Summary
Мы описываем метод эффективного сбора поддающейся количественной оценке гемолимфы у мелких членистоногих для последующего анализа.
Abstract
Известно, что членистоногие передают через свою гемолимфу различные вирусы, имеющие медицинское и сельскохозяйственное значение, что необходимо для передачи вируса. Сбор гемолимфы является базовой технологией изучения вирусно-векторных взаимодействий. Здесь мы описываем новый и простой метод количественного сбора гемолимфы у мелких членистоногих с использованием Laodelphax striatellus (маленький коричневый кузнечик, SBPH) в качестве исследовательской модели, поскольку это членистоногое является основным переносчиком вируса рисовой полосы (RSV). В этом протоколе процесс начинается с осторожного отщипывания одной ноги замороженного членистоногого пинцетом с тонким наконечником и выдавливания гемолимфы из раны. Затем простая микропипетка, состоящая из капилляра и колбы пипетки, используется для забора транссудативной гемолимфы из раны по принципу капиллярных сил. Наконец, собранная гемолимфа может быть растворена в определенном буфере для дальнейшего изучения. Этот новый метод сбора гемолимфы у мелких членистоногих является полезным и эффективным инструментом для дальнейших исследований арбовирусов и векторно-вирусных взаимодействий.
Introduction
Как животные, так и растительные вирусы могут передаваться членистоногими, и эти вирусы представляют серьезную угрозу для здоровья человека и наносят огромные экономические потери в сельском хозяйстве 1,2,3. Важно отметить, что членистоногая гемолимфа, которая служит кровеносной системой и жизненно важным элементом иммунной системы у членистоногих, играет важную роль в регуляции арбовирусной передачи. Вирусы, приобретенные через кишечник членистоногих, транспортируются в другие ткани только после успешного выхода из неблагоприятной среды гемолимфы 4,5,6,7. Жизненный цикл вирусов в гемолимфе членистоногих включает выживание вируса в жидкой плазме, проникновение в гемоцит и транспорт в другие ткани, а в гемолимфе 8,9,10,11,12 возникают различные механизмы взаимодействия вируса и вектора. Например, вертикальная передача RSV SBPH зависит от молекулярного взаимодействия между белком вителлогенина SBPH и белком капсида RSV (вирус рисовой полосы)13,14. Некоторые вирусы могут избегать иммунного ответа гемолимфы путем связывания специфических векторных факторов15,16,17,18. Таким образом, исследование трансмиссионно-вирусных взаимодействий в гемолимфе членистоногих важно для лучшего понимания передачи арбовирусов.
Гемолимфу некоторых мелких насекомых, таких как кузнечики, цикадки и некоторые комары, трудно собрать из-за их размера. Для решения этой проблемы было разработано несколько методов сбора гемолимфы, в том числе введение иглы шприца непосредственно в тело насекомого для извлечения микрообъема гемолимфы, сбор экссудата из места раны пинцетом с тонким наконечником и прямое центрифугирование. Эти методы позволили измерить относительные уровни экспрессии генов и титры вируса в пределах гемолимфы 19,20,21. Однако эффективный метод количественной оценки объема гемолимфы, который необходим для подсчета гемоцитов, количественного определения белка и анализа активности ферментов, в настоящее время недоступен для этих мелких насекомых.
SBPH (маленький коричневый кузнечик) - это тип мелкого насекомого-переносчика с длиной тела около 2-4 мм. SBPH способен передавать различные вирусы растений, включая RSV, вирус шероховатого карлика кукурузы и вирус карликового риса с черными полосами22,23,24. Взаимодействие между SBPH и RSV было глубоко изучено в течение последнего десятилетия. Чтобы облегчить работу с SBPH, мы разработали новый и простой метод сбора гемолимфы. Этот метод, основанный на принципе капиллярных сил, использует капилляр со шкалой для получения гемолимфы насекомого точным и поддающимся количественной оценке образом. Это позволяет эффективно собирать определенный объем гемолимфы из мелких насекомых и более детально изучать среду гемолимфы мелких переносчиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выращивание насекомых
- Поднимите SBPH, используемые в этом эксперименте, на проростках риса (Oryza sativa cv. Nipponbare). Посадите 20 саженцев риса в инкубатор (65 мм x 200 мм) и выращивайте при температуре 25 °C при 16-часовом светлом / 8-часовом темном фотопериоде.
2. Вскрытие SBPH для забора гемолимфы
- Поместите SBPH в центрифужную пробирку и поместите их на ледяную баню на 10-30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте SBPH в ледяную ванну менее чем на 10 минут, иначе насекомые могут оживиться. - Поместите замороженный SBPH на предметное стекло (см. Таблицу материалов) под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов) брюшком вверх. Отрегулируйте фокусировку на шести лапках насекомого.
- Подготовьте два высокоточных пинцета (см. Таблицу материалов) с ультратонкими наконечниками. Одним пинцетом надавите на тело насекомого, чтобы удержать его на месте, а другим осторожно оторвите одну из ног от насекомого.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для насекомых с твердым панцирем можно использовать офтальмологический скальпель для отсечения одной из ног. - Аккуратно прижмите грудную клетку насекомого пинцетом, чтобы гемолимфа вытекла через ранку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гемолимфа представляет собой прозрачные капли без видимых белых пузырьков. Откажитесь от липидов, если есть какие-либо белые хлопья, которые представляют собой загрязнение жировых тел.
3. Забор гемолимфы с помощью микропипеток
- Подготовьте микропипетку. Поместите капиллярную трубку (см. Таблицу материалов) объемом 1 мкл в колбу пипетки (см. Таблицу материалов). Для точных измерений убедитесь, что линия шкалы видна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо небольшое отверстие в верхней части колбы пипетки. - При заборе гемолимфы держите колбу микропипетки и поместите капиллярную трубку близко к ране насекомого. Собрать гемолимфу, выделяющуюся из раны, можно, просто прикоснувшись кончиком капилляра к гемолимфе.
- Слегка заблокируйте пальцем маленькое отверстие в верхней части колбы пипетки, чтобы остановить процесс впитывания, когда жидкость внутри капиллярной трубки достигнет желаемой линии шкалы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно и быстро собирайте один образец из 1 мкл гемолимфы, чтобы избежать загрязнения липидами и закупоривания пробирок. - Нажмите на колбу пипетки, чтобы выгрузить собранную гемолимфу в 100 мкл буфера PBS (137 ммоль / л NaCI, 2,7 ммоль / л KCI, 4,3 ммоль / л Na 2 HPO 4, 1,4 ммоль / л KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Капиллярная трубка вставляется в буфер PBS. - Переход на новую капиллярную трубку при сборе еще 1 мкл образца гемолимфы.
4. Окрашивание Coomassie Blue
- Соберите 3 образца гемолимфы с одинаковым объемом (1 мкл) у личинок 3-й стадии в соответствии с протоколами, описанными на шаге 3, и выгрузите собранную гемолимфу в буфер PBS, чтобы получить общий объем 100 мкл.
- Добавьте 25 мкл 5-кратного буфера загрузки белка (250 ммоль / л трис-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% мас./об. бромфенолового синего, 50% мас./об. глицерина, 5% мас./об. β-меркаптоэтанола) в 100 мкл разбавленных образцов гемолимфы и нагрейте для денатурации белков.
- Загрузите 20 мкл кипяченых образцов в 10% белковый гель SDS-PAGE (см. Таблицу материалов) для разделения белков.
- Окрашивают гель в растворе Coomassie Blue (смешайте 1 г Coomassie Brilliant Blue R-250 с 250 мл изопропанола, 100 мл ледяной уксусной кислоты и 650 мл ddH2O и отфильтруйте любые частицы с помощью фильтровальной бумаги) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем обесцвечивайте гель в течение 1 ч обесцвечивающим раствором (100 мл уксусной кислоты, 400 мл метанола, 500 млddH2O).
5. Определение концентрации белка
- Разбавьте 10 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) до 5 мг/мл, 2,5 мг/мл, 1,25 мг/мл, 0,625 мг/мл и 0,3125 мг/мл буфером PBS, используя метод двукратного разведения.
- Аспирируют 5 мкл буфера PBS и каждую концентрацию растворов BSA на этапе 5.1, добавляют 1 мл 1x реагента красителя Брэдфорда (см. Таблицу материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Используйте буфер PBS в реагенте красителя Брэдфорда в качестве контроля и ноль при OD = 595 нм. Измерьте значения поглощения каждой из оставшихся концентраций белка и составьте стандартную кривую.
- Добавьте 1 мкл гемолимфы из личиночных, женских или мужских SBPH в 100 мкл буфера PBS, а затем центрифуфицируйте образцы при 1000 x g в течение 10 мин при 4 ° C для удаления гемоцитов.
- Аспирируйте 90 мкл надосадочной жидкости в новую центрифужную пробирку и измерьте значения поглощения надосадочной жидкости в соответствии с инструкциями на шаге 5.2.
- Рассчитайте концентрации белка образцов гемолимфы в соответствии с уравнением регрессии стандартной кривой. Включите в эксперименты три биологические реплики с тремя техническими репликами.
6. Микроскопические обнаружения
- Используйте микропипетки для забора гемолимфы из 10-15 ДГПЖ на разных стадиях развития. Собранную гемолимфу добавить в пробирку, содержащую 20 мкл 4% раствора параформальдегида (см. Таблицу материалов). Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут для фиксации гемолимфы.
- Пипетка 20 мкл фиксированных гемоцитов на центр предметного стекла, покрытого силаном (см. Таблицу материалов).
- Высушите каплю в скользящей сушилке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной сушки. - Накройте образец золотым антибактериальным реагентом 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (см. Таблицу материалов) и осмотрите предметное стекло под инвертированным микроскопом (см. Таблицу материалов).
7. Количественная оценка клеток
- Соберите 1 мкл гемолимфы из SBPH с помощью микропипетки и растворите его в 20 мкл буфера PBS.
- Разбавьте образцы гемолимфы в пять раз буфером PBS.
- Пипеткой вводят 20 мкл раствора гемолимфы в центр камеры подсчета клеток (см. Таблицу материалов). Накройте каплю покровным стеклом (см. Таблицу материалов).
- Подсчитайте клетки в пяти квадратах в счетной камере (дополнительный рисунок 1) под перевернутым микроскопом (см. Таблицу материалов). Включите три биологические реплики с тремя техническими репликами в каждый из экспериментов.
Ячейки/мкл = общее количество пяти средних квадратов × 5 × коэффициент разбавления × 104
8. Статистический анализ
- Выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Создайте новый файл, выберите столбец, импортируйте данные и создайте точечную диаграмму с гистограммой.
- Рассчитайте среднее значение и SD для каждой группы данных с помощью статистики столбцов и используйте односторонний инструмент ANOVA для оценки значимости различий между группами. Определите среднее значение и SD из трех биологических реплик с помощью трех независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель микропипетки и коллекция гемолимф
Мы разработали простую микропипетку, действие которой основано на капиллярных силах капиллярной трубки. Микропипетка состоит из капиллярной трубки и колбы пипетки (рис. 1А). Капиллярные трубки доступны в различных объемных размерах от 1 мкл до 20 мкл, а объемы капиллярных трубок выбираются в соответствии с требованиями. Капиллярные трубки с меньшими объемами не рекомендуются, потому что сверхтонкие отверстия трубок меньшего объема могут затруднить всасывание жидкости, такой как гемолимфа. Колба пипетки содержит отверстие сверху, которое нельзя заткнуть во время сбора гемолимфы. Эта колба для пипеток удобна для удержания микропипетки во время сбора жидкости (рис. 1B), а также помогает переносить собранную жидкость из капиллярной трубки в буфер для сбора.
Чтобы легко собирать гемолимфу, в этой работе SBPH сначала замораживали во льду или в холодильнике. Затем эти замороженные SBPH были локализованы на предметном стекле под стереомикроскопом, и одна из ножек каждого SBPH была удалена пинцетом с тонким наконечником (рис. 1C). Чтобы обеспечить большую рану и оптимальный сбор гемолимфы, лучше всего оттянуть ножку у корня (рис. 1Ca, b). Чтобы свести к минимуму риск загрязнения жировым телом, собирали только прозрачные капли жидкости без каких-либо белых хлопьев (рис. 1Cc). Микропипетку использовали для поглощения желаемых объемов гемолимфы (рис. 1Cd). Чтобы собрать 1 мкл гемолимфы, необходимо было рассечь примерно 30-40 личинок SBPH или 8-15 взрослых SPBH.
Анализ собранной гемолимфы
Чтобы оценить точность микропипетки как метода оценки объема собранной гемолимфы, мы проверили концентрации белка в разных образцах. Гемолимфу личинок собирали с помощью микропипетки с объемом капилляров 1 мкл, а три образца белка собирали отдельно и тестировали с помощью геля SDS-PAGE. Результаты показали, что количество белка в трех полосах было почти равным (рис. 2А). Для личинок общее содержание белка составляло 3,707 мг/мл ± 1,382 мг/мл. Мы также собрали одинаковый объем гемолимфы у взрослых женщин и мужчин SBPH, и они показали концентрацию белка 3,515 мг / мл ± 1,400 мг / мл и 3,621 мг / мл ± 0,860 мг / мл соответственно (таблица 1). Не было существенных различий в белке между тремя образцами (рис. 2B).
Кроме того, мы также наблюдали гемоциты внутри собранной личиночной гемолимфы, чтобы оценить качество и чистоту образцов гемолимфы. Гемоциты варьировались по размеру от 2 до 20 нм, и жировое тело не было обнаружено (рис. 2C). Большинство идентифицированных клеток представляли собой плазматоциты диаметром от 5 до 15 нм и часто появлялись в агрегатах25. Затем мы подсчитали клеточные концентрации гемолимфы личинок, взрослых самок и взрослых самцов, и выявленные клеточные концентрации составили 1,794 x 10 5/мкл ± 0,614 x 10 5/мкл, 1,256 x 10 5/мкл ± 0,603 x 10 5/мкл и 1,553 x 10 5/мкл ± 0,474 x 10 5/мкл соответственно (таблица 2). Количество клеток гемоцитов у личинок, взрослых самок и взрослых самцов не показало существенных различий (рис. 2D). Эти результаты указывают на то, что метод сбора микропипеток является надежным и точным способом сбора гемолимфы из SBPH.
Рисунок 1: Схема модели микропипетки и коллекции гемолимфы. (А) Состав микропипетки. Микропипетка состоит из капилляра и колбы пипетки. Объем капилляров колеблется от 1 до 20 мкл. Колба пипетки имеет небольшое отверстие сверху и снизу. Капилляр вставляется в нижнее отверстие, и видна чешуя. (B) Обзорная схема забора гемолимфы с помощью микропипетки. Брюшко насекомого держат лицом вверх, в то время как нога отрывается, индуцируется отток гемолимфы, и гемолимфа собирается в пипетку под стереомикроскопом. (C) Процесс забора гемолимфы с помощью микропипетки. Одну из ножек отрывают у корня пинцетом с тонким наконечником (а), а тело насекомого прижимают, чтобы гемолимфа вытекла наружу (б, в). Гемолимфа из раны собирается в капилляр (d). Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ гемолимфы SBPH. (A) Окрашивание Coomassie Blue, показывающее три реплики собранной личиночной гемолимфы. Подол указывает на гемолимфу. (B) Общие концентрации белка в гемолимфе личиночных, женских и мужских SBPH. (C) Микроскопические изображения, показывающие клетки, присутствующие в гемолимфе в SBPH при 20-кратном и 60-кратном увеличении соответственно. Ядро окрашивали DAPI (синий). Масштабная линейка = 50 мкм. (D) Плотность гемоцитов личиночных, женских и мужских SBPH. Среднее значение и SD были рассчитаны на основе трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Гемолимфа | Концентрация белка (мг/мл) |
| Личинка | 3.707±1.382 |
| Женский | 3.515±1.400 |
| Мужской | 3,621±0,860 |
Таблица 1: Концентрации белка гемолимфы из разных SBPH. Данные были получены из трех биологических реплик.
| Гемолимфа | Концентрация в клетках (10,5 / мкл) |
| Личинка | 1,794±0,614 |
| Женский | 1,256±0,603 |
| Мужской | 1,553±0,474 |
Таблица 2: Суммарные концентрации гемоцитов в гемолимфе из разных ДСПГ. Данные были получены из трех биологических реплик.
Дополнительный рисунок 1: Определение количества ячеек. Четыре угловых квадрата (1, 2, 3 и 4) и центральный квадрат (5) подсчитываются в счетной камере ячеек. Для пограничных ячеек учитываются только две границы (верхняя и левая). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гемолимфа является средой кровеносной системы у членистоногих, и арбовирусы могут проникать в другие ткани членистоногих только в том случае, если они способны выжить во враждебной среде гемолимфы. Сбор высококачественного образца гемолимфы является первым шагом в изучении векторно-вирусных взаимодействий, происходящих в гемолимфе. Сообщалось, что гемолимфа насекомого может быть получена из нескольких участков на теле насекомого, включая рану на передней ноге, незначительный разрез в области головы или слезную рану на животе26,27,28,29. Для определенных приобретений могут работать различные методы сбора. Метод, включающий создание небольшого разреза в суставе головы и шеи, больше подходит для сбора гемолимфы у крупных насекомых, таких как медоносные пчелы26. Создание раны в области головы SBPH является сложной задачей, так как это может повредить другие органы и привести к загрязнению из других тканей. После проделывания слезной раны на животе насекомых погружают в буфер, а затем центрифугируют буфер для извлечения гемолимфы. Это удобный метод сбора липидов с мелких насекомых21. Однако, поскольку в гемоцеле SBPH имеется большое количество жирового тела, рана на части тела может вызвать утечку жирового тела из раны и привести к загрязнению гемолимфы. Этот способ больше подходит для сбора гемолимфы у взрослых SBPH, у которых меньше жирового тела, чем у личинок. Чтобы эффективно предотвратить загрязнение жировых тел, рекомендуется делать рану на ноге, а не непосредственно на теле. В предыдущих исследованиях гемолимфы ДГПЖ пинцет с тонким наконечником использовался для облегчения сбора мелких капель жидкости из раны13. Хотя собранная гемолимфа была очищена от примесей, объем гемолимфы не измерялся. В этом исследовании мы разработали простую микропипетку, которую можно использовать для точного и количественного сбора гемолимфы у очень маленьких насекомых-переносчиков.
Для успешного сбора гемолимфы необходимо учесть несколько важных шагов. Во-первых, необходимо обезболить насекомых при температуре 4 ° C в течение 15 минут, чтобы получить гемолимфу, свободную от жирового тела. Во-вторых, проще получить чистую гемолимфу, оттянув первую ногу. В-третьих, забор гемолимфы должен производиться непрерывно и быстро, так как в противном случае гемолимфа может свертываться на дне и блокировать капилляр.
Метод сбора капилляров широко используется для сбора крови животных30,31. Мы модифицировали методику, чтобы она соответствовала отличительным характеристикам гемолимфы насекомых. Поскольку SBPH обладают небольшими размерами тела, был выбран капилляр с минимальным объемом 1 мкл. Использование капилляров объемом менее 1 мкл не рекомендуется. Примечательно, что гемолимфа содержит высокую плотность белков и значительное количество клеток (рис. 2), которые повышают ее жидкую плотность и затрудняют поглощение гемолимфы через капилляры с меньшими объемами.
Метод сбора гемолимфы капилляром является простым, экономичным и жизнеспособным методом, который позволяет надежно и точно определить гемолимфу. Этот недавно разработанный метод также может быть применен для сбора других следовых жидкостей из мелких переносчиков, таких как медвяная роса. Важно подчеркнуть, что насекомые остаются живыми после извлечения гемолимфы с помощью этого метода. Это полезно для исследований с участием других органов насекомых или для повторного сбора гемолимфы. Эта работа представляет собой ценную технологию для изучения энтомологии и взаимодействия вирусов с переносчиками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (No 2022YFD1401700) и Национальным научным фондом Китая (No 32090013 и No 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
