En exakt och kvantifierbar metod för att samla hemolymf från små leddjur

Summary

Vi beskriver en metod för att effektivt samla in kvantifierbar hemolymf från små leddjur för efterföljande analys.

Abstract

Leddjur är kända för att överföra en mängd olika virus av medicinsk och jordbruksmässig betydelse genom deras hemolymf, vilket är viktigt för virusöverföring. Hemolymfsamling är den grundläggande tekniken för att studera virus-vektorinteraktioner. Här beskriver vi en ny och enkel metod för kvantitativ insamling av hemolymf från små leddjur med Laodelphax striatellus (den lilla bruna växthopparen, SBPH) som forskningsmodell, eftersom denna leddjur är huvudvektorn för risrandvirus (RSV). I detta protokoll börjar processen genom att försiktigt klämma av ett ben av den frusna leddjuret med finspetsad pincett och pressa hemolymfen ut ur såret. Därefter används en enkel mikropipett bestående av en kapillär och en pipettlampa för att samla den transudativa hemolymfen från såret enligt principen om kapillärkrafter. Slutligen kan den uppsamlade hemolymfen lösas upp i en specifik buffert för vidare studier. Denna nya metod för att samla hemolymf från små leddjur är ett användbart och effektivt verktyg för vidare forskning om arbovirus och vektor-virusinteraktioner.

Introduction

Både djur- och växtvirus kan överföras av leddjur, och dessa virus utgör ett allvarligt hot mot människors hälsa och orsakar enorma ekonomiska förluster inom jordbruket ^1,2,3. Det är viktigt att leddjurhemolymfen, som fungerar som cirkulationssystemet och ett viktigt element i immunsystemet hos leddjur, spelar en viktig roll vid reglering av arboviral överföring. Virus som förvärvats genom leddjurens tarmar transporteras till andra vävnader först efter att framgångsrikt ha undkommit den negativa hemolymfmiljön 4,5,6,7. Livscykeln för virus i leddjurens hemolymf involverar virusöverlevnad i vätskeplasman, inträde i hemocyten och transport till andra vävnader, och olika virus-vektorinteraktionsmekanismer förekommer i hemolymfen 8,9,10,11,12. Till exempel är SBPH:s vertikala överföring av RSV beroende av en molekylär interaktion mellan SBPH-vitellogeninproteinet och RSV-kapsidproteinet^13,14 (risstripevirus). Vissa virus kan undkomma hemolymfens immunsvar genom att binda specifika vektorfaktorer^15,16,17,18. Därför är det viktigt att undersöka vektor-virusinteraktioner i hemolymfen hos leddjur för att utveckla en bättre förståelse för arbovirusöverföring.

Hemolymfen hos vissa små insekter, såsom planthoppers, leafhoppers och vissa myggor, är svår att samla på grund av deras storlek. För att lösa detta problem har flera metoder utvecklats för att samla hemolymf, inklusive att sätta in en sprutnål direkt i insektskroppen för att extrahera en mikrovolym av hemolymfen, samla exsudat från sårplatsen med pincett med fin spets och direkt centrifugering. Dessa metoder har möjliggjort mätning av relativa genuttrycksnivåer och virustitrar inom hemolymfan 19,20,21. En effektiv metod för att kvantifiera hemolymfvolymen, som är nödvändig för hemocyträkning, proteinkvantifiering och enzymaktivitetsanalys, är dock för närvarande inte tillgänglig för dessa små insekter.

SBPH (small brown planthopper) är en typ av liten insektsvektor med en kroppslängd på ca 2-4 mm. SBPH kan överföra en mängd olika växtvirus, inklusive RSV, majs grovt dvärgvirus och ris svart streckat dvärgvirus^22,23,24. Samspelet mellan SBPH och RSV har studerats ingående under det senaste decenniet. För att underlätta arbetet med SBPHs utvecklade vi en ny och enkel metod för att samla hemolymf. Denna metod, som är baserad på principen om kapillärkrafter, använder en kapillär med ett skalmärke för att förvärva insektens hemolymf på ett exakt och kvantifierbart sätt. Detta gör det möjligt för oss att samla en specifik volym hemolymf från små insekter effektivt och att studera hemolymfmiljön hos små vektorer mer detaljerat.

Protocol

1. Insektsuppfödning Höj SBPH: erna som används i detta experiment i risplantor (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantera 20 risplantor i en inkubator (65 mm x 200 mm) och odla vid 25 °C under en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod. 2. Dissektion av SBPH för hemolymfsamling Sätt SBPH: erna i ett centrifugrör och placera dem i ett isbad i 10-30 minuter.OBS: Placera inte SBPH i isbadet i mindre än 10 minuter, annars kan in…

Representative Results

Mikropipettmodell och hemolymfsamlingVi har utvecklat en enkel mikropipett vars verkan är baserad på kapillärrörets kapillärkrafter. Mikropipetten består av ett kapillärrör och en pipettlampa (figur 1A). Kapillärrör finns i olika volymstorlekar från 1 μL till 20 μL, och kapillärrörvolymerna väljs enligt kraven. Kapillärrör med mindre volymer rekommenderas inte eftersom de extra fina öppningarna i rör med mindre volymer kan göra det svårt att absorbe…

Discussion

Hemolymph är mediet i cirkulationssystemet hos leddjur, och arbovirus kan bara invadera andra leddjurvävnader om de kan överleva den fientliga hemolymfmiljön. Att samla ett högkvalitativt prov av hemolymf är det första steget i att studera vektorvirusinteraktionerna som uppträder i hemolymfen. Det har rapporterats att insektshemolymf kan erhållas från flera ställen på insektens kropp, inklusive ett sår på frambenet, ett mindre snitt i huvudområdet eller ett tårsår i buken^{26,27,28,29</su…}

Materials

10% SDS-PAGE protein gel	Bio-rad	4561035	Protein separation and detection
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	For fixation of the cells or tissues
Bradford dye reagent	Bio-rad	5000205	Protein concentration detection
Capillary	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Cell counting chamber	ACMEC	AYA0810	Hemocytes counting
Glass slide	Gitoglas	10127105A	For holding insects
Glass slide coated with silane	Sigma	S4651-72EA	For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Nucleus staining
Microscope cover glass	Gitoglas	10212424C	For microscopic observation
Pipette bulb	Hirschmann	9000101	For collecting hemolymph
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistical analyses
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168	For insect dissection
Tweezers	Tianld	P5622	For insect dissection
Zeiss inverted microscope	Zeiss	Observer Z1	Hemocytes observation