Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.
Artropodların, virüs bulaşması için gerekli olan hemolenfleri aracılığıyla tıbbi ve tarımsal öneme sahip çeşitli virüsleri ilettiği bilinmektedir. Hemolenf koleksiyonu, virüs-vektör etkileşimlerini incelemek için temel teknolojidir. Burada, Laodelphax striatellus’u (küçük kahverengi planthopper, SBPH) bir araştırma modeli olarak kullanarak küçük eklembacaklılardan hemolenfin nicel toplanması için yeni ve basit bir yöntem açıklıyoruz, çünkü bu eklembacaklı pirinç şeritli virüsün (RSV) ana vektörüdür. Bu protokolde, işlem, donmuş eklembacaklıların bir bacağını ince uçlu cımbızla hafifçe sıkıştırarak ve hemolenfin yaradan dışarı bastırılmasıyla başlar. Daha sonra, kılcal kuvvetler prensibine göre transüdatif hemolenfin yaradan toplanması için bir kılcal damar ve bir pipet ampulünden oluşan basit bir mikropipet kullanılır. Son olarak, toplanan hemolenf daha fazla çalışma için belirli bir tampon içinde çözülebilir. Küçük eklembacaklılardan hemolenf toplamak için kullanılan bu yeni yöntem, arbovirüsler ve vektör-virüs etkileşimleri hakkında daha fazla araştırma yapmak için yararlı ve etkili bir araçtır.
Hem hayvan hem de bitki virüsleri eklembacaklılar tarafından bulaşabilir ve bu virüsler insan sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmakta ve tarımda muazzam ekonomik kayıplara neden olmaktadır 1,2,3. Önemli olarak, eklembacaklılarda dolaşım sistemi ve bağışıklık sisteminin hayati bir unsuru olarak görev yapan eklembacaklı hemolenfi, arboviral bulaşmanın düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Eklembacaklı bağırsaklardan edinilen virüsler, ancak olumsuz hemolenf ortamından başarıyla kaçtıktan sonra diğer dokulara taşınır 4,5,6,7. Eklembacaklı hemolenfteki virüslerin yaşam döngüsü, sıvı plazmasında virüs sağkalımını, hemosit içine girişi ve diğer dokulara taşınmasını içerir ve hemolenf 8,9,10,11,12’de çeşitli virüs-vektör etkileşim mekanizmaları meydana gelir. Örneğin, RSV’nin SBPH tarafından dikey iletimi, SBPH vitellogenin proteini ile RSV (pirinç şeridi virüsü) kapsid proteini13,14 arasındaki moleküler etkileşime bağlıdır. Bazı virüsler, spesifik vektör faktörlerini15,16,17,18 bağlayarak hemolenfin bağışıklık tepkisinden kaçabilir. Bu nedenle, eklembacaklıların hemolenfindeki vektör-virüs etkileşimlerinin araştırılması, arbovirüs iletiminin daha iyi anlaşılması için önemlidir.
Planthoppers, leafhoppers ve bazı sivrisinekler gibi bazı küçük böceklerin hemolenfi, büyüklükleri nedeniyle toplanması zordur. Bu sorunu çözmek için, hemolenfin mikro hacmini çıkarmak için doğrudan böcek gövdesine bir şırınga iğnesi sokmak, ince uçlu cımbızla yara bölgesinden eksüda toplamak ve doğrudan santrifüjleme dahil olmak üzere hemolenf toplamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, hemolenf 19,20,21 içindeki göreceli gen ekspresyon seviyelerinin ve viral titrelerin ölçülmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, hemosit sayımı, protein nicelleştirme ve enzim aktivitesi analizi için gerekli olan hemolenf hacmini ölçmek için etkili bir yöntem şu anda bu küçük böcekler için mevcut değildir.
SBPH (küçük kahverengi planthopper), vücut uzunluğu yaklaşık 2-4 mm olan bir tür küçük böcek vektörüdür. SBPH, RSV, mısır kaba cüce virüsü ve pirinç siyah çizgili cüce virüsü22,23,24 dahil olmak üzere çeşitli bitki virüslerini iletebilir. SBPH ve RSV arasındaki etkileşim son on yılda derinlemesine incelenmiştir. SBPH’lerle çalışmayı kolaylaştırmak için, hemolenf toplamak için yeni ve basit bir yöntem geliştirdik. Kılcal kuvvetler prensibine dayanan bu yöntem, böceğin hemolenfini kesin ve ölçülebilir bir şekilde elde etmek için ölçek işaretli bir kılcal damar kullanır. Bu, küçük böceklerden belirli bir hemolenf hacmini verimli bir şekilde toplamamıza ve küçük vektörlerin hemolenf ortamını daha ayrıntılı olarak incelememize olanak tanır.
Hemolenf, eklembacaklılardaki dolaşım sisteminin ortamıdır ve arbovirüsler ancak düşmanca hemolenf ortamında hayatta kalabiliyorlarsa diğer eklembacaklı dokuları istila edebilirler. Yüksek kaliteli bir hemolenf örneği toplamak, hemolenfte meydana gelen vektör-virüs etkileşimlerini incelemenin ilk adımıdır. Böcek hemolenfinin, ön bacakta bir yara, baş bölgesinde küçük bir kesi veya karın bölgesinde bir gözyaşı yarası 26,27,28,29 dahil olmak üzere böceğin vücudundaki çeşitli bölgele…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (No. 2022YFD1401700) ve Çin Ulusal Bilim Vakfı (No. 32090013 ve No. 32072385) tarafından desteklenmiştir.
10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |