6 cm and another with 69 x 3cm to limit the reflection on the mirror | |
| Background backlight | |||
| 109 x 23 cm plexiglass (0.9525 cm thick) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm), 20 cm long, 1 on each side | Misumi | ||
| multicolor LED strip | General hardware supplier | ||
| white opaque paper to cover the plexyglass | General stationery supplier | ||
| fTIR Support base and posts | |||
| 2 aluminum extrusion (4 x 4 cm), 100 cm height | Misumi | ||
| 60 x 30 cm metric breadboard | Edmund Optics | #54-641 | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| M6 hex nuts and wahers | Edmund Optics | ||
| fTIR Walkway | |||
| 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | General hardware supplier | 109 x 8.5 cm plexyglass (1.2 cm thick) | |
| 109 cm long Base-U-channel aluminum with 1.6 cm height x 1.9 cm depth thick folds (to hold the plexyglass) | General hardware supplier | ||
| 2 lateral aluminum extrusion (4 x 4 cm) 20 cm length, 1 on each side | Misumi | ||
| black cardboard filler | General stationery supplier | we used 2 fillers on each side to cover the limits of the plexyglass, avoiding bright edges | |
| M6 12 mm screws | Edmund Optics | ||
| High speed camera (on a tripod) | |||
| Blackfly S USB3 | FLIR | #BFS-U3-32S4M-C | This is a reccomendation. The requirement is to record at least 100 frames per second |
| Infinite Horizon Impactor | |||
| Infinite Horizon Impactor | Precision Systems and Instrumentation, LLC. | #0400 | |
| Lens | |||
| Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mm | Nikon | #1929 | This lens is reccomended, however other lens can be used. Make sure it contains a large aperture (i.e., smaller F-stop values), to capture fTIR signals |
| Software | |||
| MATLAB R2022b | MathWorks | ||
| Python 3.9.13 | Python Software Foundation | ||
| Anaconda Navigator 2.1.4 | Anaconda, Inc. | ||
| Spyder 5.1.5 | Spyder Project Contributors | ||
| Walkway wall | |||
| 2 large rectagular acrilics with 100 x 15 cm | Any bricolage convenience store | ||
| 2 Trapezian acrilic laterals with 6-10 length x 15 cm height | Any bricolage convenience store | ||
| GitHub Materials | |||
| Folder name | URL | ||
| Boxplots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots | Script to create Boxplots | |
| Docs | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs | Additional documents | |
| Heatmap | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps | Script to create heatmap | |
| Matlat script | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20Script | MouseWalker matlab script | |
| PCA | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plots | Script to perform Principal Component Analysis | |
| Raw data Plots | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20Plots | Script to create Raw data plots | |
| Residual Analysis | https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_Analysis | Code to compute residuals from Raw data |
References
- Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
- Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
- Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
- Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
- Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
- Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A.
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
- Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
- Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741 (2020).
- Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204 (2009).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002 (2021).
- Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204 (2014).
- Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541 (2022).
- Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
- vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
- Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
- Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
- Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356 (2020).
- Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).
