Summary
我们描述了一种从小型节肢动物中有效收集可量化血淋巴以进行后续分析的方法。
Abstract
众所周知，节肢动物通过其血淋巴传播各种具有医学和农业重要性的病毒，这对于病毒传播至关重要。血淋巴采集是研究病毒-载体相互作用的基本技术。在这里，我们描述了一种新颖而简单的方法，用于定量收集小型节肢动物的血淋巴，使用 Laodelphax striatellus （小棕色飞虱，SBPH）作为研究模型，因为这种节肢动物是水稻条纹病毒（RSV）的主要载体。在该协议中，该过程首先用细尖镊子轻轻捏掉冷冻节肢动物的一条腿，然后将血淋巴从伤口中压出。然后，根据毛细管力原理，使用由毛细管和移液器灯泡组成的简单微量移液器从伤口收集漏出性血淋巴。最后，可以将收集的血淋巴溶解到特定的缓冲液中以供进一步研究。这种从小型节肢动物收集血淋巴的新方法是进一步研究虫媒病毒和载体-病毒相互作用的有用且有效的工具。
Introduction
动植物病毒都可以通过节肢动物传播，这些病毒对人类健康构成严重威胁，给农业造成巨大的经济损失1，2，3。重要的是，节肢动物血淋巴作为节肢动物的循环系统和免疫系统的重要组成部分，在调节虫媒病毒传播方面起着重要作用。通过节肢动物肠道获得的病毒只有在成功逃脱不良血淋巴环境后才会转运到其他组织4，5，6，7。节肢动物血淋巴中病毒的生命周期涉及病毒在血浆中存活、进入血细胞并转运到其他组织，血淋巴中发生各种病毒-载体相互作用机制8、9、10、11、12。例如，SBPH 对 RSV 的垂直传播取决于 SBPH 卵黄素蛋白和 RSV（米条纹病毒）衣壳蛋白13，14 之间的分子相互作用。一些病毒可能通过结合特定的载体因子15，16，17，18来逃避血淋巴的免疫反应。因此，研究节肢动物血淋巴中的载体-病毒相互作用对于更好地了解虫媒病毒传播非常重要。
一些小昆虫的血淋巴，如飞虱、叶蝉和一些蚊子，由于其体型的原因，很难收集。为了解决这个问题，已经开发了几种收集血淋巴的方法，包括将注射器针头直接插入昆虫体内以提取微量的血淋巴，用细尖镊子从伤口部位收集渗出物，以及直接离心。这些方法能够测量血淋巴内的相对基因表达水平和病毒滴度19，20，21。然而，对于这些小昆虫，目前还没有一种有效的血淋巴体积定量方法，这是血细胞计数、蛋白质定量和酶活性分析所必需的。
SBPH（小棕色飞虱）是一种体长约2-4毫米的小型昆虫媒介。SBPH能够传播多种植物病毒，包括RSV，玉米粗矮病毒和水稻黑条纹矮病毒22，23，24。在过去十年中，对SBPH和RSV之间的相互作用进行了深入研究。为了便于使用SBPH，我们开发了一种新颖而简单的血淋巴收集方法。这种方法基于毛细管力原理，使用带有刻度标记的毛细管以精确和可量化的方式获取昆虫的血淋巴。这使我们能够有效地从小昆虫中收集特定体积的血淋巴，并更详细地研究小载体的血淋巴环境。
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Protocol
1. 昆虫饲养
- 提高本实验中使用的水稻幼苗（Oryza sativa cv. Japanbonbare）的SBPH。在培养箱（65mm x 200mm）中种植20棵水稻幼苗，并在16小时光照/ 8小时黑暗光周期下在25°C下生长。
2. 解剖 SBPH 以收集血淋巴
- 将SBPH放入离心管中，并将它们置于冰浴中10-30分钟。
注意：不要将SBPH放入冰浴中少于10分钟，否则昆虫可能会复活。 - 将冷冻的SBPH放在立体显微镜下的载玻片（见材料表）上，其腹部朝上。调整昆虫六条腿的焦点。
- 准备两个带有超细尖端的高精度镊子（见 材料表）。用一把镊子压在昆虫的身体上以使其保持在原位，然后用另一把镊子小心地将一条腿从昆虫身上拉下来。
注意：对于硬壳昆虫，可以使用眼科手术刀切断其中一条腿。 - 用镊子轻轻按压昆虫的胸部，使血淋巴通过伤口流出。
注意：血淋巴表现为透明飞沫，没有任何可见的白色絮状物。如果有任何白色絮凝物，则丢弃脂质，这代表脂肪体污染。
3. 使用微量移液器收集血淋巴
- 准备微量移液器。将体积为1μL的毛细管（见材料表）放入移液器灯泡中（见材料表）。为了进行准确的测量，请确保刻度线可见。
注意：移液器灯泡顶部的一个小孔是必要的。 - 收集血淋巴时，握住微量移液器的移液器灯泡，并将毛细管靠近昆虫伤口。通过简单地将毛细血管的尖端接触到血淋巴来收集从伤口渗出的血淋巴。
- 当毛细管内的液体达到所需的刻度线时，用手指稍微堵住移液器灯泡顶部的小孔，以停止吸收过程。
注意：连续快速地收集一个 1 μL 血淋巴样本，以避免脂质污染和管堵塞。 - 按下移液器灯泡，将收集的血淋巴液排出到 100 μL PBS 缓冲液中（137 毫摩尔/升 NaCI、2.7 毫摩尔/升 KCI、4.3 毫摩尔/升钠 2 HPO 4、1.4 毫摩尔/升KH2 PO 4，pH 7.2-7.4）。
注意：毛细管插入PBS缓冲液中。 - 收集另外 1 μL 血淋巴样品时，更换为新的毛细管。
4. 考马斯蓝染色
- 根据步骤3中描述的方案从3期幼虫收集3个相同体积（1μL）的血淋巴样品，并将收集的血淋巴排出到PBS缓冲液中，使总体积为100μL。
- 将 25 μL 5x 蛋白质上样缓冲液（250 mmol/L Tris-HCI [pH 6.8]、10% W/V SDS、0.05% W/V 溴酚蓝、50% W/V 甘油、5% W/V β-巯基乙醇）加入到 100 μL 稀释的血淋巴样品中，加热使蛋白质变性。
- 将 20 μL 煮沸的样品上样到 10% SDS-PAGE 蛋白质凝胶（参见 材料表）上以分离蛋白质。
- 将凝胶染色在考马斯蓝溶液中（将1g考马斯亮蓝R-250与250mL异丙醇，100mL冰醋酸和650mLddH2O混合，并使用滤纸过滤掉任何颗粒）在室温下1小时，然后用脱色溶液（100mL乙酸， 400 mL 甲醇，500 mLddH 2O）。
5. 蛋白质浓度测定
- 使用两倍稀释法将 10 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 稀释至 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 和 0.3125 mg/mL。
- 在步骤5.1中吸出5μLPBS缓冲液和每种浓度的BSA溶液，加入1mL的1x布拉德福德染料试剂（参见 材料表），并在室温下孵育5分钟。使用布拉德福德染料试剂中的PBS缓冲液作为对照，OD = 595nm时为零。测量每种剩余蛋白质浓度的吸光度值，并制作标准曲线。
- 将来自幼虫、雌性或雄性 SBPH 的 1 μL 血淋巴液加入 100 μL PBS 缓冲液中，然后在 4 °C 下以 1，000 x g 离心样品 10 分钟以除去血细胞。
- 将90μL上清液吸入新的离心管中，并根据步骤5.2中的说明测量上清液的吸光度值。
- 根据标准曲线的回归方程计算血淋巴样品的蛋白质浓度。在实验中包括三个生物学重复和三个技术重复。
6. 显微检测
- 使用微量移液器收集不同发育阶段的10-15 SBPH的血淋巴。将收集的血淋巴液加入含有20μL4%多聚甲醛溶液的管中（参见 材料表）。将混合物在室温下孵育30分钟以固定血淋巴。
- 将20μL固定的血细胞移液到涂有硅烷的载玻片的中心（参见 材料表）。
- 在载玻片晾衣架中干燥液滴。
注意：避免过度干燥。 - 用金抗淬灭试剂4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）覆盖样品（见材料表），并在倒置显微镜下检查载玻片（见材料表）。
7. 细胞定量
- 用微量移液器从SBPH中收集1μL血淋巴，并将其溶解到20μLPBS缓冲液中。
- 用PBS缓冲液将血淋巴样品稀释五倍。
- 将20μL血淋巴溶液移液到细胞计数室的中心（参见 材料表）。用盖玻片盖住液滴（见 材料表）。
- 在倒置显微镜下对细胞计数室（补充图1）上的五个方块中的细胞进行计数（参见 材料表）。在每个实验中包括三个生物学重复和三个技术重复。
细胞/μL = 5 个中间平方的总计数 × 5 × 稀释因子 × 104
8. 统计分析
- 使用相应的软件进行统计分析（见 材料表）。创建一个新文件，选择列，导入数据，然后生成带有条形的散点图。
- 使用列统计量计算每组数据的平均值和 SD，并使用单因子方差分析工具评估组间差异的显著性。通过三个独立实验从三个生物学重复中确定平均值和SD。
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Representative Results
微量移液器模型和血淋巴收集
我们开发了一种简单的微量移液器，其作用基于毛细管的毛细管力。微量移液器由毛细管和移液器灯泡组成（图1A）。毛细管有不同的体积尺寸，范围从 1 μL 到 20 μL，毛细管体积可根据要求选择。不建议使用体积较小的毛细管，因为较小体积的毛细管的额外细孔会使吸收血淋巴等液体变得困难。移液器灯泡顶部有一个孔，在血淋巴收集过程中无法堵塞。该移液器灯泡便于在液体收集过程中保持微量移液器（图1B），还有助于将收集的液体从毛细管转移到收集缓冲液中。
为了容易地收集血淋巴，在这项工作中，首先将SBPHs冷冻在冰中或冰箱中。然后将这些冷冻的SBPH定位在体视显微镜下的载玻片上，并用细尖镊子拉下每个SBPH的一条腿（图1C）。为了确保大伤口和最佳的血淋巴收集，最好从根部拉下腿（图1Ca， b）。为了尽量减少脂肪体污染的风险，仅收集没有任何白色絮凝物的透明液滴（图1Cc）。微量移液器用于吸收所需体积的血淋巴液（图1Cd）。为了收集 1 μL 的血淋巴，必须解剖大约 30-40 个幼虫 SBPH 或 8-15 个成年 SPBH。
分析收集的血淋巴
为了评估微量移液器作为评估收集的血淋巴体积的方法的准确性，我们测试了不同样品的蛋白质浓度。使用毛细管体积为1μL的微量移液器收集幼虫的血淋巴，并分别收集三个蛋白质样品并通过运行SDS-PAGE凝胶进行测试。结果表明，三个泳道中的蛋白质量几乎相等（图2A）。幼虫的总蛋白质含量为3.707 mg/mL±1.382 mg/mL。我们还从成年女性和男性SBPH中收集了相同体积的血淋巴，这些血淋巴的蛋白质浓度分别为3.515mg / mL±1.400mg / mL和3.621mg / mL±0.860mg / mL（表1）。三个样品之间的蛋白质没有显着差异（图2B）。
此外，我们还观察了采集的幼虫血淋巴内部的血细胞，以评估血淋巴样本的质量和纯度。血细胞的大小在2-20nm之间变化，并且没有检测到脂肪体（图2C）。鉴定出的大多数细胞是浆细胞，直径范围为5-15nm，通常以聚集体25的形式出现。然后，我们计数幼虫、成年雌性和成年雄性血淋巴的细胞浓度，鉴定的细胞浓度分别为 1.794 x 10 5/μL ± 0.614 x 10 5/μL、1.256 x 10 5/μL ± 0.603 x 10 5/μL 和 1.553 x 10 5/μL ± 0.474 x10 5/μL（表 2）。幼虫，成年雌性和成年雄性的血细胞计数没有显着差异（图2D）。这些结果表明，微量移液器收集法是从SBPH收集血淋巴液的可靠和准确的方法。
图1：微量移液器模型和血淋巴收集示意图 。 （A）微量移液器组合物。微量移液器由毛细管和移液器灯泡组成。毛细管体积范围为 1-20 μL。移液器灯泡的顶部和底部都有一个小孔。毛细管插入底孔，可见水垢。（B）用微量移液器收集血淋巴的概述图。当一条腿分离时，昆虫腹部保持朝上，诱导血淋巴流出，并在体视显微镜下将血淋巴收集到移液管中。（C）用微量移液管收集血淋巴的过程。其中一条腿用细尖镊子（a）在根部拉下，并按压昆虫的身体以使血淋巴流出（b，c）。伤口的血淋巴被收集到毛细血管中（d）。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：SBPH血淋巴的分析 。 （A）考马斯蓝染色显示收集的幼虫血淋巴的三个重复。下摆表示血淋巴。（B）幼虫，雌性和雄性SBPH的血淋巴的总蛋白质浓度。 （C）显微图像分别显示SBPH中血淋巴中存在的细胞，放大倍数分别为20倍和60倍。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 50 μm。 （D） 幼虫、雌性和雄性 SBPH 的血细胞密度。平均值和SD是通过三个独立实验计算的。 请点击此处查看此图的大图。
| 血 | 蛋白质浓度（毫克/毫升） |
| 幼虫 | 3.707±1.382 |
| 女性 | 3.515±1.400 |
| 雄 | 3.621±0.860 |
表1：来自不同SBPH的血淋巴蛋白浓度。 数据是从三个生物学重复中获得的。
| 血 | 细胞浓度（105 / μL） |
| 幼虫 | 1.794±0.614 |
| 女性 | 1.256±0.603 |
| 雄 | 1.553±0.474 |
表2：来自不同SBPH的血淋巴中血细胞的总浓度。 数据是从三个生物学重复中获得的。
补充图1：确定细胞数量。 四个角方块（1、2、3 和 4）和中央正方形 （5） 计数在细胞计数室上。对于边框单元格，仅计算两个边界（顶部和左侧）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
血淋巴是节肢动物循环系统的介质，虫媒病毒只有在恶劣的血淋巴环境中生存下来，才能侵入其他节肢动物组织。收集高质量的血淋巴样本是研究血淋巴中发生的载体-病毒相互作用的第一步。据报道，昆虫血淋巴可以从昆虫身体的几个部位获得，包括前腿上的伤口、头部区域的小切口或腹部的撕裂伤口26、27、28、29。不同的收集方法可能适用于某些采集。涉及在头颈部关节处创建小切口的方法更适合于从蜜蜂等大型昆虫身上收集血淋巴26。在SBPH的头部区域造成伤口具有挑战性，因为它可能会损害其他器官并引入其他组织的污染。在腹部做撕裂伤口后，将昆虫浸入缓冲液中，然后离心缓冲液以提取血淋巴。这是从小昆虫中收集脂质的便捷方法21。然而，由于SBPHs的血腔内有大量的脂肪体，身体部位的伤口可能会导致脂肪体从伤口泄漏并导致血淋巴污染。这种方法更适合从成年SBPH中收集血淋巴，其身体脂肪比幼虫少。为了有效防止脂肪体污染，建议在腿部部位而不是直接在身体上做伤口。在先前的SBPH血淋巴研究中，使用细尖镊子来促进从伤口收集小滴液体13。虽然收集的血淋巴没有杂质，但没有测量血淋巴体积。在这项研究中，我们开发了一种简单的微量移液器，可用于准确定量地从非常小的昆虫载体中收集血淋巴。
为了成功收集血淋巴，必须考虑几个关键步骤。首先，必须在4°C下麻醉昆虫15分钟，以产生不含脂肪体的血淋巴。其次，通过拉开第一条腿来获得纯血淋巴更简单。第三，血淋巴的收集应以连续和快速的方式进行，否则血淋巴可能会在底部凝结并阻塞毛细血管。
毛细血管采集技术已广泛应用于动物采血30，31。我们修改了该技术以适应昆虫血淋巴的独特特征。由于SBPH具有较小的体型，因此选择了最小体积为1 μL的毛细管。不建议使用体积小于 1 μL 的毛细管。值得注意的是，血淋巴含有高密度的蛋白质和相当数量的细胞（图2），这提高了其液体密度，并且难以通过体积较小的毛细血管 吸收 血淋巴。
通过毛细血管收集血淋巴的方法是一种简单、经济高效且可行的技术，能够可靠、精确地定量血淋巴。这种新开发的方法也可用于从小载体（如蜜露）中收集其他痕量液体。重要的是要强调，使用这种方法提取血淋巴后昆虫仍然活着。这对于涉及其他昆虫器官的研究或重复血淋巴收集是有益的。这项工作为昆虫学和病毒-载体相互作用的研究提供了有价值的技术。
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Disclosures
提交人声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研发计划（编号：2022YFD1401700）和国家自然科学基金（编号：32090013和32072385）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
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