Summary
Vi beskriver en metode til effektivt at indsamle kvantificerbar hæmolymp fra små leddyr til efterfølgende analyse.
Abstract
Arthropoder er kendt for at overføre en række vira af medicinsk og landbrugsmæssig betydning gennem deres hæmolymfe, hvilket er afgørende for virusoverførsel. Hemolymph samling er den grundlæggende teknologi til at studere virus-vektorinteraktioner. Her beskriver vi en ny og enkel metode til kvantitativ indsamling af hæmolymp fra små leddyr ved hjælp af Laodelphax striatellus (den lille brune plantehoppe, SBPH) som forskningsmodel, da denne leddyr er hovedvektoren for risstribet virus (RSV). I denne protokol begynder processen med forsigtigt at klemme det ene ben af den frosne leddyr med finspidset pincet og trykke hæmolympen ud af såret. Derefter bruges en simpel mikropipette bestående af en kapillær og en pipettepære til at opsamle den transudative hæmoolymp fra såret i overensstemmelse med princippet om kapillærkræfter. Endelig kan den opsamlede hæmoolymp opløses i en specifik buffer til yderligere undersøgelse. Denne nye metode til indsamling af hæmoolymp fra små leddyr er et nyttigt og effektivt værktøj til yderligere forskning i arbovirus og vektorvirusinteraktioner.
Introduction
Både dyre- og plantevirus kan overføres af leddyr, og disse vira udgør en alvorlig trussel mod menneskers sundhed og forårsager enorme økonomiske tab i landbruget 1,2,3. Det er vigtigt, at leddyrhæmolymfen, der tjener som kredsløbssystemet og et vitalt element i immunsystemet hos leddyr, spiller en vigtig rolle i reguleringen af arboviral transmission. Virus erhvervet gennem leddyrtarmene transporteres kun til andre væv efter vellykket flugt fra det ugunstige hæmolympiske miljø 4,5,6,7. Livscyklussen for vira i leddyrhæmolympen involverer virusoverlevelse i væskeplasmaet, indtræden i hæmocytten og transport til andre væv, og forskellige virusvektorinteraktionsmekanismer forekommer i hæmoolympen 8,9,10,11,12. For eksempel er SBPH's vertikale transmission af RSV afhængig af en molekylær interaktion mellem SBPH vitellogeninproteinet og RSV (risstribet virus) capsidprotein13,14. Nogle vira kan undslippe hæmolympens immunrespons ved at binde specifikke vektorfaktorer15,16,17,18. Derfor er det vigtigt at undersøge vektorvirusinteraktioner i leddyrs hæmoolymp for at udvikle en bedre forståelse af arbovirusoverførsel.
Hæmolympen af nogle små insekter, såsom planthoppers, leafhoppers og nogle myg, er vanskelig at samle på grund af deres størrelse. For at løse dette problem er der udviklet flere metoder til at indsamle hæmolymfe, herunder indsættelse af en sprøjtenål direkte i insektkroppen for at ekstrahere et mikrovolumen af hæmolymfen, opsamling af ekssudat fra sårstedet med finspidset pincet og direkte centrifugering. Disse metoder har muliggjort måling af relative genekspressionsniveauer og virale titere inden for hæmoolympen 19,20,21. Imidlertid er en effektiv metode til kvantificering af hæmoolympvolumen, som er nødvendig for hæmocytotælling, proteinkvantificering og enzymaktivitetsanalyse, i øjeblikket ikke tilgængelig for disse små insekter.
SBPH (lille brun planthopper) er en type lille insektvektor med en kropslængde på ca. 2-4 mm. SBPH er i stand til at overføre en række plantevirus, herunder RSV, majs ru dværgvirus og ris sort stribet dværgvirus22,23,24. Samspillet mellem SBPH og RSV er blevet undersøgt i dybden i løbet af det sidste årti. For at lette arbejdet med SBPH'er udviklede vi en ny og enkel metode til indsamling af hæmolymfe. Denne metode, der er baseret på princippet om kapillærkræfter, bruger en kapillær med et skalamærke til at erhverve insektets hæmoolymp på en præcis og kvantificerbar måde. Dette giver os mulighed for effektivt at indsamle et bestemt volumen hæmolymp fra små insekter og studere hæmolympmiljøet for små vektorer mere detaljeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insektopdræt
- Hæv SBPH'erne, der anvendes i dette eksperiment i risplanter (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 risplanter i en inkubator (65 mm x 200 mm), og dyrk ved 25 °C under en 16 timers lys/8 timers mørk fotoperiode.
2. Dissektion af SBPH'erne til hæmoolympisk indsamling
- Sæt SBPH'erne i et centrifugerør, og læg dem i et isbad i 10-30 minutter.
BEMÆRK: Anbring ikke SBPH'erne i isbadet i mindre end 10 minutter, ellers kan insekterne genoplive. - Placer en frossen SBPH på et glasglas (se Materialetabel) under et stereomikroskop (se Materialetabel) med maven opad. Juster fokus på insektets seks ben.
- Forbered to pincetter med høj præcision (se Materialetabel) med ultrafine spidser. Brug en pincet til at trykke ned på insektets krop for at holde den på plads, og brug den anden til forsigtigt at trække et af benene ud af insektet.
BEMÆRK: For insekter med en hård skal kan en oftalmisk skalpel bruges til at afskære et af benene. - Tryk forsigtigt på insektets bryst med en pincet for at få hæmolympen til at strømme ud gennem såret.
BEMÆRK: Hæmolympen præsenterer sig som gennemsigtige dråber uden synlig hvid flokkulering. Kassér lipidet, hvis der er nogen hvid flokkulering, som repræsenterer fedt kropsforurening.
3. Hemolymph samling ved hjælp af mikropipetter
- Forbered en mikropipette. Anbring et kapillarrør (se materialetabel) med et volumen på 1 μL i pipettepæren (se materialetabel). For nøjagtige målinger skal du sikre dig, at skalalinjen er synlig.
BEMÆRK: Et lille hul på toppen af pipettepæren er nødvendigt. - Når du samler hæmolymfen, skal du holde mikropipettens pipettepære og placere kapillarrøret tæt på insektsåret. Saml hæmolympen, der udstråler fra såret ved blot at røre spidsen af kapillæret til hæmolymfen.
- Bloker det lille hul på toppen af pipettepæren lidt med fingeren for at stoppe absorptionsprocessen, når væsken inde i kapillarrøret når den ønskede skalalinje.
BEMÆRK: Saml en prøve på 1 μL hæmoolymp uophørligt og hurtigt for at undgå lipidforurening og rørtilslutning. - Tryk på pipettepæren for at udlede den opsamlede hæmoolymp i 100 μL PBS-buffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/LNa2HPO4, 1,4 mmol/L KH2PO 4, pH 7,2-7,4).
BEMÆRK: Kapillarrøret indsættes i PBS-bufferen. - Skift til et nyt kapillarrør, når der indsamles en anden 1 μL prøve af hæmolymfe.
4. Coomassie blå farvning
- Der indsamles 3 hæmolympiske prøver med samme volumen (1 μL) fra larver i 3. trin i henhold til protokollerne beskrevet i trin 3, og den opsamlede hæmoolymp udledes i PBS-bufferen for at opnå et samlet volumen på 100 μL.
- Tilsæt 25 μL 5x proteinbelastningsbuffer (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W / V SDS, 0,05% W / V bromphenolblå, 50% W / V glycerol, 5% W / V β-mercaptoethanol) i 100 μL af de fortyndede hæmolymphprøver, og opvarm for at denaturere proteinerne.
- Læg 20 μL af de kogte prøver på en 10% SDS-PAGE proteingel (se materialetabel) for at adskille proteinerne.
- Plet gelen i en Coomassie Blue-opløsning (bland 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 med 250 ml isopropanol, 100 ml iseddike og 650 ml ddH2O, og filtrer eventuelle partikler ud ved hjælp af filterpapir) i 1 time ved stuetemperatur, og affarve derefter gelen i 1 time med affarvningsopløsning (100 ml eddikesyre, 400 ml methanol, 500 ml ddH2O).
5. Bestemmelse af proteinkoncentration
- 10 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) fortyndes til 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml og 0,3125 mg/ml med PBS-buffer ved hjælp af tofoldsfortyndingsmetoden.
- Opsug 5 μL PBS-buffer og hver koncentration af BSA-opløsninger i trin 5.1, tilsæt 1 ml 1x Bradford-farvestofreagens (se materialetabel), og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur. Brug PBS-buffer i Bradford-farvestofreagens som kontrol og nul ved OD = 595 nm. Mål absorbansværdierne for hver af de resterende proteinkoncentrationer, og lav en standardkurve.
- Tilsæt 1 μL hæmoolymp fra larve, hun- eller han-SBPH'er i 100 μL PBS-buffer, og centrifuger derefter prøverne ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne hæmocytterne.
- 90 μl supernatant suges til et nyt centrifugeglas, og supernatantens absorbansværdier måles efter anvisningerne i trin 5.2.
- Beregn proteinkoncentrationerne af hæmoolympprøverne i henhold til standardkurvens regressionsligning. Inkluder tre biologiske replikater med tre tekniske replikater i eksperimenterne.
6. Mikroskopiske detektioner
- Brug mikropipetter til at indsamle hæmoolymp fra 10-15 SBPH'er på forskellige udviklingsstadier. Tilsæt den opsamlede hæmoolymp i et rør indeholdende 20 μL 4% paraformaldehydopløsning (se materialetabel). Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 30 minutter for at fiksere hæmolymfen.
- Pipette 20 μL faste hæmocytter på midten af et objektglas belagt med silan (se materialetabel).
- Tør dråben op i et diastørrestativ.
BEMÆRK: Undgå overdreven tørring. - Prøven dækkes med guldantifadereagens 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (se materialetabellen), og objektglasset inspiceres under et omvendt mikroskop (se materialetabellen).
7. Kvantificering af celler
- Opsaml 1 μL hæmoolymp fra SBPH'erne med en mikropipette, og opløs den i 20 μL PBS-buffer.
- Fortynd hæmolympprøverne fem gange med PBS-buffer.
- Pipette 20 μL hæmolympisk opløsning ind i midten af celletællekammeret (se materialetabel). Dæk dråben med en dæksel (se materialetabel).
- Tæl cellerne i de fem kvadrater på celletællekammeret (supplerende figur 1) under et omvendt mikroskop (se materialetabel). Inkluder tre biologiske replikater med tre tekniske replikater i hvert af eksperimenterne.
Celler/μL = samlet antal fem midterste kvadrater × 5 × fortyndingsfaktor × 104
8. Statistiske analyser
- Udfør statistiske analyser med den tilsvarende software (se Materialetabel). Opret en ny fil, og vælg kolonnen, importer dataene, og generer et punktdiagram med en søjle.
- Beregn middelværdien og SD for hver gruppe data ved hjælp af kolonnestatistik, og brug et envejs ANOVA værktøj til at evaluere betydningen af forskellene mellem grupperne. Bestem middelværdien og SD fra tre biologiske replikater med tre uafhængige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikropipette model og hæmoolympisk samling
Vi har udviklet en simpel mikropipette, hvis virkning er baseret på kapillarrørets kapillærkræfter. Mikropipetten består af et kapillarrør og en pipettepære (figur 1A). Kapillarrør fås i forskellige volumenstørrelser fra 1 μL til 20 μL, og kapillarrørvolumenerne vælges i henhold til kravene. Kapillarrør med mindre volumener foreslås ikke, fordi de ekstra fine åbninger i rør med mindre volumen kan gøre det vanskeligt at absorbere væske såsom hæmolymfe. Pipettepæren indeholder et hul på toppen, der ikke kan tilsluttes under hæmompsamlingen. Denne pipettepære er praktisk til at holde mikropipetten under væskeopsamlingen (figur 1B) og hjælper også med at overføre den opsamlede væske fra kapillarrøret til opsamlingsbufferen.
For let at samle hæmolymp blev SBPH'erne i dette arbejde først frosset i is eller i køleskabet. Disse frosne SBPH'er blev derefter lokaliseret på et dias under et stereomikroskop, og et af benene på hver SBPH blev trukket af med finspidset pincet (figur 1C). For at sikre et stort sår og optimal hæmoolympisk samling er det bedst at trække benet af ved roden (figur 1Ca, b). For at minimere risikoen for kontaminering af fedtlegemet blev der kun opsamlet klare væskedråber uden hvid flokkulering (figur 1Cc). Mikropipetten blev brugt til at absorbere de ønskede mængder hæmolymp (figur 1Cd). For at opsamle 1 μL hæmolymfe skulle ca. 30-40 larve-SBPH'er eller 8-15 voksne SPBH'er dissekeres.
Analyse af den indsamlede hæmoolymp
For at vurdere mikropipettens nøjagtighed som en metode til evaluering af mængden af opsamlet hæmolymfe testede vi proteinkoncentrationerne i forskellige prøver. Hemolymph fra larver blev opsamlet ved hjælp af en mikropipette med et kapillærvolumen på 1 μL, og tre proteinprøver blev opsamlet separat og testet ved at køre en SDS-PAGE gel. Resultaterne viste, at mængden af protein i de tre baner var næsten ens (figur 2A). For larver var det totale proteinindhold 3,707 mg/ml ± 1,382 mg/ml. Vi indsamlede også den samme mængde hæmoolymp fra voksne kvindelige og mandlige SBPH'er, og disse viste proteinkoncentrationer på henholdsvis 3.515 mg / ml ± 1.400 mg / ml og 3.621 mg / ml ± 0.860 mg / ml (tabel 1). Der var ingen signifikante forskelle i proteinet mellem de tre prøver (figur 2B).
Derudover observerede vi også hæmocytterne inde i den indsamlede larvehæmolymp for at vurdere kvaliteten og renheden af hæmolympprøverne. Hæmocytterne varierede i størrelse mellem 2-20 nm, og der blev ikke påvist noget fedtlegeme (figur 2C). Størstedelen af de identificerede celler var plasmatocytter, der spænder fra 5-15 nm i diameter og ofte optrådte i aggregater25. Vi talte derefter cellekoncentrationerne af hæmolympen fra larver, voksne hunner og voksne hanner, og de identificerede cellekoncentrationer var henholdsvis 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL og 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL (tabel 2). Hæmocytocelletallet i larverne, voksne kvinder og voksne mænd viste ingen signifikante forskelle (figur 2D). Disse resultater indikerer, at mikropipetteindsamlingsmetoden er en pålidelig og præcis måde at indsamle hæmoolymp fra SBPH'er på.
Figur 1: Skematisk oversigt over mikropipettemodellen og hemolymphsamlingen. A) Mikropipettesammensætning. Mikropipetten består af en kapillær og en pipettepære. Kapillærvolumenerne varierer fra 1-20 μL. Pipettepæren har et lille hul øverst og nederst. Kapillæren indsættes i bundhullet, og skalaen er synlig. (B) Oversigtsdiagram over hemolymph indsamling med en mikropipette. Insektmaven holdes opad, mens et ben løsnes, hæmolympisk udstrømning induceres, og hæmolympen opsamles i pipetten under et stereomikroskop. (C) Proces med hæmoolympisk indsamling med en mikropipette. Et af benene trækkes af ved roden med finspidset pincet (a), og insektets krop presses for at få hæmolympen til at strømme ud (b, c). Hæmolympen fra såret opsamles i kapillæren (d). Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af SBPH hæmolymfe . (A) Coomassie Blue farvning, der viser tre replikater af opsamlet larvehæmolymfe. Hem indikerer hæmolymph. (B) Samlede proteinkoncentrationer af hæmolympen hos larve, kvindelige og mandlige SBPH'er. (C) Mikroskopiske billeder, der viser cellerne til stede i hæmolympen i SBPH'er ved henholdsvis 20x og 60x forstørrelse. Kernen blev farvet med DAPI (blå). Skalastang = 50 μm. (D) Hæmocyttæthed af larve, kvindelige og mandlige SBPH'er. Gennemsnittet og SD blev beregnet ud fra tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Hæmolympen | Proteinkoncentration (mg/ml) |
| Larve | 3.707±1.382 |
| Kvindelig | 3.515±1.400 |
| Mandlig | 3.621±0.860 |
Tabel 1: Proteinkoncentrationer af hæmolymp fra forskellige SBPH'er. Dataene blev opnået fra tre biologiske replikater.
| Hæmolympen | Cellekoncentration (105 / μL) |
| Larve | 1.794±0.614 |
| Kvindelig | 1.256±0.603 |
| Mandlig | 1.553±0.474 |
Tabel 2: De samlede koncentrationer af hæmocytter i hæmolympen fra forskellige SBPH'er. Dataene blev opnået fra tre biologiske replikater.
Supplerende figur 1: Bestemmelse af antallet af celler. De fire hjørnefirkanter (1, 2, 3 og 4) og den centrale firkant (5) tælles i celletællekammeret. For grænseceller tælles kun de to grænser (øverst og venstre). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemolymph er mediet i kredsløbssystemet hos leddyr, og arbovirus kan kun invadere andre leddyrvæv, hvis de er i stand til at overleve det fjendtlige hæmolympiske miljø. Indsamling af en højkvalitetsprøve af hæmoolymp er det første skridt i at studere vektorvirusinteraktionerne, der forekommer i hæmolymfen. Det er blevet rapporteret, at insekt hæmoolymp kan opnås fra flere steder på insektets krop, herunder et sår på forbenet, et mindre snit i hovedområdet eller et tåresår ved maven26,27,28,29. Forskellige indsamlingsmetoder kan fungere for visse erhvervelser. Metoden, der involverer at skabe et lille snit i hoved-halsleddet, er mere velegnet til hæmolympisk opsamling fra store insekter som honningbier26. Oprettelse af et sår i SBPH's hovedområde er udfordrende, da det kan skade andre organer og indføre forurening fra andre væv. Efter at have lavet et tåresår i maven, nedsænkes insekterne i bufferen, og derefter centrifugeres bufferen for at ekstrahere hæmolymfen. Dette er en bekvem metode til at samle lipider fra små insekter21. Men da der er en høj mængde fedtlegeme i hæmokoel af SBPH'er, kan et sår på kropsdelen forårsage fedtkropslækage fra såret og føre til forurening af hæmolymfen. Denne metode er mere egnet til opsamling af hæmoolymp fra voksne SBPH'er, som har mindre fedtlegeme end larver. For effektivt at forhindre fedtkropsforurening anbefales det at lave et sår på benstedet i stedet for direkte på kroppen. I tidligere undersøgelser af SBPH hæmolymfe blev finspidsede pincetter brugt til at lette opsamlingen af små dråber væske fra såret13. Selvom den indsamlede hæmoolymp var fri for urenheder, blev mængden af hæmolymp ikke målt. I denne undersøgelse udviklede vi en simpel mikropipette, der kan bruges til nøjagtigt og kvantitativt at indsamle hæmoolymp fra meget små insektvektorer.
For vellykket hæmoolympisk samling skal der tages højde for flere kritiske trin. For det første er det vigtigt at bedøve insekterne ved 4 ° C i 15 minutter for at producere hæmolymp, der er fri for fedt krop. For det andet er det enklere at opnå ren hæmoolymp ved at trække det første ben af. For det tredje skal samlingen af hæmolympen ske på en kontinuerlig og hurtig måde, da ellers kan hæmolympen koagulere i bunden og blokere kapillæren.
Kapillæropsamlingsteknikken har været meget udbredt til indsamling af dyreblod30,31. Vi ændrede teknikken, så den passer til de forskellige egenskaber ved insekthæmolymfe. Da SBPH'er har en lille kropsstørrelse, blev der valgt en kapillær med et minimalt volumen på 1 μL. Brug af kapillær med et volumen lavere end 1 μL anbefales ikke. Det er bemærkelsesværdigt, at hæmolymp indeholder en høj densitet af proteiner og et betydeligt antal celler (figur 2), som hæver dens væsketæthed og gør det vanskeligt at absorbere hæmolymp via kapillærer med mindre volumener.
Metoden til opsamling af hæmolymp ved kapillær er en enkel, omkostningseffektiv og levedygtig teknik, der muliggør pålidelig og præcis kvantificering af hæmolymfen. Denne nyudviklede metode kan også anvendes til opsamling af andre sporvæsker fra små vektorer, såsom honningdug. Det er vigtigt at fremhæve, at insekterne forbliver i live efter udvinding af hæmoolymp ved hjælp af denne metode. Dette er gavnligt for undersøgelser, der involverer andre insektorganer eller for gentagen hæmolympisk indsamling. Dette arbejde præsenterer en værdifuld teknologi til undersøgelse af entomologi og virusvektorinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Key R&D Program of China (nr. 2022YFD1401700) og af National Science Foundation of China (nr. 32090013 og nr. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
