Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Summary

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Abstract

Os artrópodes são conhecidos por transmitir uma variedade de vírus de importância médica e agrícola através de sua hemolinfa, que é essencial para a transmissão do vírus. A coleta de hemolinfa é a tecnologia básica para o estudo das interações vírus-vetor. Aqui, descrevemos um método novo e simples para a coleta quantitativa de hemolinfa de pequenos artrópodes usando Laodelphax striatellus (a cigarrinha marrom pequena, SBPH) como modelo de pesquisa, já que este artrópode é o principal vetor do vírus da listra de arroz (VSR). Neste protocolo, o processo começa beliscando suavemente uma perna do artrópode congelado com pinças de ponta fina e pressionando a hemolinfa para fora da ferida. Em seguida, uma micropipeta simples composta por um capilar e um bulbo de pipeta é usada para coletar a hemolinfa transudativa da ferida de acordo com o princípio das forças capilares. Finalmente, a hemolinfa coletada pode ser dissolvida em um tampão específico para estudo posterior. Este novo método de coleta de hemolinfa de pequenos artrópodes é uma ferramenta útil e eficiente para futuras pesquisas sobre arbovírus e interações vetor-vírus.

Introduction

Tanto os vírus animais quanto os vegetais podem ser transmitidos por artrópodes, e esses vírus representam uma grave ameaça à saúde humana e causam enormes perdas econômicas na agricultura ^1,2,3. É importante ressaltar que a hemolinfa dos artrópodes, que serve como sistema circulatório e um elemento vital do sistema imunológico nos artrópodes, desempenha um papel importante na regulação da transmissão das arbovirais. Os vírus adquiridos através do intestino dos artrópodes são transportados para outros tecidos somente após escaparem com sucesso do ambiente adverso da hemolinfa 4,5,6,7. O ciclo de vida dos vírus na hemolinfa dos artrópodes envolve a sobrevivência do vírus no plasma fluido, a entrada no hemócito e o transporte para outros tecidos, e vários mecanismos de interação vírus-vetor ocorrem na hemolinfa 8,9,10,11,12. Por exemplo, a transmissão vertical do VSR pelo SBPH é dependente de uma interação molecular entre a proteína vitelogenina SBPH e a proteína capsídeo do VSR (rice stripe virus)^13,14. Alguns vírus podem escapar da resposta imune da hemolinfa ligando-se a fatores vetoriais específicos15,16,17,18. Portanto, investigar as interações vetor-vírus na hemolinfa de artrópodes é importante para o melhor entendimento da transmissão de arbovírus.

A hemolinfa de alguns pequenos insetos, como cigarrinhas, cigarrinhas e alguns mosquitos, é difícil de coletar devido ao seu tamanho. Para resolver essa questão, vários métodos foram desenvolvidos para coletar hemolinfa, incluindo a inserção de uma agulha de seringa diretamente no corpo do inseto para extrair um microvolume da hemolinfa, coleta de exsudato do local da ferida com pinça de ponta fina e centrifugação direta. Esses métodos têm possibilitado a mensuração dos níveis relativos de expressão gênica e dos títulos virais dentro da hemolinfa 19,20,21. No entanto, um método eficaz para quantificar o volume da hemolinfa, necessário para contagem de hemócitos, quantificação de proteínas e análise da atividade enzimática, não está atualmente disponível para esses pequenos insetos.

O SBPH (pequena cigarrinha marrom) é um tipo de pequeno inseto vetor com um comprimento do corpo de cerca de 2-4 mm. O SBPH é capaz de transmitir uma variedade de vírus de plantas, incluindo o VSR, o vírus da anã áspera do milho e o vírus da anã estriada preta do arroz^22,23,24. A interação entre o SBPH e o VSR tem sido estudada em profundidade na última década. Para facilitar o trabalho com SBPHs, desenvolvemos um método novo e simples de coleta de hemolinfa. Este método, que se baseia no princípio das forças capilares, utiliza um capilar com uma marca de escala para adquirir a hemolinfa do inseto de forma precisa e quantificável. Isso nos permite coletar um volume específico de hemolinfa de pequenos insetos de forma eficiente e estudar o ambiente da hemolinfa de pequenos vetores com mais detalhes.

Protocol

1. Criação de insetos Elevar os PBPs utilizados neste experimento em mudas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 mudas de arroz em estufa (65 mm x 200 mm) e crescer a 25 °C sob fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro. 2. Dissecção das SBPHs para coleta de hemolinfa Coloque os SBPHs em um tubo de centrífuga e coloque-os em um banho de gelo por 10-30 min.NOTA: Não coloque os SBPHs no banho de gelo por meno…

Representative Results

Modelo de micropipeta e coleta de hemolinfaDesenvolvemos uma micropipeta simples cuja ação é baseada nas forças capilares do tubo capilar. A micropipeta é composta por um tubo capilar e um bulbo de pipeta (Figura 1A). Os tubos capilares estão disponíveis em diferentes tamanhos de volume, variando de 1 μL a 20 μL, e os volumes dos tubos capilares são selecionados de acordo com as necessidades. Tubos capilares com volumes menores não são sugeridos, pois as aber…

Discussion

A hemolinfa é o meio do sistema circulatório nos artrópodes, e os arbovírus só podem invadir outros tecidos dos artrópodes se forem capazes de sobreviver ao ambiente hostil da hemolinfa. A coleta de uma amostra de hemolinfa de alta qualidade é o primeiro passo para estudar as interações vetor-vírus que ocorrem na hemolinfa. Tem sido relatado que a hemolinfa do inseto pode ser obtida de vários locais do corpo do inseto, incluindo uma ferida na perna dianteira, uma pequena incisão na área da cabeça ou uma fer…

Materials

10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation