שיטה מדויקת וניתנת לכימות לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים
Summary
אנו מתארים שיטה לאיסוף המולימפה הניתנת לכימות ביעילות מפרוקי רגליים קטנים לצורך ניתוח לאחר מכן.
Abstract
פרוקי רגליים ידועים כמעבירים מגוון וירוסים בעלי חשיבות רפואית וחקלאית דרך ההמולימפה שלהם, החיונית להעברת הנגיף. אוסף Hemolymph הוא הטכנולוגיה הבסיסית לחקר אינטראקציות וירוס-וקטור. כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף כמותי של המולימפה מפרוקי רגליים קטנים באמצעות Laodelphax striatellus (הפלנטהופר החום הקטן, SBPH) כמודל מחקר, שכן פרוק רגליים זה הוא הווקטור העיקרי של וירוס פס האורז (RSV). בפרוטוקול זה, התהליך מתחיל בצביטה עדינה של רגל אחת של פרוק הרגליים הקפוא בפינצטה עדינה ולחיצה על ההמולימפה מתוך הפצע. לאחר מכן, micropipette פשוט המורכב נימים נורה פיפטה משמש לאסוף את hemolymph transudative מן הפצע על פי העיקרון של כוחות נימים. לבסוף, ניתן להמיס את ההמולימפה שנאספה לתוך חיץ ספציפי למחקר נוסף. שיטה חדשה זו לאיסוף המולימפה מפרוקי רגליים קטנים היא כלי שימושי ויעיל למחקר נוסף על ארבו-וירוסים ואינטראקציות וקטור-וירוס.
Introduction
וירוסים הן של בעלי חיים והן של צמחים יכולים להיות מועברים על ידי פרוקי רגליים, ונגיפים אלה מהווים איום חמור על בריאות האדם וגורמים להפסדים כלכליים עצומים בחקלאות 1,2,3. חשוב לציין כי המולימפה של פרוקי הרגליים, המשמשת כמערכת הדם וכמרכיב חיוני של מערכת החיסון בפרוקי רגליים, ממלאת תפקיד חשוב בוויסות ההעברה הארבו-ויראלית. וירוסים הנרכשים דרך מעי פרוקי הרגליים מועברים לרקמות אחרות רק לאחר בריחה מוצלחת מסביבת המולימפה השלילית 4,5,6,7. מחזור החיים של וירוסים בהמולימפה פרוק הרגליים כרוך בהישרדות הנגיף בפלזמה הנוזלית, כניסה להמוציטים והעברה לרקמות אחרות, ומנגנוני אינטראקציה שונים בין וירוסים לווקטורים מתרחשים בהמולימפה 8,9,10,11,12. לדוגמה, העברה אנכית של RSV על ידי SBPH תלויה באינטראקציה מולקולרית בין חלבון SBPH vitellogenin לבין חלבון RSV (וירוס פס אורז) capsidprotein 13,14. וירוסים מסוימים עשויים לברוח מהתגובה החיסונית של ההמולימפה על ידי קשירת גורמים וקטוריים ספציפיים15,16,17,18. לכן, חקירת אינטראקציות וקטור-וירוס בהמולימפה של פרוקי רגליים חשובה לפיתוח הבנה טובה יותר של העברת arbovirus.
המולימפה של כמה חרקים קטנים, כגון planthoppers, leafhoppers, וכמה יתושים, קשה לאסוף בשל גודלם. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחו מספר שיטות לאיסוף המולימפה, כולל החדרת מחט מזרק ישירות לגוף החרק כדי לחלץ מיקרו-נפח של ההמולימפה, איסוף הפרשה מאתר הפצע באמצעות פינצטה עדינה, וצנטריפוגה ישירה. שיטות אלה אפשרו מדידה של רמות ביטוי גנים יחסיות וטיטרים נגיפיים בתוך המולימפה 19,20,21. עם זאת, שיטה יעילה לכימות נפח המולימפה, הנחוצה לספירת המוציטים, כימות חלבונים וניתוח פעילות אנזימים, אינה זמינה כיום עבור חרקים קטנים אלה.
SBPH (פלנטהופר חום קטן) הוא סוג של וקטור חרקים קטן עם אורך גוף של כ 2-4 מ”מ. SBPH מסוגל להעביר מגוון רחב של וירוסים צמחיים, כולל RSV, תירס גס ננס וירוס, אורז שחור פסים ננס וירוס22,23,24. האינטראקציה בין SBPH ו- RSV נחקרה לעומק בעשור האחרון. כדי להקל על העבודה עם SBPHs, פיתחנו שיטה חדשנית ופשוטה לאיסוף המולימפה. שיטה זו, המבוססת על עקרון הכוחות הנימיים, משתמשת בנימים בעלי סימן קנה מידה כדי לרכוש את ההמולימפה של החרק באופן מדויק וניתן לכימות. זה מאפשר לנו לאסוף נפח מסוים של המולימפה מחרקים קטנים ביעילות וללמוד את סביבת ההמולימפה של וקטורים קטנים בפירוט רב יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
המולימפה הוא המדיום של מערכת הדם בפרוקי רגליים, וארבו-וירוסים יכולים לפלוש לרקמות פרוקי רגליים אחרות רק אם הם מסוגלים לשרוד את סביבת ההמולימפה העוינת. איסוף מדגם איכותי של המולימפה הוא הצעד הראשון בחקר אינטראקציות וקטור-וירוס המתרחשות בהמולימפה. דווח כי ניתן להשיג המולימפה של חרקים ממספ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המו”פ הלאומית של סין (מס ‘2022YFD1401700) ועל ידי הקרן הלאומית למדע של סין (מס ‘32090013 ומס ‘32072385).
Materials
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
