En præcis og kvantificerbar metode til indsamling af hæmolymp fra små leddyr

Summary

Vi beskriver en metode til effektivt at indsamle kvantificerbar hæmolymp fra små leddyr til efterfølgende analyse.

Abstract

Arthropoder er kendt for at overføre en række vira af medicinsk og landbrugsmæssig betydning gennem deres hæmolymfe, hvilket er afgørende for virusoverførsel. Hemolymph samling er den grundlæggende teknologi til at studere virus-vektorinteraktioner. Her beskriver vi en ny og enkel metode til kvantitativ indsamling af hæmolymp fra små leddyr ved hjælp af Laodelphax striatellus (den lille brune plantehoppe, SBPH) som forskningsmodel, da denne leddyr er hovedvektoren for risstribet virus (RSV). I denne protokol begynder processen med forsigtigt at klemme det ene ben af den frosne leddyr med finspidset pincet og trykke hæmolympen ud af såret. Derefter bruges en simpel mikropipette bestående af en kapillær og en pipettepære til at opsamle den transudative hæmoolymp fra såret i overensstemmelse med princippet om kapillærkræfter. Endelig kan den opsamlede hæmoolymp opløses i en specifik buffer til yderligere undersøgelse. Denne nye metode til indsamling af hæmoolymp fra små leddyr er et nyttigt og effektivt værktøj til yderligere forskning i arbovirus og vektorvirusinteraktioner.

Introduction

Både dyre- og plantevirus kan overføres af leddyr, og disse vira udgør en alvorlig trussel mod menneskers sundhed og forårsager enorme økonomiske tab i landbruget ^1,2,3. Det er vigtigt, at leddyrhæmolymfen, der tjener som kredsløbssystemet og et vitalt element i immunsystemet hos leddyr, spiller en vigtig rolle i reguleringen af arboviral transmission. Virus erhvervet gennem leddyrtarmene transporteres kun til andre væv efter vellykket flugt fra det ugunstige hæmolympiske miljø 4,5,6,7. Livscyklussen for vira i leddyrhæmolympen involverer virusoverlevelse i væskeplasmaet, indtræden i hæmocytten og transport til andre væv, og forskellige virusvektorinteraktionsmekanismer forekommer i hæmoolympen 8,9,10,11,12. For eksempel er SBPH’s vertikale transmission af RSV afhængig af en molekylær interaktion mellem SBPH vitellogeninproteinet og RSV (risstribet virus) capsidprotein^13,14. Nogle vira kan undslippe hæmolympens immunrespons ved at binde specifikke vektorfaktorer^15,16,17,18. Derfor er det vigtigt at undersøge vektorvirusinteraktioner i leddyrs hæmoolymp for at udvikle en bedre forståelse af arbovirusoverførsel.

Hæmolympen af nogle små insekter, såsom planthoppers, leafhoppers og nogle myg, er vanskelig at samle på grund af deres størrelse. For at løse dette problem er der udviklet flere metoder til at indsamle hæmolymfe, herunder indsættelse af en sprøjtenål direkte i insektkroppen for at ekstrahere et mikrovolumen af hæmolymfen, opsamling af ekssudat fra sårstedet med finspidset pincet og direkte centrifugering. Disse metoder har muliggjort måling af relative genekspressionsniveauer og virale titere inden for hæmoolympen 19,20,21. Imidlertid er en effektiv metode til kvantificering af hæmoolympvolumen, som er nødvendig for hæmocytotælling, proteinkvantificering og enzymaktivitetsanalyse, i øjeblikket ikke tilgængelig for disse små insekter.

SBPH (lille brun planthopper) er en type lille insektvektor med en kropslængde på ca. 2-4 mm. SBPH er i stand til at overføre en række plantevirus, herunder RSV, majs ru dværgvirus og ris sort stribet dværgvirus^22,23,24. Samspillet mellem SBPH og RSV er blevet undersøgt i dybden i løbet af det sidste årti. For at lette arbejdet med SBPH’er udviklede vi en ny og enkel metode til indsamling af hæmolymfe. Denne metode, der er baseret på princippet om kapillærkræfter, bruger en kapillær med et skalamærke til at erhverve insektets hæmoolymp på en præcis og kvantificerbar måde. Dette giver os mulighed for effektivt at indsamle et bestemt volumen hæmolymp fra små insekter og studere hæmolympmiljøet for små vektorer mere detaljeret.

Protocol

1. Insektopdræt Hæv SBPH’erne, der anvendes i dette eksperiment i risplanter (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 risplanter i en inkubator (65 mm x 200 mm), og dyrk ved 25 °C under en 16 timers lys/8 timers mørk fotoperiode. 2. Dissektion af SBPH’erne til hæmoolympisk indsamling Sæt SBPH’erne i et centrifugerør, og læg dem i et isbad i 10-30 minutter.BEMÆRK: Anbring ikke SBPH’erne i isbadet i mindre end 10 mi…

Representative Results

Mikropipette model og hæmoolympisk samlingVi har udviklet en simpel mikropipette, hvis virkning er baseret på kapillarrørets kapillærkræfter. Mikropipetten består af et kapillarrør og en pipettepære (figur 1A). Kapillarrør fås i forskellige volumenstørrelser fra 1 μL til 20 μL, og kapillarrørvolumenerne vælges i henhold til kravene. Kapillarrør med mindre volumener foreslås ikke, fordi de ekstra fine åbninger i rør med mindre volumen kan gøre det vans…

Discussion

Hemolymph er mediet i kredsløbssystemet hos leddyr, og arbovirus kan kun invadere andre leddyrvæv, hvis de er i stand til at overleve det fjendtlige hæmolympiske miljø. Indsamling af en højkvalitetsprøve af hæmoolymp er det første skridt i at studere vektorvirusinteraktionerne, der forekommer i hæmolymfen. Det er blevet rapporteret, at insekt hæmoolymp kan opnås fra flere steder på insektets krop, herunder et sår på forbenet, et mindre snit i hovedområdet eller et tåresår ved maven^26,27…

Materials

10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation