Summary
Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.
Abstract
Es ist bekannt, dass Gliederfüßer eine Vielzahl von Viren von medizinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung durch ihre Hämolymphe übertragen, die für die Virusübertragung unerlässlich ist. Die Hämolymphsammlung ist die Basistechnologie für die Untersuchung von Virus-Vektor-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige und einfache Methode zur quantitativen Entnahme von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden unter Verwendung von Laodelphax striatellus (der kleinen braunen Zikade, SBPH) als Forschungsmodell, da dieser Arthropode der Hauptvektor des Reisstreifenvirus (RSV) ist. Bei diesem Protokoll beginnt der Prozess damit, dass ein Bein des gefrorenen Gliederfüßers mit einer Pinzette mit feiner Spitze sanft abgekniffen und die Hämolymphe aus der Wunde gedrückt wird. Dann wird eine einfache Mikropipette, bestehend aus einer Kapillare und einem Pipettenkolben, verwendet, um die transsudative Hämolymphe nach dem Prinzip der Kapillarkräfte aus der Wunde zu entnehmen. Schließlich kann die gesammelte Hämolymphe zur weiteren Untersuchung in einem spezifischen Puffer aufgelöst werden. Diese neue Methode zur Gewinnung von Hämolymphen aus kleinen Arthropoden ist ein nützliches und effizientes Werkzeug für die weitere Erforschung von Arboviren und Vektor-Virus-Interaktionen.
Introduction
Sowohl tierische als auch pflanzliche Viren können von Gliederfüßern übertragen werden, und diese Viren stellen eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und verursachen enorme wirtschaftliche Verluste in der Landwirtschaft 1,2,3. Wichtig ist, dass die Arthropoden-Hämolymphe, die als Kreislaufsystem und lebenswichtiges Element des Immunsystems bei Arthropoden dient, eine wichtige Rolle bei der Regulierung der arboviralen Übertragung spielt. Viren, die über den Darm der Arthropoden erworben wurden, werden erst dann in andere Gewebe transportiert, wenn sie der ungünstigen Hämolymphumgebung erfolgreich entkommensind 4,5,6,7. Der Lebenszyklus von Viren in der Arthropoden-Hämolymphe umfasst das Überleben des Virus im flüssigen Plasma, das Eindringen in die Hämozyten und den Transport in andere Gewebe, und in der Hämolymphe treten verschiedene Virus-Vektor-Interaktionsmechanismen auf 8,9,10,11,12. So ist beispielsweise die vertikale Übertragung von RSV durch den SBPH von einer molekularen Interaktion zwischen dem SBPH-Vitellogenin-Protein und dem RSV-Kapsidprotein (Reisstreifenvirus) abhängig13,14. Einige Viren können der Immunantwort der Hämolymphe entgehen, indem sie bestimmte Vektorfaktorenbinden 15,16,17,18. Daher ist die Untersuchung von Vektor-Virus-Interaktionen in der Hämolymphe von Arthropoden wichtig, um ein besseres Verständnis der Arbovirus-Übertragung zu entwickeln.
Die Hämolymphe einiger kleiner Insekten wie Zikaden, Zikaden und einiger Mücken ist aufgrund ihrer Größe schwer zu sammeln. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Methoden zur Hämolymphentnahme entwickelt, darunter das Einführen einer Spritzennadel direkt in den Insektenkörper, um ein Mikrovolumen der Hämolymphe zu extrahieren, das Sammeln von Exsudat aus der Wundstelle mit einer Pinzette mit feiner Spitze und die direkte Zentrifugation. Diese Methoden ermöglichten die Messung der relativen Genexpression und der Virustiter innerhalb der Hämolymphe 19,20,21. Eine effektive Methode zur Quantifizierung des Hämolymphvolumens, die für die Hämolymphzählung, Proteinquantifizierung und Enzymaktivitätsanalyse notwendig ist, steht für diese kleinen Insekten derzeit jedoch nicht zur Verfügung.
Die SBPH (kleine braune Zikade) ist eine Art kleiner Insektenvektor mit einer Körperlänge von etwa 2-4 mm. Der SBPH ist in der Lage, eine Vielzahl von Pflanzenviren zu übertragen, darunter RSV, Mais-Rauhzwergvirus und Reis-Schwarzstreifen-Zwergvirus22,23,24. Die Wechselwirkung zwischen SBPH und RSV wurde in den letzten zehn Jahren eingehend untersucht. Um die Arbeit mit SBPHs zu erleichtern, haben wir eine neuartige und einfache Methode zur Hämolymphentnahme entwickelt. Bei dieser Methode, die auf dem Prinzip der Kapillarkräfte basiert, wird eine Kapillare mit einer Schuppenmarkierung verwendet, um die Hämolymphe des Insekts präzise und quantifizierbar zu erfassen. Dies ermöglicht es uns, ein bestimmtes Volumen an Hämolymphe von kleinen Insekten effizient zu sammeln und die Hämolymphumgebung kleiner Vektoren genauer zu untersuchen.
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Protocol
1. Insektenzucht
- Ziehen Sie die SBPHs, die in diesem Experiment verwendet wurden, an Reissämlingen (Oryza sativa cv. Nipponbare) an. Pflanzen Sie 20 Reissetzlinge in einen Inkubator (65 mm x 200 mm) und wachsen Sie bei 25 °C unter einer 16 h hellen/8 h dunklen Photoperiode.
2. Präparation der SBPHs für die Hämolymphentnahme
- Geben Sie die SBPHs in ein Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie für 10-30 Minuten in ein Eisbad.
Anmerkungen: Legen Sie die SBPHs nicht länger als 10 Minuten in das Eisbad, da die Insekten sonst wiederbelebt werden können. - Legen Sie einen gefrorenen SBPH mit dem Bauch nach oben auf einen Glasobjektträger (siehe Materialtabelle) unter ein Stereomikroskop (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Fokus auf die sechs Beine des Insekts ein.
- Bereiten Sie zwei hochpräzise Pinzetten (siehe Materialtabelle) mit ultrafeinen Spitzen vor. Drücke mit einer Pinzette auf den Körper des Insekts, um ihn an Ort und Stelle zu halten, und ziehe mit der anderen vorsichtig eines der Beine vom Insekt ab.
HINWEIS: Bei Insekten mit harter Schale kann ein Augenskalpell verwendet werden, um eines der Beine abzuschneiden. - Drücken Sie mit einer Pinzette sanft auf die Brust des Insekts, damit die Hämolymphe durch die Wunde fließt.
HINWEIS: Die Hämolymphe präsentiert sich als transparente Tröpfchen ohne sichtbare weiße Flockung. Entsorgen Sie das Lipid, wenn weiße Flocken vorhanden sind, die eine Kontamination des Fettkörpers darstellen.
3. Hämolymphentnahme mit Mikropipetten
- Bereiten Sie eine Mikropipette vor. Ein Kapillarröhrchen (siehe Materialtabelle) mit einem Volumen von 1 μL in den Pipettenkolben (siehe Materialtabelle) einsetzen. Stellen Sie für genaue Messungen sicher, dass die Skalenlinie sichtbar ist.
Anmerkungen: Ein kleines Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens ist erforderlich. - Halten Sie bei der Entnahme der Hämolymphe den Pipettenkolben der Mikropipette fest und platzieren Sie das Kapillarröhrchen in der Nähe der Insektenwunde. Sammeln Sie die aus der Wunde austretende Hämolymphe, indem Sie einfach die Spitze der Kapillare zur Hämolymphe berühren.
- Blockieren Sie das kleine Loch auf der Oberseite des Pipettenkolbens leicht mit dem Finger, um den Absorptionsprozess zu stoppen, wenn die Flüssigkeit im Inneren des Kapillarrohrs die gewünschte Skalenlinie erreicht.
Anmerkungen: Sammeln Sie eine Probe von 1 μl Hämolymphe unaufhörlich und schnell, um eine Lipidkontamination und ein Verstopfen der Röhrchen zu vermeiden. - Drücken Sie auf den Pipettenkolben, um die gesammelte Hämolymphe in 100 μl PBS-Puffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4) zu entladen.
Anmerkungen: Das Kapillarrohr wird in den PBS-Puffer eingeführt. - Wechseln Sie zu einem neuen Kapillarröhrchen, wenn Sie eine weitere 1-μl-Hämolymphprobe entnehmen.
4. Coomassie Blue-Färbung
- Sammeln Sie 3 Hämolymphproben mit dem gleichen Volumen (1 μl) von Larven des 3. Stadiums gemäß den in Schritt 3 beschriebenen Protokollen und entleeren Sie die gesammelte Hämolymphe in den PBS-Puffer, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erhalten.
- In 100 μl der verdünnten Hämolymphproben werden 25 μl 5x Proteinladepuffer (250 mmol/l Tris-HCI [pH 6,8], 10 % W/V SDS, 0,05 % W/V Bromphenolblau, 50 % W/V Glycerin, 5 % W/V β-Mercaptoethanol) gegeben und erhitzt, um die Proteine zu denaturieren.
- Geben Sie 20 μl der gekochten Proben auf ein 10%iges SDS-PAGE-Proteingel (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu trennen.
- Färben Sie das Gel 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Coomassie Blue-Lösung (mischen Sie 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 mit 250 ml Isopropanol, 100 ml Eisessig und 650 ml ddH2O und filtern Sie alle Partikel mit Filterpapier heraus) und entfärben Sie das Gel dann 1 Stunde lang mit Entfärbungslösung (100 ml Essigsäure, 400 ml Methanol, 500 mlddH2O).
5. Bestimmung der Proteinkonzentration
- 10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) auf 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml und 0,3125 mg/ml mit PBS-Puffer unter Verwendung der zweifachen Verdünnungsmethode verdünnen.
- Aspirieren Sie 5 μl PBS-Puffer und jede Konzentration BSA-Lösungen in Schritt 5.1, fügen Sie 1 ml 1x Bradford-Farbstoffreagenz hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie PBS-Puffer in Bradford-Farbstoffreagenz als Kontrolle und Null bei OD = 595 nm. Messen Sie die Absorptionswerte jeder der verbleibenden Proteinkonzentrationen und erstellen Sie eine Standardkurve.
- Geben Sie 1 μl Hämolymphe von larven, weiblichen oder männlichen SBPHs in 100 μl PBS-Puffer und zentrifugieren Sie dann die Proben bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Hämozyten zu entfernen.
- Aspirieren Sie 90 μl Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen und messen Sie die Absorptionswerte des Überstands gemäß den Anweisungen in Schritt 5.2.
- Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen der Hämolymphproben gemäß der Regressionsgleichung der Standardkurve. Beziehen Sie drei biologische Replikate mit drei technischen Repliken in die Experimente ein.
6. Mikroskopische Detektionen
- Verwenden Sie Mikropipetten, um die Hämolymphe von 10-15 SBPHs in verschiedenen Entwicklungsstadien zu sammeln. Die gesammelte Hämolymphe wird in ein Röhrchen mit 20 μl 4%iger Paraformaldehydlösung gegeben (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Hämolymphe zu fixieren.
- Pipettieren Sie 20 μl fixierte Hämozyten in die Mitte eines mit Silan beschichteten Objektträgers (siehe Materialtabelle).
- Trocknen Sie das Tröpfchen in einem Wäscheständer ab.
Anmerkungen: Vermeiden Sie übermäßiges Trocknen. - Bedecken Sie die Probe mit dem Gold-Lichtschutzreagenz 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (siehe Materialtabelle) und untersuchen Sie den Objektträger unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle).
7. Quantifizierung der Zellen
- Sammeln Sie 1 μl Hämolymphe mit einer Mikropipette aus den SBPHs und lösen Sie sie in 20 μl PBS-Puffer auf.
- Verdünnen Sie die Hämolymphproben fünffach mit PBS-Puffer.
- Pipettieren Sie 20 μl Hämolymphlösung in die Mitte der Zellzählkammer (siehe Materialtabelle). Decken Sie das Tröpfchen mit einem Deckglas ab (siehe Materialtabelle).
- Zählen Sie die Zellen in den fünf Quadraten der Zellzählkammer (ergänzende Abbildung 1) unter einem inversen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Beziehen Sie drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Repliken in die Experimente ein.
Zellen/μL = Gesamtzahl von fünf mittleren Quadraten × 5 × Verdünnungsfaktor × 104
8. Statistische Auswertungen
- Führen Sie statistische Analysen mit der entsprechenden Software durch (siehe Materialtabelle). Erstellen Sie eine neue Datei, wählen Sie die Spalte aus, importieren Sie die Daten, und generieren Sie ein Streudiagramm mit einem Balken.
- Berechnen Sie den Mittelwert und die SD für jede Datengruppe mithilfe von Spaltenstatistiken, und verwenden Sie ein unidirektionales ANOVA-Tool, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen auszuwerten. Bestimmen Sie den Mittelwert und die SD aus drei biologischen Wiederholungen mit drei unabhängigen Experimenten.
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Representative Results
Mikropipettenmodell und Hämolymphsammlung
Wir haben eine einfache Mikropipette entwickelt, deren Wirkung auf den Kapillarkräften des Kapillarrohrs basiert. Die Mikropipette besteht aus einem Kapillarröhrchen und einem Pipettenkolben (Abbildung 1A). Kapillarröhrchen sind in verschiedenen Volumengrößen von 1 μL bis 20 μL erhältlich, wobei die Kapillarröhrchenvolumina je nach Anforderung ausgewählt werden. Kapillarröhrchen mit kleinerem Volumen werden nicht empfohlen, da die extra feinen Öffnungen von Röhrchen mit kleinerem Volumen die Aufnahme von Flüssigkeit wie Hämolymphe erschweren können. Der Pipettenkolben enthält ein Loch auf der Oberseite, das während der Hämolymphentnahme nicht verschlossen werden kann. Dieser Pipettenkolben ist praktisch, um die Mikropipette während der Flüssigkeitssammlung zu halten (Abbildung 1B) und hilft auch beim Transfer der gesammelten Flüssigkeit aus dem Kapillarrohr in den Sammelpuffer.
Um die Hämolymphe leicht sammeln zu können, wurden die SBPHs in dieser Arbeit zunächst in Eis oder im Kühlschrank eingefroren. Diese gefrorenen SBPHs wurden dann auf einem Objektträger unter einem Stereomikroskop lokalisiert, und eines der Beine jedes SBPH wurde mit einer Pinzette mit feiner Spitze abgezogen (Abbildung 1C). Um eine große Wunde und eine optimale Hämolymphsammlung zu gewährleisten, ist es am besten, das Bein an der Wurzel abzuziehen (Abbildung 1Ca, b). Um das Risiko einer Kontamination durch den Fettkörper zu minimieren, wurden nur klare Flüssigkeitstropfen ohne weiße Flockung gesammelt (Abbildung 1Cc). Die Mikropipette wurde verwendet, um die gewünschten Volumina der Hämolymphe zu absorbieren (Abbildung 1Cd). Um 1 μl Hämolymphe zu gewinnen, mussten ca. 30-40 Larven-SBPHs oder 8-15 adulte SPBHs präpariert werden.
Analyse der entnommenen Hämolymphe
Um die Genauigkeit der Mikropipette als Methode zur Beurteilung des Volumens der gesammelten Hämolymphe zu beurteilen, haben wir die Proteinkonzentrationen verschiedener Proben getestet. Die Hämolymphe der Larven wurde mit einer Mikropipette mit einem Kapillarvolumen von 1 μl entnommen, und drei Proteinproben wurden separat entnommen und mit einem SDS-PAGE-Gel getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Proteinmenge in den drei Bahnen nahezu gleich war (Abbildung 2A). Bei den Larven betrug der Gesamtproteingehalt 3,707 mg/ml ± 1,382 mg/ml. Wir sammelten auch das gleiche Volumen an Hämolymphe von erwachsenen weiblichen und männlichen SBPHs, und diese zeigten Proteinkonzentrationen von 3,515 mg/ml ± 1,400 mg/ml und 3,621 mg/ml ± 0,860 mg/ml (Tabelle 1). Es gab keine signifikanten Unterschiede im Protein zwischen den drei Proben (Abbildung 2B).
Darüber hinaus beobachteten wir auch die Hämolymphozyten innerhalb der gesammelten Larvenhämolymphe, um die Qualität und Reinheit der Hämolymphproben zu beurteilen. Die Größe der Hämozyten variierte zwischen 2 und 20 nm, und es wurde kein Fettkörper nachgewiesen (Abbildung 2C). Bei der Mehrzahl der identifizierten Zellen handelte es sich um Plasmatozyten mit einem Durchmesser von 5-15 nm, die häufig in Aggregaten25 auftraten. Anschließend zählten wir die Zellkonzentrationen der Hämolymphe von Larven, erwachsenen Weibchen und erwachsenen Männchen, und die identifizierten Zellkonzentrationen betrugen 1,794 x 10 5/μl ± 0,614 x 10 5/μl, 1,256 x 10 5/μl ± 0,603 x 105/μl und 1,553 x 10 5/μl ± 0,474 x 10 5/μl (Tabelle 2). Die Anzahl der Hämozyten bei den Larven, den adulten Weibchen und den adulten Männchen zeigte keine signifikanten Unterschiede (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mikropipettenentnahmemethode eine zuverlässige und genaue Methode zur Hämolymphentnahme von SBPHs ist.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Mikropipettenmodells und der Hämolymphsammlung . (A) Zusammensetzung der Mikropipette. Die Mikropipette besteht aus einer Kapillare und einem Pipettenkolben. Die Kapillarvolumina reichen von 1-20 μL. Der Pipettenkolben hat oben und unten ein kleines Loch. Die Kapillare wird in das untere Loch eingeführt und die Skala ist sichtbar. (B) Übersichtsdiagramm der Hämolymphentnahme mit einer Mikropipette. Der Insektenbauch wird nach oben gehalten, während ein Bein abgetrennt, ein Hämolymphabfluss induziert und die Hämolymphe unter einem Stereomikroskop in die Pipette gesammelt wird. (C) Verfahren der Hämolymphentnahme mit einer Mikropipette. Eines der Beine wird mit einer Pinzette mit feiner Spitze an der Wurzel abgezogen (a) und der Körper des Insekts wird gedrückt, damit die Hämolymphe herausfließt (b, c). Die Hämolymphe aus der Wunde wird in der Kapillare gesammelt (d). Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der SBPH-Hämolymphe . (A) Coomassie-Blue-Färbung mit drei Replikaten der gesammelten Larvenhämolymphe. Der Saum deutet auf Hämolymphe hin. (B) Gesamtproteinkonzentrationen der Hämolymphe von larven, weiblichen und männlichen SBPHs. (C) Mikroskopische Bilder, die die in der Hämolymphe vorhandenen Zellen in SBPHs bei 20-facher bzw. 60-facher Vergrößerung zeigen. Der Zellkern wurde mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 50 μm. (D) Hämocy-Dichte von Larven, weiblichen und männlichen SBPHs. Der Mittelwert und die SD wurden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Hämolymphe | Proteinkonzentration (mg/ml) |
| Larve | 3.707±1.382 |
| Weiblich | 3.515±1.400 |
| Männlich | 3.621±0.860 |
Tabelle 1: Proteinkonzentrationen der Hämolymphe aus verschiedenen SBPHs. Die Daten stammen von drei biologischen Replikaten.
| Hämolymphe | Zellkonzentration (105 / μL) |
| Larve | 1.794±0.614 |
| Weiblich | 1.256±0.603 |
| Männlich | 1.553±0.474 |
Tabelle 2: Die Gesamtkonzentrationen von Hämozyten in der Hämolymphe aus verschiedenen SBPHs. Die Daten stammen von drei biologischen Replikaten.
Ergänzende Abbildung 1: Bestimmen der Anzahl der Zellen. Die vier Eckquadrate (1, 2, 3 und 4) und das zentrale Quadrat (5) werden auf der Zellenzählkammer gezählt. Bei Rahmenzellen werden nur die beiden Grenzen (oben und links) gezählt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Hämolymphe ist das Medium des Kreislaufsystems bei Gliederfüßern, und Arboviren können nur dann in andere Gliederfüßergewebe eindringen, wenn sie in der Lage sind, die feindliche Hämolymphumgebung zu überleben. Die Entnahme einer qualitativ hochwertigen Hämolymphprobe ist der erste Schritt zur Untersuchung der Vektor-Virus-Interaktionen, die in der Hämolymphe auftreten. Es wurde berichtet, dass die Insektenhämolymphe an mehreren Stellen des Körpers des Insekts gewonnen werden kann, einschließlich einer Wunde am Vorderbein, einem kleinen Schnitt im Kopfbereich oder einer Tränenwunde am Bauch26,27,28,29. Für bestimmte Erwerbungen können unterschiedliche Erfassungsmethoden funktionieren. Die Methode, bei der ein kleiner Schnitt am Kopf-Hals-Gelenk gemacht wird, eignet sich besser für die Hämolymphentnahme von großen Insekten wie Honigbienen26. Das Anlegen einer Wunde im Kopfbereich des SBPH ist eine Herausforderung, da sie andere Organe schädigen und eine Kontamination aus anderen Geweben einführen kann. Nach einer Tränenwunde am Bauch werden die Insekten in den Puffer getaucht, und dann wird der Puffer zentrifugiert, um die Hämolymphe zu extrahieren. Dies ist eine bequeme Methode, um Lipide von kleinen Insekten zu sammeln21. Da sich jedoch eine hohe Menge an Fettkörper im Hämocoel von SBPHs befindet, kann eine Wunde am Körperteil zum Austritt von Fett aus der Wunde und zur Kontamination der Hämolymphe führen. Diese Methode eignet sich besser für die Hämolymphe von erwachsenen SBPHs, die weniger Fettkörper als Larven haben. Um eine Kontamination des Körpers mit Fett wirksam zu verhindern, wird empfohlen, eine Wunde an der Beinstelle und nicht direkt am Körper zu machen. In früheren Studien zur SBPH-Hämolymphe wurde eine Pinzette mit feiner Spitze verwendet, um das Auffangen kleiner Flüssigkeitstropfen aus der Wunde zu erleichtern13. Obwohl die gesammelte Hämolymphe frei von Verunreinigungen war, wurde das Volumen der Hämolymphe nicht gemessen. In dieser Studie haben wir eine einfache Mikropipette entwickelt, mit der Hämolymphe von sehr kleinen Insektenvektoren genau und quantitativ gesammelt werden können.
Für eine erfolgreiche Hämolymphentnahme müssen mehrere kritische Schritte berücksichtigt werden. Zunächst ist es wichtig, die Insekten bei 4 °C für 15 min zu betäuben, um eine fettfreie Körperhämolymphe zu erzeugen. Zweitens ist es einfacher, eine reine Hämolymphe zu erhalten, indem man das erste Bein abzieht. Drittens sollte die Entnahme der Hämolymphe kontinuierlich und zügig erfolgen, da sonst die Hämolymphe am Boden gerinnen und die Kapillare verstopfen kann.
Die Technik der Kapillarentnahme ist bei der Entnahme von Tierblut weit verbreitet30,31. Wir haben die Technik modifiziert, um sie an die besonderen Eigenschaften der Insektenhämolymphe anzupassen. Da SBPHs eine geringe Körpergröße besitzen, wurde eine Kapillare mit einem minimalen Volumen von 1 μL gewählt. Die Verwendung einer Kapillare mit einem Volumen von weniger als 1 μl wird nicht empfohlen. Bemerkenswert ist, dass die Hämolymphe eine hohe Dichte an Proteinen und eine beträchtliche Anzahl von Zellen enthält (Abbildung 2), die ihre Flüssigkeitsdichte erhöhen und die Aufnahme der Hämolymphe über Kapillaren mit kleinerem Volumen erschweren.
Die Methode der kapillaren Hämolymphentnahme ist eine einfache, kostengünstige und praktikable Technik, die eine zuverlässige und präzise Quantifizierung der Hämolymphe ermöglicht. Diese neu entwickelte Methode könnte auch für die Sammlung anderer Spurenflüssigkeiten aus kleinen Vektoren, wie z.B. Honigtau, eingesetzt werden. Es ist wichtig zu betonen, dass die Insekten nach der Extraktion der Hämolymphe mit dieser Methode am Leben bleiben. Dies ist vorteilhaft für Untersuchungen mit anderen Insektenorganen oder für die wiederholte Hämolymphsammlung. Diese Arbeit stellt eine wertvolle Technologie für die Untersuchung der Entomologie und der Virus-Vektor-Interaktionen dar.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (Nr. 2022YFD1401700) und von der National Science Foundation of China (Nr. 32090013 und Nr. 32072385) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
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