Summary
Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.
Abstract
Os artrópodes são conhecidos por transmitir uma variedade de vírus de importância médica e agrícola através de sua hemolinfa, que é essencial para a transmissão do vírus. A coleta de hemolinfa é a tecnologia básica para o estudo das interações vírus-vetor. Aqui, descrevemos um método novo e simples para a coleta quantitativa de hemolinfa de pequenos artrópodes usando Laodelphax striatellus (a cigarrinha marrom pequena, SBPH) como modelo de pesquisa, já que este artrópode é o principal vetor do vírus da listra de arroz (VSR). Neste protocolo, o processo começa beliscando suavemente uma perna do artrópode congelado com pinças de ponta fina e pressionando a hemolinfa para fora da ferida. Em seguida, uma micropipeta simples composta por um capilar e um bulbo de pipeta é usada para coletar a hemolinfa transudativa da ferida de acordo com o princípio das forças capilares. Finalmente, a hemolinfa coletada pode ser dissolvida em um tampão específico para estudo posterior. Este novo método de coleta de hemolinfa de pequenos artrópodes é uma ferramenta útil e eficiente para futuras pesquisas sobre arbovírus e interações vetor-vírus.
Introduction
Tanto os vírus animais quanto os vegetais podem ser transmitidos por artrópodes, e esses vírus representam uma grave ameaça à saúde humana e causam enormes perdas econômicas na agricultura 1,2,3. É importante ressaltar que a hemolinfa dos artrópodes, que serve como sistema circulatório e um elemento vital do sistema imunológico nos artrópodes, desempenha um papel importante na regulação da transmissão das arbovirais. Os vírus adquiridos através do intestino dos artrópodes são transportados para outros tecidos somente após escaparem com sucesso do ambiente adverso da hemolinfa 4,5,6,7. O ciclo de vida dos vírus na hemolinfa dos artrópodes envolve a sobrevivência do vírus no plasma fluido, a entrada no hemócito e o transporte para outros tecidos, e vários mecanismos de interação vírus-vetor ocorrem na hemolinfa 8,9,10,11,12. Por exemplo, a transmissão vertical do VSR pelo SBPH é dependente de uma interação molecular entre a proteína vitelogenina SBPH e a proteína capsídeo do VSR (rice stripe virus)13,14. Alguns vírus podem escapar da resposta imune da hemolinfa ligando-se a fatores vetoriais específicos15,16,17,18. Portanto, investigar as interações vetor-vírus na hemolinfa de artrópodes é importante para o melhor entendimento da transmissão de arbovírus.
A hemolinfa de alguns pequenos insetos, como cigarrinhas, cigarrinhas e alguns mosquitos, é difícil de coletar devido ao seu tamanho. Para resolver essa questão, vários métodos foram desenvolvidos para coletar hemolinfa, incluindo a inserção de uma agulha de seringa diretamente no corpo do inseto para extrair um microvolume da hemolinfa, coleta de exsudato do local da ferida com pinça de ponta fina e centrifugação direta. Esses métodos têm possibilitado a mensuração dos níveis relativos de expressão gênica e dos títulos virais dentro da hemolinfa 19,20,21. No entanto, um método eficaz para quantificar o volume da hemolinfa, necessário para contagem de hemócitos, quantificação de proteínas e análise da atividade enzimática, não está atualmente disponível para esses pequenos insetos.
O SBPH (pequena cigarrinha marrom) é um tipo de pequeno inseto vetor com um comprimento do corpo de cerca de 2-4 mm. O SBPH é capaz de transmitir uma variedade de vírus de plantas, incluindo o VSR, o vírus da anã áspera do milho e o vírus da anã estriada preta do arroz22,23,24. A interação entre o SBPH e o VSR tem sido estudada em profundidade na última década. Para facilitar o trabalho com SBPHs, desenvolvemos um método novo e simples de coleta de hemolinfa. Este método, que se baseia no princípio das forças capilares, utiliza um capilar com uma marca de escala para adquirir a hemolinfa do inseto de forma precisa e quantificável. Isso nos permite coletar um volume específico de hemolinfa de pequenos insetos de forma eficiente e estudar o ambiente da hemolinfa de pequenos vetores com mais detalhes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Criação de insetos
- Elevar os PBPs utilizados neste experimento em mudas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 mudas de arroz em estufa (65 mm x 200 mm) e crescer a 25 °C sob fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro.
2. Dissecção das SBPHs para coleta de hemolinfa
- Coloque os SBPHs em um tubo de centrífuga e coloque-os em um banho de gelo por 10-30 min.
NOTA: Não coloque os SBPHs no banho de gelo por menos de 10 min, ou os insetos podem reviver. - Coloque um SBPH congelado em uma lâmina de vidro (ver Tabela de Materiais) sob um estereomicroscópio (ver Tabela de Materiais) com seu abdômen voltado para cima. Ajuste o foco nas seis pernas do inseto.
- Prepare duas pinças de alta precisão (consulte Tabela de Materiais) com pontas ultrafinas. Use uma pinça para pressionar o corpo do inseto para mantê-lo no lugar e use a outra para puxar cuidadosamente uma das pernas do inseto.
NOTA: Para insetos com uma casca dura, um bisturi oftálmico pode ser usado para cortar uma das pernas. - Pressione suavemente o peito do inseto com uma pinça para fazer a hemolinfa fluir para fora através da ferida.
NOTA: A hemolinfa apresenta-se como gotículas transparentes sem qualquer flocula branca visível. Descarte o lipídio se houver algum flocículo branco, que representa contaminação do corpo gorduroso.
3. Coleta de hemolinfa utilizando micropipetas
- Prepare uma micropipeta. Coloque um tubo capilar (ver Tabela de Materiais) com um volume de 1 μL no bulbo da pipeta (ver Tabela de Materiais). Para medições precisas, certifique-se de que a linha da escala esteja visível.
NOTA: É necessário um pequeno orifício na parte superior da lâmpada da pipeta. - Ao coletar a hemolinfa, segure o bulbo da pipeta da micropipeta e coloque o tubo capilar próximo à ferida do inseto. Coletar a hemolinfa exsudada da ferida simplesmente tocando a ponta do capilar para a hemolinfa.
- Bloqueie ligeiramente o pequeno orifício na parte superior do bulbo da pipeta com o dedo para interromper o processo de absorção quando o líquido dentro do tubo capilar atingir a linha de escala desejada.
NOTA: Coletar uma amostra de 1 μL de hemolinfa incessante e rapidamente para evitar contaminação lipídica e tamponamento do tubo. - Pressione o bulbo da pipeta para descarregar a hemolinfa coletada em 100 μL de tampão PBS (NaCl 137 mmol/L, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
NOTA: O tubo capilar é inserido no tampão PBS. - Mudança para um novo tubo capilar ao coletar outra amostra de 1 μL de hemolinfa.
4. Coloração Coomassie Blue
- Coletar 3 amostras de hemolinfa com o mesmo volume (1 μL) de larvas de 3º estágio de acordo com os protocolos descritos na etapa 3, e descarregar a hemolinfa coletada no tampão PBS para totalizar um volume de 100 μL.
- Adicionar 25 μL de tampão de carga proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% P/V SDS, 0,05% P/V Azul de Bromofenol, 50% P/V glicerol, 5% P/V β-mercaptoetanol) em 100 μL das amostras diluídas de hemolinfa e aquecer para desnaturar as proteínas.
- Carregar 20 μL das amostras fervidas num gel proteico SDS-PAGE a 10% (ver Tabela de Materiais) para separar as proteínas.
- Manchar o gel numa solução de Coomassie Blue (misturar 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 com 250 ml de isopropanol, 100 ml de ácido acético glacial e 650 ml de ddH2O, e filtrar quaisquer partículas utilizando papel de filtro) durante 1 h à temperatura ambiente e, em seguida, descolorir o gel durante 1 h com solução descolorante (100 ml de ácido acético, 400 mL de metanol, 500 mL de ddH2O).
5. Determinação da concentração de proteínas
- Diluir 10 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) para 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL e 0,3125 mg/mL com tampão PBS usando o método de diluição dupla.
- Aspirar 5 μL de tampão PBS e cada concentração de soluções BSA na etapa 5.1, adicionar 1 mL de 1x reagente corante Bradford (ver Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Use buffer PBS no reagente de corante Bradford como controle, e zero em OD = 595 nm. Meça os valores de absorbância de cada uma das concentrações de proteína restantes e faça uma curva padrão.
- Adicionar 1 μL de hemolinfa de SBPHs larvais, fêmeas ou machos em 100 μL de tampão PBS e, em seguida, centrifugar as amostras a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para remover os hemócitos.
- Aspirar 90 μL de sobrenadante para um novo tubo de centrifugação e medir os valores de absorbância do sobrenadante de acordo com as instruções do passo 5.2.
- Calcular as concentrações proteicas das amostras de hemolinfa de acordo com a equação de regressão da curva padrão. Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas nos experimentos.
6. Detecções microscópicas
- Use micropipetas para coletar hemolinfa de 10-15 SBPHs em diferentes estágios de desenvolvimento. Adicionar a hemolinfa coletada em um tubo contendo 20 μL de solução de paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais). Incubar a mistura à temperatura ambiente por 30 min para fixar a hemolinfa.
- Pipetar 20 μL de hemócitos fixos para o centro de uma lâmina revestida com silano (ver Tabela de Materiais).
- Seque a gota em uma prateleira de secagem de lâmina.
OBS: Evite secagem excessiva. - Cobrir a amostra com o reagente antifade de ouro 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ver Tabela de Materiais) e inspecionar a lâmina sob um microscópio invertido (ver Tabela de Materiais).
7. Quantificação celular
- Coletar 1 μL de hemolinfa das SBPHs com uma micropipeta e dissolvê-la em 20 μL de tampão PBS.
- Diluir as amostras de hemolinfa cinco vezes com tampão PBS.
- Pipetar 20 μL de solução de hemolinfa para o centro da câmara de contagem de células (ver Tabela de Materiais). Cubra a gota com uma lamínula (ver Tabela de Materiais).
- Contar as células nos cinco quadrados da câmara de contagem de células (Figura 1 Suplementar), em microscópio invertido (ver Tabela de Materiais). Incluir três réplicas biológicas com três réplicas técnicas em cada um dos experimentos.
Células/μL = contagem total de cinco quadrados médios × fator de diluição de 5 × × 104
8. Análise estatística
- Realizar análises estatísticas com o software correspondente (ver Tabela de Materiais). Crie um novo arquivo, selecione a coluna, importe os dados e gere um gráfico de dispersão com uma barra.
- Calcule a média e o DP para cada grupo de dados usando estatísticas de coluna e use uma ferramenta ANOVA unidirecional para avaliar a significância das diferenças entre os grupos. Determinar a média e o DP a partir de três réplicas biológicas com três experimentos independentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modelo de micropipeta e coleta de hemolinfa
Desenvolvemos uma micropipeta simples cuja ação é baseada nas forças capilares do tubo capilar. A micropipeta é composta por um tubo capilar e um bulbo de pipeta (Figura 1A). Os tubos capilares estão disponíveis em diferentes tamanhos de volume, variando de 1 μL a 20 μL, e os volumes dos tubos capilares são selecionados de acordo com as necessidades. Tubos capilares com volumes menores não são sugeridos, pois as aberturas extrafinas de tubos de menor volume podem dificultar a absorção de líquidos, como a hemolinfa. O bulbo da pipeta contém um orifício na parte superior que não pode ser entupido durante a coleta da hemolinfa. Essa lâmpada de pipeta é conveniente para segurar a micropipeta durante a coleta do líquido (Figura 1B) e também auxilia na transferência do líquido coletado do tubo capilar para o tampão de coleta.
Para facilitar a coleta da hemolinfa, neste trabalho, as SBPHs foram primeiramente congeladas em gelo ou na geladeira. Essas HPSC congeladas foram então localizadas em uma lâmina sob um estereomicroscópio, e uma das pernas de cada HPSC foi arrancada com uma pinça de ponta fina (Figura 1C). Para garantir uma ferida grande e uma ótima coleção de hemolinfa, o melhor é arrancar a perna na raiz (Figura 1Ca, b). Para minimizar o risco de contaminação pelo corpo adiposo, foram coletadas apenas gotas líquidas claras sem flocula branca (Figura 1Cc). A micropipeta foi utilizada para absorver os volumes desejados de hemolinfa (Figura 1Cd). Para coletar 1 μL de hemolinfa, aproximadamente 30-40 HPSs larvais ou 8-15 HPSP adultas tiveram que ser dissecadas.
Análise da hemolinfa coletada
Para avaliar a acurácia da micropipeta como método de avaliação do volume de hemolinfa coletado, foram testadas as concentrações proteicas de diferentes amostras. A hemolinfa das larvas foi coletada usando uma micropipeta com volume capilar de 1 μL, e três amostras de proteína foram coletadas separadamente e testadas usando um gel de SDS-PAGE. Os resultados mostraram que a quantidade de proteína nas três pistas foi quase igual (Figura 2A). Para as larvas, o teor de proteína total foi de 3,707 mg/mL ± 1,382 mg/mL. Também coletamos o mesmo volume de hemolinfa de SBPHs adultas do sexo feminino e masculino, que apresentaram concentrações proteicas de 3,515 mg/mL ± 1,400 mg/mL e 3,621 mg/mL ± 0,860 mg/mL, respectivamente (Tabela 1). Não houve diferenças significativas na proteína entre as três amostras (Figura 2B).
Além disso, também observamos os hemócitos no interior da hemolinfa larval coletada para avaliar a qualidade e pureza das amostras de hemolinfa. Os hemócitos variaram em tamanho entre 2-20 nm, e nenhum corpo gorduroso foi detectado (Figura 2C). A maioria das células identificadas eram plasmatócitos, variando de 5-15 nm de diâmetro e frequentemente aparecendo em agregados25. Em seguida, foram contadas as concentrações celulares da hemolinfa de larvas, fêmeas adultas e machos adultos, e as concentrações celulares identificadas foram 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL e 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL, respectivamente (Tabela 2). A contagem de células hemocitárias nas larvas, fêmeas adultas e machos adultos não apresentou diferenças significativas (Figura 2D). Esses resultados indicam que o método de coleta de micropipetas é uma maneira confiável e precisa de coletar hemolinfa de HPSs.
Figura 1: Esquema do modelo de micropipeta e coleta de hemolinfa. (A) Composição da micropipeta. A micropipeta é composta por um capilar e um bulbo de pipeta. Os volumes capilares variam de 1-20 μL. A lâmpada da pipeta tem um pequeno orifício na parte superior e inferior. O capilar é inserido no orifício inferior, e a escala é visível. (B) Diagrama geral da coleção de hemolinfa com micropipeta. O abdome do inseto é mantido voltado para cima enquanto uma perna é destacada, o fluxo de hemolinfa é induzido e a hemolinfa é coletada na pipeta sob um estereomicroscópio. (C) Processo de coleta de hemolinfa com micropipeta. Uma das pernas é arrancada na raiz com uma pinça de ponta fina (a), e o corpo do inseto é pressionado para fazer a hemolinfa fluir para fora (b,c). A hemolinfa da ferida é coletada no capilar (d). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise da hemolinfa SBPH. (A) Coloração com azul de Coomassie mostrando três repetições de hemolinfa larval coletada. Hem indica hemolinfa. (B) Concentrações de proteínas totais da hemolinfa de SBPHs larvais, fêmeas e machos. (C) Imagens microscópicas mostrando as células presentes na hemolinfa em SBPHs em aumentos de 20x e 60x, respectivamente. O núcleo foi corado com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. (D) Densidade de hemócitos de SBPHs larvárias, fêmeas e machos. A média e o DP foram calculados a partir de três experimentos independentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Hemolinfa | Concentração de proteínas (mg/mL) |
| Larva | S.307±1.382 |
| Fêmea | 3.515±1.400 |
| Macho | 3,621±0,860 |
Tabela 1: Concentrações proteicas de hemolinfa de diferentes HPSs. Os dados foram obtidos a partir de três repetições biológicas.
| Hemolinfa | Concentração celular (105 / μL) |
| Larva | 1.794±0.614 |
| Fêmea | 1,256±0,603 |
| Macho | 1,553±0,474 |
Tabela 2: Concentrações totais de hemócitos na hemolinfa de diferentes HPSs. Os dados foram obtidos a partir de três repetições biológicas.
Figura suplementar 1: Determinação do número de células. Os quatro quadrados de canto (1, 2, 3 e 4) e o quadrado central (5) são contados na câmara de contagem de células. Para células de borda, apenas os dois limites (superior e esquerdo) são contados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A hemolinfa é o meio do sistema circulatório nos artrópodes, e os arbovírus só podem invadir outros tecidos dos artrópodes se forem capazes de sobreviver ao ambiente hostil da hemolinfa. A coleta de uma amostra de hemolinfa de alta qualidade é o primeiro passo para estudar as interações vetor-vírus que ocorrem na hemolinfa. Tem sido relatado que a hemolinfa do inseto pode ser obtida de vários locais do corpo do inseto, incluindo uma ferida na perna dianteira, uma pequena incisão na área da cabeça ou uma ferida lacrimal no abdome26,27,28,29. Diferentes métodos de coleta podem funcionar para determinadas aquisições. O método que envolve a criação de uma pequena incisão na articulação cabeça-pescoço é mais adequado para a coleta de hemolinfa de insetos de grande porte, como as abelhas26. Criar uma ferida na área da cabeça da SBPH é um desafio, pois pode danificar outros órgãos e introduzir contaminação de outros tecidos. Depois de fazer uma ferida lacrimal no abdômen, os insetos são imersos no tampão e, em seguida, o tampão é centrifugado para extrair a hemolinfa. Este é um método conveniente para coletar lipídios de pequenos insetos21. No entanto, como há uma alta quantidade de corpo gorduroso dentro do hemocelo de SBPHs, uma ferida na parte do corpo pode causar extravasamento de corpo gorduroso da ferida e levar à contaminação da hemolinfa. Este método é mais adequado para coletar hemolinfa de SBPHs adultos, que têm menos corpo gorduroso do que as larvas. Para prevenir eficazmente a contaminação do corpo gordo, recomenda-se fazer uma ferida no local da perna em vez de diretamente no corpo. Em estudos prévios de hemolinfa da HPSS, pinças de ponta fina foram utilizadas para facilitar a coleta de pequenas gotas de líquido da feridaoperatória 13. Embora a hemolinfa coletada estivesse livre de impurezas, o volume de hemolinfa não foi medido. Neste estudo, desenvolvemos uma micropipeta simples que pode ser usada para coletar com precisão e quantitativamente hemolinfa de insetos vetores muito pequenos.
Para o sucesso da coleta de hemolinfa, várias etapas críticas devem ser levadas em consideração. Em primeiro lugar, é essencial anestesiar os insetos a 4 °C por 15 min para produzir hemolinfa livre de corpo gorduroso. Em segundo lugar, é mais simples obter hemolinfa pura puxando a primeira perna. Em terceiro lugar, a coleta da hemolinfa deve ser feita de forma contínua e rápida, pois, caso contrário, a hemolinfa pode coagular no fundo e bloquear o capilar.
A técnica de coleta capilar tem sido amplamente utilizada para coleta de sangue deanimais30,31. Modificamos a técnica para adequar as características distintas da hemolinfa de insetos. Como as SBPHs possuem um tamanho corporal pequeno, optou-se por um capilar com volume mínimo de 1 μL. O uso de um capilar com volume inferior a 1 μL não é recomendado. Vale ressaltar que a hemolinfa contém alta densidade de proteínas e número considerável de células (Figura 2), o que eleva sua densidade líquida e dificulta a absorção da hemolinfa por capilares de menor volume.
O método de coleta de hemolinfa capilar é uma técnica simples, econômica e viável que permite a quantificação confiável e precisa da hemolinfa. Este método recentemente desenvolvido também poderia ser aplicado para a coleta de outros fluidos traço de pequenos vetores, como a melada. É vital ressaltar que os insetos permanecem vivos após a extração da hemolinfa por esse método. Isso é benéfico para estudos envolvendo outros órgãos de insetos ou para coletas repetidas de hemolinfa. Este trabalho apresenta uma tecnologia valiosa para o estudo da entomologia e das interações vírus-vetores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (No. 2022YFD1401700) e pela National Science Foundation of China (No. 32090013 e No. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
