Summary
Nous décrivons une méthode pour recueillir efficacement l’hémolymphe quantifiable de petits arthropodes pour une analyse ultérieure.
Abstract
Les arthropodes sont connus pour transmettre une variété de virus d’importance médicale et agricole par leur hémolymphe, qui est essentielle à la transmission du virus. La collecte d’hémolymphe est la technologie de base pour étudier les interactions virus-vecteur. Ici, nous décrivons une méthode nouvelle et simple pour la collecte quantitative de l’hémolymphe de petits arthropodes en utilisant Laodelphax striatellus (la petite cicadelle brune, SBPH) comme modèle de recherche, car cet arthropode est le principal vecteur du virus de la bande du riz (VRS). Dans ce protocole, le processus commence par pincer doucement une jambe de l’arthropode congelé avec une pince à épiler à pointe fine et presser l’hémolymphe hors de la plaie. Ensuite, une micropipette simple composée d’un capillaire et d’un bulbe de pipette est utilisée pour recueillir l’hémolymphe transsudative de la plaie selon le principe des forces capillaires. Enfin, l’hémolymphe recueillie peut être dissoute dans un tampon spécifique pour une étude plus approfondie. Cette nouvelle méthode de collecte de l’hémolymphe de petits arthropodes est un outil utile et efficace pour la poursuite des recherches sur les arbovirus et les interactions vecteur-virus.
Introduction
Les virus animaux et végétaux peuvent être transmis par les arthropodes, et ces virus constituent une grave menace pour la santé humaine et causent d’énormes pertes économiques dans l’agriculture 1,2,3. Il est important de noter que l’hémolymphe des arthropodes, qui sert de système circulatoire et d’élément vital du système immunitaire chez les arthropodes, joue un rôle important dans la régulation de la transmission des arboviraux. Les virus acquis par les intestins des arthropodes ne sont transportés vers d’autres tissus qu’après avoir réussi à s’échapper de l’environnement hémolymphe indésirable 4,5,6,7. Le cycle de vie des virus dans l’hémolymphe arthropode implique la survie du virus dans le plasma fluide, l’entrée dans l’hémocyte et le transport vers d’autres tissus, et divers mécanismes d’interaction virus-vecteur se produisent dans l’hémolymphe 8,9,10,11,12. Par exemple, la transmission verticale du VRS par l’HBPS dépend d’une interaction moléculaire entre la protéine vitellogénine SBPH et la protéine de capside RSV (virus de la bande de riz)13,14. Certains virus peuvent échapper à la réponse immunitaire de l’hémolymphe en se liant à des facteurs vectoriels spécifiques15,16,17,18. Par conséquent, il est important d’étudier les interactions vecteur-virus dans l’hémolymphe des arthropodes pour mieux comprendre la transmission des arbovirus.
L’hémolymphe de certains petits insectes, tels que les cicadelles, les cicadelles et certains moustiques, est difficile à recueillir en raison de leur taille. Pour résoudre ce problème, plusieurs méthodes ont été développées pour recueillir l’hémolymphe, y compris l’insertion d’une aiguille de seringue directement dans le corps de l’insecte pour extraire un microvolume de l’hémolymphe, la collecte de l’exsudat du site de la plaie avec une pince à épiler à pointe fine et la centrifugation directe. Ces méthodes ont permis de mesurer les niveaux relatifs d’expression génique et les titres viraux dans l’hémolymphe 19,20,21. Cependant, une méthode efficace pour quantifier le volume de l’hémolymphe, qui est nécessaire pour le comptage des hémocytes, la quantification des protéines et l’analyse de l’activité enzymatique, n’est actuellement pas disponible pour ces petits insectes.
Le SBPH (small brown planthopper) est un type de petit insecte vecteur d’une longueur de corps d’environ 2-4 mm. Le SBPH est capable de transmettre une variété de virus végétaux, y compris le VRS, le virus nain rugueux du maïs et le virus nain strié noir de riz22,23,24. L’interaction entre l’HBP et le VRS a été étudiée en profondeur au cours de la dernière décennie. Pour faciliter le travail avec les SBPH, nous avons développé une méthode nouvelle et simple de collecte de l’hémolymphe. Cette méthode, basée sur le principe des forces capillaires, utilise un capillaire avec un repère d’écaille pour acquérir l’hémolymphe de l’insecte de manière précise et quantifiable. Cela nous permet de collecter efficacement un volume spécifique d’hémolymphe de petits insectes et d’étudier plus en détail l’environnement hémolymphe de petits vecteurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Élevage d’insectes
- Augmenter les SBPH utilisés dans cette expérience dans les plants de riz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Planter 20 plants de riz dans un incubateur (65 mm x 200 mm) et pousser à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière / 8 h d’obscurité.
2. Dissection des SBPH pour le prélèvement de l’hémolymphe
- Mettez les SBPH dans un tube à centrifuger et placez-les dans un bain de glace pendant 10-30 min.
REMARQUE: Ne placez pas les SBPH dans le bain de glace pendant moins de 10 minutes, sinon les insectes pourraient revivre. - Placer une SBPH congelée sur une lame de verre (voir Tableau des matériaux) sous un stéréomicroscope (voir Table des matériaux) avec son abdomen tourné vers le haut. Ajustez la mise au point sur les six pattes de l’insecte.
- Préparez deux pinces à épiler de haute précision (voir Tableau des matériaux) avec des pointes ultra-fines. Utilisez une pince à épiler pour appuyer sur le corps de l’insecte afin de le maintenir en place, et utilisez l’autre pour retirer soigneusement l’une des pattes de l’insecte.
REMARQUE: Pour les insectes à coquille dure, un scalpel ophtalmique peut être utilisé pour couper l’une des jambes. - Appuyez doucement sur la poitrine de l’insecte avec une pince à épiler pour faire couler l’hémolymphe à travers la plaie.
REMARQUE: L’hémolymphe se présente sous forme de gouttelettes transparentes sans flocule blanche visible. Jetez le lipide s’il y a de la flocule blanche, qui représente la contamination du corps gras.
3. Prélèvement d’hémolymphe à l’aide de micropipettes
- Préparez une micropipette. Placez un tube capillaire (voir le tableau des matériaux) d’un volume de 1 μL dans l’ampoule de la pipette (voir le tableau des matériaux). Pour des mesures précises, assurez-vous que la ligne d’échelle est visible.
REMARQUE: Un petit trou présent sur le dessus de l’ampoule de la pipette est nécessaire. - Lors de la collecte de l’hémolymphe, tenez le bulbe de la pipette de la micropipette et placez le tube capillaire près de la plaie de l’insecte. Recueillir l’hémolymphe exsudant de la plaie en touchant simplement l’extrémité du capillaire à l’hémolymphe.
- Boucher légèrement le petit trou sur le dessus de l’ampoule de la pipette avec le doigt pour arrêter le processus d’absorption lorsque le liquide à l’intérieur du tube capillaire atteint la ligne d’échelle souhaitée.
REMARQUE : Prélever un échantillon de 1 μL d’hémolymphe sans cesse et rapidement pour éviter la contamination lipidique et le colmatage des tubes. - Appuyez sur l’ampoule de la pipette pour évacuer l’hémolymphe recueillie dans 100 μL de tampon PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/LNa2HPO4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
REMARQUE: Le tube capillaire est inséré dans le tampon PBS. - Passez à un nouveau tube capillaire lors du prélèvement d’un autre échantillon de 1 μL d’hémolymphe.
4. Coloration Coomassie Blue
- Prélever 3 échantillons d’hémolymphe de même volume (1 μL) de larves de 3e stade selon les protocoles décrits à l’étape 3, et déverser l’hémolymphe recueillie dans le tampon PBS pour obtenir un volume total de 100 μL.
- Ajouter 25 μL de tampon de charge protéique 5x (250 mmol/L de Tris-HCI [pH 6,8], 10 % P/V SDS, 0,05 % P/V de bleu de bromophénol, 50 % P/V de glycérol, 5 % P/V β-mercaptoéthanol) dans 100 μL des échantillons d’hémolymphe dilués, et chauffer pour dénaturer les protéines.
- Charger 20 μL des échantillons bouillis sur un gel protéique SDS-PAGE à 10 % (voir le tableau des matières) pour séparer les protéines.
- Colorer le gel dans une solution de Coomassie Blue (mélanger 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 avec 250 mL d’isopropanol, 100 mL d’acide acétique glacial et 650 mL deddH2O, et filtrer les particules éventuelles à l’aide de papier filtre) pendant 1 h à température ambiante, puis décolorer le gel pendant 1 h avec une solution décolorante (100 mL d’acide acétique, 400 mL de méthanol, 500 mL deddH2O).
5. Détermination de la concentration en protéines
- Diluer 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL, 0,625 mg/mL et 0,3125 mg/mL avec un tampon PBS en utilisant la méthode de dilution double.
- Aspirer 5 μL de tampon PBS et chaque concentration de solutions BSA à l’étape 5.1, ajouter 1 mL de 1x réactif colorant Bradford (voir Tableau des matériaux) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Utilisez le tampon PBS dans le réactif de colorant Bradford comme témoin, et zéro à OD = 595 nm. Mesurez les valeurs d’absorbance de chacune des concentrations de protéines restantes et faites une courbe standard.
- Ajouter 1 μL d’hémolymphe provenant de SBPH larvaires, femelles ou mâles dans 100 μL de tampon PBS, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les hémocytes.
- Aspirer 90 μL de surnageant dans un nouveau tube à centrifuger et mesurer les valeurs d’absorbance du surnageant conformément aux instructions de l’étape 5.2.
- Calculer les concentrations protéiques des échantillons d’hémolymphe selon l’équation de régression de la courbe standard. Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans les expériences.
6. Détections microscopiques
- Utilisez des micropipettes pour recueillir l’hémolymphe de 10 à 15 SBPH à différents stades de développement. Ajouter l’hémolymphe recueillie dans un tube contenant 20 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 % (voir le tableau des matières). Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min pour fixer l’hémolymphe.
- Pipeter 20 μL d’hémocytes fixes sur le centre d’une lame recouverte de silane (voir Tableau des matières).
- Sécher la gouttelette dans un séchoir à lames.
REMARQUE: Évitez le séchage excessif. - Couvrir l’échantillon avec le réactif antidécoloration à l’or 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (voir le tableau des matières) et inspecter la lame au microscope inversé (voir le tableau des matériaux).
7. Quantification cellulaire
- Prélever 1 μL d’hémolymphe des SBPH avec une micropipette et le dissoudre dans 20 μL de tampon PBS.
- Diluer les échantillons d’hémolymphe cinq fois avec un tampon PBS.
- Pipeter 20 μL de solution d’hémolymphe au centre de la chambre de comptage cellulaire (voir Tableau des matériaux). Couvrir la gouttelette avec un bordereau de couverture (voir le tableau des matériaux).
- Comptez les cellules dans les cinq carrés de la chambre de comptage des cellules (figure supplémentaire 1), sous un microscope inversé (voir le tableau des matériaux). Inclure trois réplicats biologiques avec trois réplicats techniques dans chacune des expériences.
Cellules/μL = numération totale de cinq carrés du milieu × 5 × facteur de dilution × 104
8. Analyses statistiques
- Effectuer des analyses statistiques avec le logiciel correspondant (voir Tableau des matières). Créez un nouveau fichier, sélectionnez la colonne, importez les données et générez un nuage de points avec une barre.
- Calculez la moyenne et l’écart type pour chaque groupe de données à l’aide de statistiques sur colonne et utilisez un outil d’ANOVA unidirectionnel pour évaluer la signification des différences entre les groupes. Déterminez la moyenne et l’écart-type de trois répétitions biologiques à l’aide de trois expériences indépendantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modèle de micropipette et collecte d’hémolymphe
Nous avons développé une micropipette simple dont l’action est basée sur les forces capillaires du tube capillaire. La micropipette est composée d’un tube capillaire et d’une ampoule de pipette (Figure 1A). Les tubes capillaires sont disponibles en différentes tailles de volume allant de 1 μL à 20 μL, et les volumes de tubes capillaires sont sélectionnés en fonction des exigences. Les tubes capillaires avec des volumes plus petits ne sont pas suggérés parce que les ouvertures extra fines des tubes de plus petit volume peuvent rendre difficile l’absorption de liquides tels que l’hémolymphe. L’ampoule de la pipette contient un trou sur le dessus qui ne peut pas être bouché pendant le prélèvement de l’hémolymphe. Cette ampoule de pipette est pratique pour maintenir la micropipette pendant la collecte de liquide (Figure 1B) et aide également à transférer le liquide recueilli du tube capillaire dans le tampon de collecte.
Afin de recueillir facilement l’hémolymphe, dans ce travail, les SBPH ont d’abord été congelés dans de la glace ou au réfrigérateur. Ces SBPH congelés ont ensuite été localisés sur une lame sous un stéréomicroscope, et l’une des jambes de chaque SBPH a été arrachée avec une pince à épiler à pointe fine (Figure 1C). Pour assurer une grande plaie et une collecte optimale de l’hémolymphe, il est préférable de retirer la jambe à la racine (Figure 1Ca, b). Afin de minimiser le risque de contamination par le corps adipeux, seules des gouttes liquides claires sans floccule blanc ont été collectées (Figure 1Cc). La micropipette a été utilisée pour absorber les volumes souhaités d’hémolymphe (Figure 1Cd). Pour recueillir 1 μL d’hémolymphe, environ 30 à 40 HBPS larvaires ou 8 à 15 SPBH adultes ont dû être disséqués.
Analyse de l’hémolymphe recueillie
Pour évaluer la précision de la micropipette en tant que méthode d’évaluation du volume d’hémolymphe collectée, nous avons testé les concentrations de protéines de différents échantillons. L’hémolymphe des larves a été recueillie à l’aide d’une micropipette d’un volume capillaire de 1 μL, et trois échantillons de protéines ont été prélevés séparément et testés en exécutant un gel SDS-PAGE. Les résultats ont montré que la quantité de protéines dans les trois voies était presque égale (Figure 2A). Pour les larves, la teneur totale en protéines était de 3,707 mg/mL ± 1,382 mg/mL. Nous avons également recueilli le même volume d’hémolymphe de SBPH adultes femelles et mâles, et celles-ci ont montré des concentrations de protéines de 3,515 mg / mL ± 1,400 mg / mL et 3,621 mg / mL ± 0,860 mg / mL, respectivement (tableau 1). Il n’y avait pas de différences significatives dans la protéine entre les trois échantillons (Figure 2B).
De plus, nous avons également observé les hémocytes à l’intérieur de l’hémolymphe larvaire recueillie pour évaluer la qualité et la pureté des échantillons d’hémolymphe. La taille des hémocytes variait entre 2 et 20 nm, et aucun corps adipeux n’a été détecté (Figure 2C). La majorité des cellules identifiées étaient des plasmatocytes, allant de 5 à 15 nm de diamètre et apparaissant souvent dans des agrégats25. Nous avons ensuite compté les concentrations cellulaires de l’hémolymphe des larves, des femelles adultes et des mâles adultes, et les concentrations cellulaires identifiées étaient de 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL et 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL, respectivement (tableau 2). Le nombre de cellules hémocytaires chez les larves, les femelles adultes et les mâles adultes n’a montré aucune différence significative (Figure 2D). Ces résultats indiquent que la méthode de collecte de micropipettes est un moyen fiable et précis de recueillir l’hémolymphe des SBPH.
Figure 1 : Schéma du modèle de micropipette et du prélèvement d’hémolymphe. (A) Composition de la micropipette. La micropipette se compose d’un capillaire et d’une ampoule de pipette. Les volumes capillaires vont de 1 à 20 μL. L’ampoule de pipette a un petit trou en haut et en bas. Le capillaire est inséré dans le trou du fond et l’échelle est visible. (B) Schéma général de la collecte de l’hémolymphe à l’aide d’une micropipette. L’abdomen de l’insecte est maintenu face vers le haut pendant qu’une jambe est détachée, l’écoulement de l’hémolymphe est induit et l’hémolymphe est recueillie dans la pipette sous un stéréomicroscope. (C) Processus de collecte de l’hémolymphe avec une micropipette. L’une des pattes est arrachée à la racine avec une pince à épiler fine (a), et le corps de l’insecte est pressé pour faire couler l’hémolymphe (b, c). L’hémolymphe de la plaie est recueillie dans le capillaire (d). Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse de l’hémolymphe de l’ÉSPHA. (A) Coloration bleue de Coomassie montrant trois réplicas de l’hémolymphe larvaire recueillie. Hem indique l’hémolymphe. (B) Concentrations protéiques totales de l’hémolymphe des SBPH larvaires, femelles et mâles. (C) Images microscopiques montrant les cellules présentes dans l’hémolymphe dans les SBPH à un grossissement de 20x et 60x, respectivement. Le noyau était coloré avec DAPI (bleu). Barre d’échelle = 50 μm. (D) Densité hémocytaire des SBPH larvaires, femelles et mâles. La moyenne et l’écart-type ont été calculées à partir de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Hémolymphe | Concentration en protéines (mg/mL) |
| Larve | 3.707±1.382 |
| Femelle | 3.515±1.400 |
| Mâle | 3,621±0,860 |
Tableau 1 : Concentrations protéiques de l’hémolymphe provenant de différentes SBPH. Les données ont été obtenues à partir de trois réplications biologiques.
| Hémolymphe | Concentration cellulaire (105 / μL) |
| Larve | 1,794±0,614 |
| Femelle | 1,256±0,603 |
| Mâle | 1,553±0,474 |
Tableau 2 : Concentrations totales d’hémocytes dans l’hémolymphe provenant de différentes SBPH. Les données ont été obtenues à partir de trois réplications biologiques.
Figure supplémentaire 1 : Détermination du nombre de cellules. Les quatre carrés d’angle (1, 2, 3 et 4) et le carré central (5) sont comptés sur la chambre de comptage des cellules. Pour les cellules de bordure, seules les deux limites (en haut et à gauche) sont comptées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’hémolymphe est le milieu du système circulatoire chez les arthropodes, et les arbovirus ne peuvent envahir d’autres tissus d’arthropodes que s’ils sont capables de survivre à l’environnement hostile de l’hémolymphe. La collecte d’un échantillon d’hémolymphe de haute qualité est la première étape de l’étude des interactions vecteur-virus qui se produisent dans l’hémolymphe. Il a été rapporté que l’hémolymphe d’insecte peut être obtenue à partir de plusieurs sites sur le corps de l’insecte, y compris une plaie sur la patte avant, une incision mineure dans la région de la tête, ou une plaie lacrymale à l’abdomen26,27,28,29. Différentes méthodes de collecte peuvent fonctionner pour certaines acquisitions. La méthode consistant à créer une petite incision au niveau de l’articulation tête-cou est plus appropriée pour la collecte d’hémolymphe de gros insectes tels que les abeillesmellifères 26. La création d’une plaie dans la région de la tête de l’HBPS est difficile car elle peut endommager d’autres organes et introduire une contamination par d’autres tissus. Après avoir fait une blessure lacrymale à l’abdomen, les insectes sont immergés dans le tampon, puis le tampon est centrifugé pour extraire l’hémolymphe. C’est une méthode pratique pour collecter les lipides des petits insectes21. Cependant, comme il y a une grande quantité de graisse dans l’hémocèle des SBPH, une plaie sur la partie du corps peut provoquer une fuite de graisse corporelle de la plaie et entraîner la contamination de l’hémolymphe. Cette méthode est plus appropriée pour collecter l’hémolymphe des SBPH adultes, qui ont un corps moins gras que les larves. Pour prévenir efficacement la contamination du corps gras, il est recommandé de faire une plaie au site de la jambe plutôt que directement sur le corps. Dans des études antérieures sur l’hémolymphe SBPH, des pincettes à pointe fine ont été utilisées pour faciliter la collecte de petites gouttes de liquide de la plaie13. Bien que l’hémolymphe recueillie soit exempte d’impuretés, le volume d’hémolymphe n’a pas été mesuré. Dans cette étude, nous avons développé une micropipette simple qui peut être utilisée pour recueillir avec précision et quantitativement l’hémolymphe de très petits insectes vecteurs.
Pour une collecte réussie de l’hémolymphe, plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte. Tout d’abord, il est essentiel d’anesthésier les insectes à 4 °C pendant 15 min afin de produire une hémolymphe exempte de graisse corporelle. Deuxièmement, il est plus simple d’obtenir une hémolymphe pure en retirant la première jambe. Troisièmement, la collecte de l’hémolymphe doit être effectuée de manière continue et rapide, sinon l’hémolymphe peut coaguler au fond et bloquer le capillaire.
La technique de prélèvement capillaire a été largement utilisée pour la collecte de sang animal30,31. Nous avons modifié la technique pour l’adapter aux caractéristiques distinctes de l’hémolymphe des insectes. Comme les SBPH possèdent une petite taille corporelle, un capillaire avec un volume minimal de 1 μL a été choisi. L’utilisation d’un capillaire d’un volume inférieur à 1 μL n’est pas recommandée. Il est à noter que l’hémolymphe contient une forte densité de protéines et un nombre considérable de cellules (Figure 2), ce qui élève sa densité liquide et rend difficile l’absorption de l’hémolymphe via des capillaires de plus petits volumes.
La méthode de collecte de l’hémolymphe par capillaire est une technique simple, rentable et viable qui permet la quantification fiable et précise de l’hémolymphe. Cette méthode nouvellement développée pourrait également être appliquée pour la collecte d’autres fluides traces à partir de petits vecteurs, tels que le miellat. Il est essentiel de souligner que les insectes restent en vie après l’extraction de l’hémolymphe en utilisant cette méthode. Ceci est bénéfique pour les études impliquant d’autres organes d’insectes ou pour la collecte répétée d’hémolymphe. Ce travail présente une technologie précieuse pour l’étude de l’entomologie et des interactions virus-vecteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Key R&D Program of China (No. 2022YFD1401700) et par la National Science Foundation of China (No. 32090013 et No. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
