Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65250

Summary

אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.

Abstract

פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.

Introduction

וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות 1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוסים בהמולימפה פרוק הרגליים כרוך בהישרדות הנגיף בפלזמה הנוזלית, כניסה להמוציטים והעברה לרקמות אחרות, ומנגנוני אינטראקציה שונים בין וירוסים לווקטורים מתרחשים בהמולימפה 8,9,10,11,12. לדוגמה, העברה אנכית של RSV על ידי SBPH תלויה באינטראקציה מולקולרית בין חלבון SBPH vitellogenin לבין חלבון RSV (וירוס פס אורז) capsidprotein 13,14. וירוסים מסוימים עשויים לברוח מהתגובה החיסונית של ההמולימפה על ידי קשירת גורמים וקטוריים ספציפיים15,16,17,18. לכן, חקירת אינטראקציות וקטור-וירוס בהמולימפה של פרוקי רגליים חשובה לפיתוח הבנה טובה יותר של העברת arbovirus.

המולימפה של כמה חרקים קטנים, כגון planthoppers, leafhoppers, וכמה יתושים, קשה לאסוף בשל גודלם. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחו מספר שיטות לאיסוף המולימפה, כולל החדרת מחט מזרק ישירות לגוף החרק כדי לחלץ מיקרו-נפח של ההמולימפה, איסוף הפרשה מאתר הפצע באמצעות פינצטה עדינה, וצנטריפוגה ישירה. שיטות אלה אפשרו מדידה של רמות ביטוי גנים יחסיות וטיטרים נגיפיים בתוך המולימפה 19,20,21. עם זאת, שיטה יעילה לכימות נפח המולימפה, הנחוצה לספירת המוציטים, כימות חלבונים וניתוח פעילות אנזימים, אינה זמינה כיום עבור חרקים קטנים אלה.

SBPH (פלנטהופר חום קטן) הוא סוג של וקטור חרקים קטן עם אורך גוף של כ 2-4 מ"מ. SBPH מסוגל להעביר מגוון רחב של וירוסים צמחיים, כולל RSV, תירס גס ננס וירוס, אורז שחור פסים ננס וירוס22,23,24. האינטראקציה בין SBPH ו- RSV נחקרה לעומק בעשור האחרון. כדי להקל על העבודה עם SBPHs, פיתחנו שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף המולימפה. שיטה זו, המבוססת על עקרון הכוחות הנימיים, משתמשת בנימים בעלי סימן קנה מידה כדי לרכוש את ההמולימפה של החרק באופן מדויק וניתן לכימות. זה מאפשר לנו לאסוף נפח מסוים של המולימפה מחרקים קטנים ביעילות וללמוד את סביבת ההמולימפה של וקטורים קטנים בפירוט רב יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. גידול חרקים

  1. העלו את ה-SBPHs המשמשים בניסוי זה בשתילי אורז (Oryza sativa cv. Nipponbare). שתול 20 שתילי אורז באינקובטור (65 מ"מ x 200 מ"מ), וגדל ב 25 ° C תחת 16 שעות אור / 8 שעות כהה.

2. נתיחת SBPHs לאוסף המולימפה

  1. הכניסו את SBPHs לתוך צינור צנטריפוגה, והניחו אותם באמבט קרח למשך 10-30 דקות.
    הערה: אין להניח את ה-SBPHs באמבט הקרח למשך פחות מ-10 דקות, אחרת החרקים עלולים להתעורר.
  2. הניחו SBPH קפוא על מגלשת זכוכית (ראו טבלת חומרים) מתחת לסטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה. התאימו את המיקוד לשש רגליו של החרק.
  3. הכינו שתי פינצטות בדיוק גבוה (ראו טבלת חומרים) עם קצוות עדינים במיוחד. השתמש בפינצטה אחת כדי ללחוץ על גוף החרק כדי לשמור אותו במקומו, והשתמש בפינצטה השנייה כדי למשוך בזהירות את אחת הרגליים מהחרק.
    הערה: עבור חרקים עם קליפה קשה, אזמל עיניים יכול לשמש לחיתוך אחת הרגליים.
  4. לחץ בעדינות על החזה של החרק עם פינצטה כדי לגרום להמולימפה לזרום החוצה דרך הפצע.
    הערה: ההמולימפה מוצגת כטיפות שקופות ללא כל פלוקול לבן נראה לעין. יש להשליך את השומנים אם יש פלוקול לבן, המייצג זיהום גוף שומן.

3. אוסף המולימפה באמצעות מיקרופיפטות

  1. הכינו מיקרופיפטה. הניחו צינור נימי (ראו טבלת חומרים) בנפח של 1 μL לתוך נורת פיפטה (ראו טבלת חומרים). למדידות מדויקות, ודא שקו קנה המידה גלוי.
    הערה: יש צורך בחור קטן בחלק העליון של נורת הפיפטה.
  2. בעת איסוף ההמולימפה, להחזיק את נורת פיפטה של micropipette, ומניחים את צינור נימי קרוב לפצע החרק. לאסוף את hemolymph exparing מן הפצע פשוט על ידי נגיעה בקצה הנימים כדי hemolymph.
  3. חסום מעט את החור הקטן בחלק העליון של נורת פיפטה עם האצבע כדי לעצור את תהליך הספיגה כאשר הנוזל בתוך צינור הנימים מגיע לקו קנה המידה הרצוי.
    הערה: יש לאסוף דגימה אחת של 1 מיקרוליטר של המולימפה ללא הרף ובמהירות כדי למנוע זיהום שומנים וחיבור צינורות.
  4. לחץ על נורת פיפטה כדי לפרוק את ההמולימפה שנאספה לתוך 100 μL של חיץ PBS (137 mmol / L NaCI, 2.7 mmol / L KCI, 4.3 mmol / L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4).
    הערה: צינור הנימים מוכנס למאגר PBS.
  5. שנה לצינור נימי חדש בעת איסוף דגימה נוספת של 1 μL של המולימפה.

4. צביעה כחולה קומאסי

  1. אסוף 3 דגימות המולימפה באותו נפח (1 μL) מזחלי השלב השלישי בהתאם לפרוטוקולים המתוארים בשלב 3, ושחרר את ההמולימפה שנאספה לתוך מאגר PBS כדי ליצור נפח כולל של 100 μL.
  2. הוסף 25 μL של מאגר העמסת חלבון 5x (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W/V SDS, 0.05% W/V ברומופנול כחול, 50% W/V גליצרול, 5% W/V β-מרקפטואתנול) לתוך 100 μL של דגימות המולימפה מדולל, וחממו כדי לנטרל את החלבונים.
  3. טען 20 μL של הדגימות המבושלות על ג'ל חלבון 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים) כדי להפריד את החלבונים.
  4. מכתימים את הג'ל בתמיסת Coomassie Blue (מערבבים 1 גרם של Coomassie Brilliant Blue R-250 עם 250 מ"ל איזופרופנול, 100 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ו-650 מ"ל של ddH2O, ומסננים את כל החלקיקים באמצעות נייר פילטר) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מסירים את צבע הג'ל למשך שעה אחת עם תמיסת דה-צבעה (100 מ"ל חומצה אצטית, 400 מ"ל מתנול, 500 מ"ל של ddH2O).

5. קביעת ריכוז החלבונים

  1. יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) במינון 10 מ"ג/מ"ל ל-5 מ"ג/מ"ל, 2.5 מ"ג/מ"ל, 1.25 מ"ג/מ"ל, 0.625 מ"ג/מ"ל ו-0.3125 מ"ג/מ"ל באמצעות חיץ PBS בשיטת הדילול הכפול.
  2. שאפו 5 מיקרוליטר של חיץ PBS וכל ריכוז של תמיסות BSA בשלב 5.1, הוסיפו 1 מ"ל של מגיב צבע ברדפורד 1x (ראו טבלת חומרים), ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש במאגר PBS בריאגנט צבע ברדפורד כבקרה, ואפס ב- OD = 595 ננומטר. למדוד את ערכי הספיגה של כל אחד מריכוזי החלבונים הנותרים, ולבצע עקומה סטנדרטית.
  3. הוסף 1 μL של המולימפה מזחלים, נקבות או זכרים SBPHs לתוך 100 μL של חיץ PBS, ולאחר מכן צנטריפואט את הדגימות ב 1,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המוציטים.
  4. יש לשאוף 90 מיקרוליטר של סופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש, ולמדוד את ערכי הספיגה של הסופרנאטנט בהתאם להוראות בשלב 5.2.
  5. חישוב ריכוזי החלבונים של דגימות ההמולימפה על פי משוואת הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית. כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בניסויים.

6. גילויים מיקרוסקופיים

  1. השתמש micropipettes לאסוף hemolymph מ 10-15 SBPHs בשלבים התפתחותיים שונים. הוסף את ההמולימפה שנאספה לתוך צינור המכיל 20 μL של תמיסת 4% paraformaldehyde (ראה טבלה של חומרים). דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לתקן את ההמולימפה.
  2. פיפטה 20 μL של המוציטים קבועים על מרכז שקופית מצופה סילאן (ראה טבלת חומרים).
  3. יבשו את הטיפה במתלה לייבוש שקופיות.
    הערה: יש להימנע מייבוש יתר.
  4. כסו את הדגימה בריאגנט אנטי-דהייה זהב 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (ראו טבלת חומרים), ובדקו את השקופית תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים).

7. כימות התא

  1. לאסוף 1 μL של hemolymph מן SBPHs עם micropipette, ולהמיס אותו לתוך 20 μL של מאגר PBS.
  2. לדלל את דגימות ההמולימפה פי חמישה עם חיץ PBS.
  3. פיפטה 20 μL של תמיסת המולימפה למרכז תא ספירת התאים (ראה טבלת חומרים). כסו את הטיפה בפתק כיסוי (ראו טבלת חומרים).
  4. ספרו את התאים בחמשת הריבועים בתא ספירת התאים (איור משלים 1), תחת מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים). כלול שלושה משכפלים ביולוגיים עם שלושה שכפולים טכניים בכל אחד מהניסויים.
    תאים/μL = ספירה כוללת של חמישה ריבועים אמצעיים × 5 × גורם דילול × 104

8. ניתוחים סטטיסטיים

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים עם התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים). צור קובץ חדש, בחר בעמודה, ייבא את הנתונים וצור התוויית פיזור עם סרגל.
  2. חשב את הממוצע וה- SD עבור כל קבוצת נתונים באמצעות סטטיסטיקת עמודות, והשתמש בכלי ANOVA חד-כיווני כדי להעריך את משמעות ההבדלים בין הקבוצות. לקבוע את הממוצע ואת SD מתוך שלושה עותקים ביולוגיים עם שלושה ניסויים עצמאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דגם מיקרופיפטה וקולקציית המולימפה
פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שפעולתה מבוססת על הכוחות הקפילריים של צינור הנימים. המיקרופיפטה מורכבת מצינור נימי ומנורת פיפטה (איור 1A). צינורות נימים זמינים בגדלי נפח שונים הנעים בין 1 μL ל 20 μL, ונפחי הצינור הנימי נבחרים בהתאם לדרישות. צינורות נימים עם נפחים קטנים יותר אינם מוצעים מכיוון שהפתחים העדינים במיוחד של צינורות בעלי נפח קטן יותר יכולים להקשות על ספיגת נוזלים כגון המולימפה. נורת הפיפט מכילה חור בחלק העליון שלא ניתן לסתום במהלך איסוף ההמולימפה. נורת פיפטה זו נוחה להחזקת המיקרופיפטה במהלך איסוף הנוזלים (איור 1B) וגם מסייעת בהעברת הנוזל שנאסף מצינור הנימים לתוך מאגר האיסוף.

על מנת לאסוף המולימפה בקלות, בעבודה זו, SBPHs היו קפואים תחילה בקרח או במקרר. לאחר מכן ה-SBPHs הקפואים האלה מוקמו על שקופית מתחת לסטריאו-מיקרוסקופ, ואחת הרגליים של כל SBPH נשלפה באמצעות פינצטה עדינה (איור 1C). כדי להבטיח פצע גדול ואיסוף מיטבי של המולימפה, עדיף לעקור את הרגל מהשורש (איור 1Ca, b). כדי למזער את הסיכון לזיהום על-ידי גוף השומן, נאספו רק טיפות נוזל שקופות ללא פלוקול לבן (איור 1Cc). המיקרופיפטה שימשה לספיגת הנפחים הרצויים של המולימפה (איור 1Cd). כדי לאסוף 1 μL של המולימפה, היה צורך לנתח כ 30-40 SBPHs זחלים או 8-15 SPBHs בוגרים.

ניתוח ההמולימפה שנאספה
כדי להעריך את הדיוק של המיקרופיפטה כשיטה להערכת נפח המולימפה שנאספת, בדקנו את ריכוזי החלבונים של דגימות שונות. המולימפה מזחלים נאספה באמצעות מיקרופיפטה בעלת נפח נימי של 1 μL, ושלוש דגימות חלבון נאספו בנפרד ונבדקו על ידי הפעלת ג'ל SDS-PAGE. התוצאות הראו שכמות החלבון בשלושת הנתיבים הייתה כמעט שווה (איור 2A). עבור הזחלים, תכולת החלבון הכוללת הייתה 3.707 מ"ג/מ"ל ±-1.382 מ"ג/מ"ל. אספנו גם את אותו נפח של המולימפה מנשים בוגרות ומגברים SBPHs, ואלה הראו ריכוזי חלבון של 3.515 מ"ג/מ"ל ±-1.400 מ"ג/מ"ל ו-3.621 מ"ג/מ"ל ±-0.860 מ"ג/מ"ל, בהתאמה (טבלה 1). לא היו הבדלים משמעותיים בחלבון בין שלוש הדגימות (איור 2B).

בנוסף, צפינו גם בהמוציטים בתוך המולימפה הזחלית שנאספה כדי להעריך את האיכות והטוהר של דגימות ההמולימפה. גודלם של ההמוציטים נע בין 2 ל-20 ננומטר, ולא זוהה גוף שומן (איור 2C). רוב התאים שזוהו היו פלסמטוציטים, בקוטר של 5-15 ננומטר והופיעו לעתים קרובות בצברים25. לאחר מכן ספרנו את ריכוזי התאים של ההמולימפה מזחלים, נקבות בוגרות וזכרים בוגרים, וריכוזי התאים שזוהו היו 1.794 x 10 5/μL ± 0.614 x 10 5/μL, 1.256 x 10 5/μL ± 0.603 x 10 5/μL ו- 1.553 x 10 5/μL ± 0.474 x 10 5/μL, בהתאמה (טבלה 2). ספירת תאי ההמוציטים בזחלים, בנקבות בוגרות ובזכרים בוגרים לא הראתה הבדלים משמעותיים (איור 2D). תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת איסוף המיקרופיפטה היא דרך אמינה ומדויקת לאסוף המולימפה מ- SBPHs.

Figure 1
איור 1: סכמה של מודל המיקרופיפטה ואוסף המולימפה. (A) הרכב מיקרופיפטה. המיקרופיפטה מורכבת מנימי ונורת פיפטה. נפחי הנימים נעים בין 1-20 μL. לנורת פיפטה יש חור קטן בחלק העליון והתחתון. הנימים מוכנסים לחור התחתון, והסולם גלוי. (B) דיאגרמת סקירה כללית של אוסף המולימפה עם מיקרופיפטה. בטן החרק נשארת עם הפנים כלפי מעלה בזמן שהרגל מנותקת, זרימת ההמולימפה מושרית, וההמולימפה נאספת לתוך פיפטה תחת סטריאומיקרוסקופ. (C) תהליך איסוף המולימפה עם מיקרופיפטה. אחת הרגליים נשלפת מהשורש בפינצטה עדינה (a), וגוף החרק נלחץ כדי לגרום להמולימפה לזרום החוצה (b,c). ההמולימפה מהפצע נאספת לתוך הנימים (d). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח של המולימפה SBPH. (A) כתמים כחולים של קומאסי המראים שלושה העתקים של המולימפה הזחלית שנאספה. Hem מציין hemolymph. (B) ריכוזי החלבון הכוללים של המולימפה של זחלים, נקבות וזכרים SBPHs. (C) תמונות מיקרוסקופיות המראות את התאים הנמצאים בהמולימפה ב-SBPHs בהגדלה של פי 20 ו-60x, בהתאמה. הגרעין היה מוכתם ב-DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D) צפיפות המוציטים של זחלים, נקבות וזכרים SBPHs. הממוצע וה-SD חושבו משלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המולימפה ריכוז חלבון (מ"ג/מ"ל)
זחל 3.707±1.382
נקבה 3.515±1.400
זכר 3.621±0.860

טבלה 1: ריכוזי חלבון של המולימפה מ-SBPHs שונים. הנתונים התקבלו משלושה עותקים ביולוגיים.

המולימפה ריכוז תאים (105 / μL)
זחל 1.794±0.614
נקבה 1.256±0.603
זכר 1.553±0.474

טבלה 2: הריכוזים הכוללים של המוציטים בהמולימפה מ-SBPHs שונים. הנתונים התקבלו משלושה עותקים ביולוגיים.

תרשים משלים 1: קביעת מספר התאים. ארבעת ריבועי הפינה (1, 2, 3 ו-4) והריבוע המרכזי (5) נספרים בתא ספירת התאים. עבור תאי גבול, רק שני הגבולות (עליון ושמאלי) נספרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספר אתרים בגוף החרק, כולל פצע ברגל הקדמית, חתך קל באזור הראש, או פצע קרע בבטן26,27,28,29. שיטות איסוף שונות עשויות לעבוד עבור רכישות מסוימות. השיטה של יצירת חתך קטן במפרק הראש-צוואר מתאימה יותר לאיסוף המולימפה מחרקים גדולים כמו דבורי דבש26. יצירת פצע באזור הראש של SBPH היא מאתגרת מכיוון שהיא עלולה לפגוע באיברים אחרים ולהכניס זיהום מרקמות אחרות. לאחר יצירת פצע דמעה בבטן, החרקים שקועים בחיץ, ולאחר מכן החיץ הוא צנטריפוגה כדי לחלץ את ההמולימפה. זוהי שיטה נוחה לאסוף שומנים מחרקים קטנים21. עם זאת, מכיוון שיש כמות גבוהה של גוף שומן בתוך ההמוקול של SBPHs, פצע בחלק הגוף עלול לגרום לדליפת שומן מהפצע ולהוביל לזיהום של המולימפה. שיטה זו מתאימה יותר לאיסוף המולימפה מ- SBPHs בוגרים, שיש להם פחות גוף שומן מאשר זחלים. כדי למנוע ביעילות זיהום גוף שומן, מומלץ לעשות פצע באתר הרגל ולא ישירות על הגוף. במחקרים קודמים של המולימפה SBPH, פינצטה עדינה שימשו כדי להקל על איסוף טיפות קטנות של נוזל מן הפצע13. למרות שההמולימפה שנאספה הייתה נקייה מטומאה, נפח ההמולימפה לא נמדד. במחקר זה פיתחנו מיקרופיפטה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לאסוף באופן מדויק וכמותי המולימפה מווקטורים של חרקים קטנים מאוד.

לאיסוף מוצלח של המולימפה, יש לקחת בחשבון מספר צעדים קריטיים. ראשית, חיוני להרדים את החרקים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על מנת לייצר המולימפה כי הוא ללא גוף שומן. שנית, פשוט יותר להשיג המולימפה טהורה על ידי משיכת הרגל הראשונה. שלישית, איסוף ההמולימפה צריך להיעשות באופן רציף ומהיר, אחרת ההמולימפה עלולה לנקרש בתחתית ולחסום את הנימים.

טכניקת איסוף הנימים נמצאת בשימוש נרחב לאיסוף דם בעלי חיים30,31. שינינו את הטכניקה כך שתתאים למאפיינים הייחודיים של המולימפה של חרקים. מכיוון של- SBPHs יש גודל גוף קטן, נבחר נימי עם נפח מינימלי של 1 μL. שימוש נימי עם נפח נמוך מ 1 μL לא מומלץ. ראוי לציין שהמולימפה מכילה צפיפות גבוהה של חלבונים ומספר ניכר של תאים (איור 2), אשר מעלים את צפיפות הנוזלים שלה ומקשים על ספיגת המולימפה באמצעות נימים בעלי נפחים קטנים יותר.

שיטת איסוף ההמולימפה על ידי נימים היא טכניקה פשוטה, חסכונית ובת קיימא המאפשרת כימות אמין ומדויק של ההמולימפה. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת גם עבור איסוף של נוזלי קורט אחרים מווקטורים קטנים, כגון טל דבש. חשוב להדגיש כי החרקים נשארים בחיים לאחר מיצוי המולימפה בשיטה זו. זה מועיל למחקרים המערבים איברי חרקים אחרים או לאיסוף חוזר של המולימפה. עבודה זו מציגה טכנולוגיה רבת ערך לחקר אנטומולוגיה ואינטראקציות וירוס-וקטור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין (מס '2022YFD1401700) ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס '32090013 ומס '32072385).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE protein gel Bio-rad 4561035 Protein separation and detection
4% paraformaldehyde Solarbio P1110 For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagent Bio-rad 5000205 Protein concentration detection
Capillary Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Cell counting chamber ACMEC AYA0810 Hemocytes counting
Glass slide Gitoglas 10127105A For holding insects
Glass slide coated with silane Sigma S4651-72EA For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 Nucleus staining
Microscope cover glass Gitoglas 10212424C For microscopic observation
Pipette bulb Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Prism 8.0 software GraphPad Software / Statistical analyses
Stereomicroscope  Motic SMZ-168 For insect dissection
Tweezers Tianld P5622 For insect dissection
Zeiss inverted microscope Zeiss Observer Z1 Hemocytes observation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
  3. Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
  4. Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
  5. Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
  6. Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
  7. Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
  8. Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
  9. Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
  10. Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
  11. Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
  12. Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
  13. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
  14. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
  16. Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
  17. Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
  18. Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
  19. Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
  20. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
  21. Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
  22. Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
  23. Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
  24. Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
  25. Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
  26. Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
  27. Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
  28. Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
  29. Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
  30. Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
  31. Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 194
שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo,More

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods. J. Vis. Exp. (194), e65250, doi:10.3791/65250 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter