Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65250

Summary

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Abstract

Artropodların, virüs bulaşması için gerekli olan hemolenfleri aracılığıyla tıbbi ve tarımsal öneme sahip çeşitli virüsleri ilettiği bilinmektedir. Hemolenf koleksiyonu, virüs-vektör etkileşimlerini incelemek için temel teknolojidir. Burada, Laodelphax striatellus'u (küçük kahverengi planthopper, SBPH) bir araştırma modeli olarak kullanarak küçük eklembacaklılardan hemolenfin nicel toplanması için yeni ve basit bir yöntem açıklıyoruz, çünkü bu eklembacaklı pirinç şeritli virüsün (RSV) ana vektörüdür. Bu protokolde, işlem, donmuş eklembacaklıların bir bacağını ince uçlu cımbızla hafifçe sıkıştırarak ve hemolenfin yaradan dışarı bastırılmasıyla başlar. Daha sonra, kılcal kuvvetler prensibine göre transüdatif hemolenfin yaradan toplanması için bir kılcal damar ve bir pipet ampulünden oluşan basit bir mikropipet kullanılır. Son olarak, toplanan hemolenf daha fazla çalışma için belirli bir tampon içinde çözülebilir. Küçük eklembacaklılardan hemolenf toplamak için kullanılan bu yeni yöntem, arbovirüsler ve vektör-virüs etkileşimleri hakkında daha fazla araştırma yapmak için yararlı ve etkili bir araçtır.

Introduction

Hem hayvan hem de bitki virüsleri eklembacaklılar tarafından bulaşabilir ve bu virüsler insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve tarımda muazzam ekonomik kayıplara neden olmaktadır 1,2,3. Önemli olarak, eklembacaklılarda dolaşım sistemi ve bağışıklık sisteminin hayati bir unsuru olarak görev yapan eklembacaklı hemolenfi, arboviral bulaşmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Eklembacaklı bağırsaklardan edinilen virüsler, ancak olumsuz hemolenf ortamından başarıyla kaçtıktan sonra diğer dokulara taşınır 4,5,6,7. Eklembacaklı hemolenfteki virüslerin yaşam döngüsü, sıvı plazmasında virüs sağkalımını, hemosit içine girişi ve diğer dokulara taşınmasını içerir ve hemolenf 8,9,10,11,12'de çeşitli virüs-vektör etkileşim mekanizmaları meydana gelir. Örneğin, RSV'nin SBPH tarafından dikey iletimi, SBPH vitellogenin proteini ile RSV (pirinç şeridi virüsü) kapsid proteini13,14 arasındaki moleküler etkileşime bağlıdır. Bazı virüsler, spesifik vektör faktörlerini15,16,17,18 bağlayarak hemolenfin bağışıklık tepkisinden kaçabilir. Bu nedenle, eklembacaklıların hemolenfindeki vektör-virüs etkileşimlerinin araştırılması, arbovirüs iletiminin daha iyi anlaşılması için önemlidir.

Planthoppers, leafhoppers ve bazı sivrisinekler gibi bazı küçük böceklerin hemolenfi, büyüklükleri nedeniyle toplanması zordur. Bu sorunu çözmek için, hemolenfin mikro hacmini çıkarmak için doğrudan böcek gövdesine bir şırınga iğnesi sokmak, ince uçlu cımbızla yara bölgesinden eksüda toplamak ve doğrudan santrifüjleme dahil olmak üzere hemolenf toplamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, hemolenf 19,20,21 içindeki göreceli gen ekspresyon seviyelerinin ve viral titrelerin ölçülmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, hemosit sayımı, protein nicelleştirme ve enzim aktivitesi analizi için gerekli olan hemolenf hacmini ölçmek için etkili bir yöntem şu anda bu küçük böcekler için mevcut değildir.

SBPH (küçük kahverengi planthopper), vücut uzunluğu yaklaşık 2-4 mm olan bir tür küçük böcek vektörüdür. SBPH, RSV, mısır kaba cüce virüsü ve pirinç siyah çizgili cüce virüsü22,23,24 dahil olmak üzere çeşitli bitki virüslerini iletebilir. SBPH ve RSV arasındaki etkileşim son on yılda derinlemesine incelenmiştir. SBPH'lerle çalışmayı kolaylaştırmak için, hemolenf toplamak için yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Kılcal kuvvetler prensibine dayanan bu yöntem, böceğin hemolenfini kesin ve ölçülebilir bir şekilde elde etmek için ölçek işaretli bir kılcal damar kullanır. Bu, küçük böceklerden belirli bir hemolenf hacmini verimli bir şekilde toplamamıza ve küçük vektörlerin hemolenf ortamını daha ayrıntılı olarak incelememize olanak tanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Böcek yetiştiriciliği

  1. Bu deneyde kullanılan SBPH'leri pirinç fidelerinde yükseltin (Oryza sativa cv. Nipponbare). Bir inkübatöre (65 mm x 200 mm) 20 pirinç fidesi dikin ve 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyot altında 25 ° C'de büyütün.

2. Hemolenf toplanması için SBPH'lerin diseksiyonu

  1. SBPH'leri bir santrifüj tüpüne koyun ve 10-30 dakika boyunca bir buz banyosuna yerleştirin.
    NOT: SBPH'leri buz banyosuna 10 dakikadan daha kısa bir süre koymayın, aksi takdirde böcekler canlanabilir.
  2. Dondurulmuş bir SBPH'yi, karnı yukarı bakacak şekilde stereomikroskop altında (bkz. Malzeme Tablosu) bir cam slayt üzerine (bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirin. Odağı böceğin altı bacağına ayarlayın.
  3. Ultra ince uçlu iki yüksek hassasiyetli cımbız hazırlayın ( bkz. Yerinde tutmak için böceğin vücuduna bastırmak için bir cımbız kullanın ve diğerini bacaklardan birini böcekten dikkatlice çekmek için kullanın.
    NOT: Sert kabuklu böcekler için, bacaklardan birini kesmek için oftalmik bir neşter kullanılabilir.
  4. Hemolenfin yaradan dışarı akmasını sağlamak için böceğin göğsüne bir cımbızla hafifçe bastırın.
    NOT: Hemolenf, görünür beyaz topaklaşma olmadan şeffaf damlacıklar halinde sunulur. Yağ vücut kontaminasyonunu temsil eden herhangi bir beyaz topaklanma varsa lipiti atın.

3. Mikropipetler kullanılarak hemolenf toplanması

  1. Bir mikropipet hazırlayın. Pipet ampulünün içine 1 μL hacimli bir kılcal boru (bkz. Malzemeler Tablosu) yerleştirin (bkz. Doğru ölçümler için, ölçek çizgisinin görünür olduğundan emin olun.
    NOT: Pipet ampulünün üst kısmında küçük bir delik gereklidir.
  2. Hemolenf toplarken, mikropipetin pipet ampulünü tutun ve kılcal tüpü böcek yarasına yakın yerleştirin. Kılcal damarın ucuna hemolenfe dokunarak yaradan yayılan hemolenfleri toplayın.
  3. Kılcal borunun içindeki sıvı istenen kireç çizgisine ulaştığında emme işlemini durdurmak için pipet ampulünün üstündeki küçük deliği parmağınızla hafifçe tıkantın.
    NOT: Lipit kontaminasyonunu ve tüp tıkanmasını önlemek için sürekli ve hızlı bir şekilde 1 μL hemolenf örneği toplayın.
  4. Toplanan hemolenfin 100 μL PBS tamponuna (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) boşaltılması için pipet ampulüne basın.
    NOT: Kılcal boru PBS tamponuna yerleştirilir.
  5. Başka bir 1 μL hemolenf örneği toplarken yeni bir kılcal tüpe geçin.

4. Coomassie Mavi boyama

  1. 3. aşamada açıklanan protokollere göre 3. aşama larvalarından aynı hacimde (1 μL) 3 hemolenf örneği toplayın ve toplanan hemolenfleri toplam 100 μL hacim yapmak için PBS tamponuna boşaltın.
  2. Seyreltilmiş hemolenf numunelerinin 100 μL'sine 25 μL 5x protein yükleme tamponu (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6.8], %10 W/V SDS, %0.05 W/V Bromofenol Mavisi, %50 W/V gliserol, %5 W/V β-merkaptoetanol) ekleyin ve proteinleri denatüre etmek için ısıtın.
  3. Proteinleri ayırmak için kaynatılmış numunelerin 20 μL'sini %10'luk bir SDS-PAGE protein jeline yükleyin (bkz.
  4. Jeli bir Coomassie Blue çözeltisinde (1 g Coomassie Brilliant Blue R-250'yi 250 mL izopropanol, 100 mL buzul asetik asit ve 650 mL ddH2O ile karıştırın ve filtre kağıdı kullanarak herhangi bir partikülü filtreleyin) oda sıcaklığında 1 saat boyunca lekeleyin ve ardından jeli 1 saat boyunca renk çözücü çözelti (100 mL asetik asit, 400 mL metanol, 500 mL ddH2O).

5. Protein konsantrasyonu tayini

  1. İki katlı seyreltme yöntemini kullanarak 10 mg/mL sığır serum albüminini (BSA) PBS tamponu ile 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL ve 0,3125 mg/mL'ye seyreltin.
  2. Adım 5.1'de 5 μL PBS tamponunu ve her bir BSA çözeltisi konsantrasyonunu aspire edin, 1 mL 1x Bradford boya reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Kontrol olarak Bradford boya reaktifinde PBS tamponunu kullanın ve OD = 595 nm'de sıfırı kullanın. Kalan protein konsantrasyonlarının her birinin absorbans değerlerini ölçün ve standart bir eğri yapın.
  3. Larval, dişi veya erkek SBPH'lerden 100 μL PBS tamponuna 1 μL hemolenf ekleyin ve ardından hemositleri çıkarmak için numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüye edin.
  4. 90 μL süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aspire edin ve süpernatantın absorbans değerlerini adım 5.2'deki talimatlara göre ölçün.
  5. Hemolenf örneklerinin protein konsantrasyonlarını standart eğrinin regresyon denklemine göre hesaplayın. Deneylere üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin.

6. Mikroskobik tespitler

  1. Farklı gelişim aşamalarında 10-15 SBPH'den hemolenf toplamak için mikropipetler kullanın. Toplanan hemolenf, 20 μL% 4 paraformaldehit çözeltisi içeren bir tüpe ekleyin (bkz. Hemolenfi sabitlemek için karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  2. Silanla kaplı bir slaytın ortasına 20 μL sabit hemosit pipeti atın (bkz.
  3. Damlacığı bir sürgü kurutma rafında kurutun.
    NOT: Aşırı kurutmadan kaçınınız.
  4. Numuneyi altın antifade reaktifi 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile örtün (bakınız Malzeme Tablosu ) ve slaytı ters çevrilmiş bir mikroskop altında inceleyin (bakınız Malzeme Tablosu).

7. Hücre nicelleştirme

  1. SBPH'lerden bir mikropipet ile 1 μL hemolenf toplayın ve 20 μL PBS tamponunda çözün.
  2. Hemolenf numunelerini PBS tamponu ile beş kat seyreltin.
  3. Pipet 20 μL hemolenf çözeltisini hücre sayma odasının merkezine yerleştirin (bkz. Damlacığı bir kapak kayması ile örtün (bkz.
  4. Hücre sayım odasındaki beş karedeki hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altında sayın (Ek Şekil 1). Deneylerin her birine üç teknik replika ile üç biyolojik replika ekleyin.
    Hücreler/μL = beş orta karenin toplam sayısı × 5 × seyreltme faktörü × 104

8. İstatistiksel analizler

  1. İlgili yazılımla istatistiksel analizler yapın (bakınız Malzeme Tablosu). Yeni bir dosya oluşturun ve sütunu seçin, verileri içeri aktarın ve çubuklu bir dağılım grafiği oluşturun.
  2. Sütun istatistiklerini kullanarak her veri grubu için ortalama ve SD'yi hesaplayın ve gruplar arasındaki farklılıkların önemini değerlendirmek için tek yönlü bir ANOVA aracı kullanın. Üç bağımsız deneyle üç biyolojik kopyadan ortalama ve SD'yi belirleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikropipet modeli ve hemolenf koleksiyonu
Eylemi kılcal borunun kılcal kuvvetlerine dayanan basit bir mikropipet geliştirdik. Mikropipet, kılcal bir tüp ve bir pipet ampulünden oluşur (Şekil 1A). Kılcal borular 1 μL ila 20 μL arasında değişen farklı hacim boyutlarında mevcuttur ve kılcal boru hacimleri gereksinimlere göre seçilir. Daha küçük hacimli kılcal tüpler önerilmez, çünkü daha küçük hacimli tüplerin ekstra ince açıklıkları hemolenf gibi sıvıların emilimini zorlaştırabilir. Pipet ampulünün üst kısmında, hemolenf toplama sırasında tıkanamayan bir delik bulunur. Bu pipet ampulü, sıvı toplama sırasında mikropipeti tutmak için uygundur (Şekil 1B) ve ayrıca toplanan sıvının kılcal borudan toplama tamponuna aktarılmasına yardımcı olur.

Hemolenfin kolayca toplanması için, bu çalışmada, SBPH'ler ilk önce buzda veya buzdolabında donduruldu. Bu dondurulmuş SBPH'ler daha sonra stereomikroskop altında bir slayt üzerinde lokalize edildi ve her SBPH'nin bacaklarından biri ince uçlu cımbızla çekildi (Şekil 1C). Büyük bir yara ve optimal hemolenf toplanmasını sağlamak için, bacağı kökten çıkarmak en iyisidir (Şekil 1Ca, b). Yağ gövdesi tarafından kontaminasyon riskini en aza indirmek için, sadece beyaz flokül içermeyen berrak sıvı damlaları toplanmıştır (Şekil 1Cc). Mikropipet, istenen hacimlerde hemolenfin emilimi için kullanıldı (Şekil 1Cd). 1 μL hemolenf toplamak için yaklaşık 30-40 larva SBPH veya 8-15 yetişkin SPBH'nin diseke edilmesi gerekiyordu.

Toplanan hemolenf analizi
Toplanan hemolenfin hacmini değerlendirmek için bir yöntem olarak mikropipetin doğruluğunu değerlendirmek için, farklı numunelerin protein konsantrasyonlarını test ettik. Larvalardan elde edilen hemolenf, kılcal hacmi 1 μL olan bir mikropipet kullanılarak toplandı ve üç protein örneği ayrı ayrı toplandı ve bir SDS-PAGE jeli çalıştırılarak test edildi. Sonuçlar, üç şeritteki protein miktarının neredeyse eşit olduğunu göstermiştir (Şekil 2A). Larvalar için toplam protein içeriği 3.707 mg / mL ± 1.382 mg / mL idi. Ayrıca yetişkin kadın ve erkek SBPH'lerden aynı hacimde hemolenf topladık ve bunlar sırasıyla 3.515 mg / mL ± 1.400 mg / mL ve 3.621 mg / mL ± 0.860 mg / mL protein konsantrasyonları gösterdi (Tablo 1). Üç örnek arasında proteinde anlamlı bir fark yoktu (Şekil 2B).

Ek olarak, hemolenf örneklerinin kalitesini ve saflığını değerlendirmek için toplanan larva hemolenfinin içindeki hemositleri de gözlemledik. Hemositlerin boyutları 2-20 nm arasında değişmekte olup, yağ gövdesi saptanmamıştır (Şekil 2C). Tanımlanan hücrelerin çoğunluğu, çapı 5-15 nm arasında değişen plazmatositlerdi ve sıklıklaagregalarda ortaya çıktı 25. Daha sonra hemolenfin larvalardan, yetişkin dişilerden ve yetişkin erkeklerden hücre konsantrasyonlarını saydık ve tanımlanan hücre konsantrasyonları sırasıyla 1.794 x 10 5 / μL ± 0.614 x 10 5 / μL, 1.256 x 10 5 / μL ± 0.603 x 10 5 / μL ve 1.553 x 10 5 / μL ± 0.474 x 10 5 / μL idi (Tablo 2). Larvalarda, yetişkin dişilerde ve yetişkin erkeklerde hemosit hücre sayısı anlamlı bir farklılık göstermedi (Şekil 2D). Bu sonuçlar, mikropipet toplama yönteminin SBPH'lerden hemolenf toplamak için güvenilir ve doğru bir yol olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Mikropipet modelinin şeması ve hemolenf koleksiyonu. (A) Mikropipet bileşimi. Mikropipet bir kılcal damar ve bir pipet ampulünden oluşur. Kılcal hacimler 1-20 μL arasında değişir. Pipet ampulünün üstünde ve altında küçük bir delik vardır. Kılcal alt deliğe yerleştirilir ve ölçek görülebilir. (B) Mikropipet ile hemolenf toplanmasına ilişkin genel bakış diyagramı. Bir bacak ayrılırken böcek karnı yukarı bakacak şekilde tutulur, hemolenf çıkışı indüklenir ve hemolenf stereomikroskop altında pipete toplanır. (C) Mikropipet ile hemolenf toplama işlemi. Bacaklardan biri ince uçlu cımbızla (a) kökten çekilir ve hemolenfin dışarı akmasını sağlamak için böceğin vücuduna bastırılır (b,c). Yaradan hemolenf kılcal damar içine toplanır (d). Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: SBPH hemolenf analizi . (A) Toplanan larva hemolenfinin üç kopyasını gösteren Coomassie Mavisi boyama. Hem hemolenfi gösterir. (B) Larval, dişi ve erkek SBPH'lerin hemolenflerinin toplam protein konsantrasyonları. (C) SBPH'lerde hemolenfte bulunan hücreleri sırasıyla 20x ve 60x büyütmede gösteren mikroskobik görüntüler. Çekirdek DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) Larval, dişi ve erkek SBPH'lerin hemosit yoğunluğu. Ortalama ve SD üç bağımsız deneyden hesaplandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hemolenf Protein konsantrasyonu (mg/mL)
Larva 3.707±1.382
Dişi 3.515±1.400
Erkek 3.621±0.860

Tablo 1: Farklı SBPH'lerden hemolenf protein konsantrasyonları. Veriler üç biyolojik kopyadan elde edildi.

Hemolenf Hücre konsantrasyonu (105 / μL)
Larva 1.794±0.614
Dişi 1.256±0.603
Erkek 1.553±0.474

Tablo 2: Farklı SBPH'lerden hemolenfteki toplam hemosit konsantrasyonları. Veriler üç biyolojik kopyadan elde edildi.

Ek Şekil 1: Hücre sayısının belirlenmesi. Dört köşe karesi (1, 2, 3 ve 4) ve merkezi kare (5) hücre sayım odasında sayılır. Sınır hücreleri için yalnızca iki sınır (üst ve sol) sayılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hemolenf, eklembacaklılardaki dolaşım sisteminin ortamıdır ve arbovirüsler ancak düşmanca hemolenf ortamında hayatta kalabiliyorlarsa diğer eklembacaklı dokuları istila edebilirler. Yüksek kaliteli bir hemolenf örneği toplamak, hemolenfte meydana gelen vektör-virüs etkileşimlerini incelemenin ilk adımıdır. Böcek hemolenfinin, ön bacakta bir yara, baş bölgesinde küçük bir kesi veya karın bölgesinde bir gözyaşı yarası 26,27,28,29 dahil olmak üzere böceğin vücudundaki çeşitli bölgelerden elde edilebileceği bildirilmiştir. Belirli satın almalar için farklı toplama yöntemleri işe yarayabilir. Baş-boyun ekleminde küçük bir kesi oluşturmayı içeren yöntem, bal arıları gibi büyük böceklerden hemolenf toplanması için daha uygundur26. SBPH'nin baş bölgesinde bir yara oluşturmak, diğer organlara zarar verebileceği ve diğer dokulardan kontaminasyona neden olabileceği için zordur. Karında bir gözyaşı yarası yaptıktan sonra, böcekler tampona batırılır ve daha sonra hemolenfin çıkarılması için tampon santrifüj edilir. Bu, küçük böceklerden lipitleri toplamak için uygun bir yöntemdir21. Bununla birlikte, SBPH'lerin hemocoelinde yüksek miktarda yağ gövdesi bulunduğundan, vücut kısmındaki bir yara, yaradan yağ gövdesi sızıntısına neden olabilir ve hemolenfin kirlenmesine neden olabilir. Bu yöntem, larvalardan daha az yağ gövdesine sahip yetişkin SBPH'lerden hemolenf toplamak için daha uygundur. Yağ vücut kontaminasyonunu etkili bir şekilde önlemek için, doğrudan vücuda değil, bacak bölgesinde bir yara yapılması önerilir. SBPH hemolenfin önceki çalışmalarında, yaradan küçük damla sıvıların toplanmasını kolaylaştırmak için ince uçlu cımbız kullanılmıştır13. Toplanan hemolenf safsızlıklardan arındırılmış olmasına rağmen, hemolenf hacmi ölçülmemiştir. Bu çalışmada, çok küçük böcek vektörlerinden hemolenfleri doğru ve nicel olarak toplamak için kullanılabilecek basit bir mikropipet geliştirdik.

Başarılı hemolenf toplanması için, birkaç kritik adım dikkate alınmalıdır. İlk olarak, yağ gövdesinden arındırılmış hemolenf üretmek için böceklerin 4 ° C'de 15 dakika boyunca uyuşturulması esastır. İkincisi, ilk bacağı çekerek saf hemolenf elde etmek daha kolaydır. Üçüncüsü, hemolenfin toplanması sürekli ve hızlı bir şekilde yapılmalıdır, aksi takdirde hemolenf altta pıhtılaşabilir ve kılcal damarı bloke edebilir.

Kılcal damar toplama tekniği hayvan kanı toplama için yaygın olarak kullanılmaktadır30,31. Tekniği, böcek hemolenfinin farklı özelliklerine uyacak şekilde değiştirdik. SBPH'ler küçük bir vücut boyutuna sahip olduklarından, minimum 1 μL hacme sahip bir kılcal damar seçilmiştir. Hacmi 1 μL'den düşük olan bir kılcal damar kullanılması önerilmez. Hemolenfin yüksek yoğunlukta protein ve önemli sayıda hücre içermesi dikkat çekicidir (Şekil 2), bu da sıvı yoğunluğunu yükseltir ve hemolenfin daha küçük hacimli kılcal damarlar yoluyla emilmesini zorlaştırır.

Hemolenfin kılcal damar yoluyla toplanması yöntemi, hemolenfin güvenilir ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan basit, uygun maliyetli ve uygulanabilir bir tekniktir. Bu yeni geliştirilen yöntem, honeydew gibi küçük vektörlerden diğer eser sıvıların toplanması için de uygulanabilir. Bu yöntemi kullanarak hemolenfin çıkarılmasından sonra böceklerin canlı kaldığını vurgulamak çok önemlidir. Bu, diğer böcek organlarını içeren çalışmalar veya tekrarlanan hemolenf toplanması için faydalıdır. Bu çalışma, entomoloji ve virüs-vektör etkileşimlerinin incelenmesi için değerli bir teknoloji sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No. 2022YFD1401700) ve Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 32090013 ve No. 32072385) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE protein gel Bio-rad 4561035 Protein separation and detection
4% paraformaldehyde Solarbio P1110 For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagent Bio-rad 5000205 Protein concentration detection
Capillary Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Cell counting chamber ACMEC AYA0810 Hemocytes counting
Glass slide Gitoglas 10127105A For holding insects
Glass slide coated with silane Sigma S4651-72EA For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 Nucleus staining
Microscope cover glass Gitoglas 10212424C For microscopic observation
Pipette bulb Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Prism 8.0 software GraphPad Software / Statistical analyses
Stereomicroscope  Motic SMZ-168 For insect dissection
Tweezers Tianld P5622 For insect dissection
Zeiss inverted microscope Zeiss Observer Z1 Hemocytes observation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
  3. Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
  4. Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
  5. Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
  6. Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
  7. Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
  8. Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
  9. Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
  10. Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
  11. Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
  12. Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
  13. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
  14. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
  16. Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
  17. Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
  18. Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
  19. Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
  20. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
  21. Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
  22. Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
  23. Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
  24. Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
  25. Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
  26. Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
  27. Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
  28. Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
  29. Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
  30. Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
  31. Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 194
Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo,More

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods. J. Vis. Exp. (194), e65250, doi:10.3791/65250 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter