Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En exakt och kvantifierbar metod för att samla hemolymf från små leddjur

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65250

Summary

Vi beskriver en metod för att effektivt samla in kvantifierbar hemolymf från små leddjur för efterföljande analys.

Abstract

Leddjur är kända för att överföra en mängd olika virus av medicinsk och jordbruksmässig betydelse genom deras hemolymf, vilket är viktigt för virusöverföring. Hemolymfsamling är den grundläggande tekniken för att studera virus-vektorinteraktioner. Här beskriver vi en ny och enkel metod för kvantitativ insamling av hemolymf från små leddjur med Laodelphax striatellus (den lilla bruna växthopparen, SBPH) som forskningsmodell, eftersom denna leddjur är huvudvektorn för risrandvirus (RSV). I detta protokoll börjar processen genom att försiktigt klämma av ett ben av den frusna leddjuret med finspetsad pincett och pressa hemolymfen ut ur såret. Därefter används en enkel mikropipett bestående av en kapillär och en pipettlampa för att samla den transudativa hemolymfen från såret enligt principen om kapillärkrafter. Slutligen kan den uppsamlade hemolymfen lösas upp i en specifik buffert för vidare studier. Denna nya metod för att samla hemolymf från små leddjur är ett användbart och effektivt verktyg för vidare forskning om arbovirus och vektor-virusinteraktioner.

Introduction

Både djur- och växtvirus kan överföras av leddjur, och dessa virus utgör ett allvarligt hot mot människors hälsa och orsakar enorma ekonomiska förluster inom jordbruket 1,2,3. Det är viktigt att leddjurhemolymfen, som fungerar som cirkulationssystemet och ett viktigt element i immunsystemet hos leddjur, spelar en viktig roll vid reglering av arboviral överföring. Virus som förvärvats genom leddjurens tarmar transporteras till andra vävnader först efter att framgångsrikt ha undkommit den negativa hemolymfmiljön 4,5,6,7. Livscykeln för virus i leddjurens hemolymf involverar virusöverlevnad i vätskeplasman, inträde i hemocyten och transport till andra vävnader, och olika virus-vektorinteraktionsmekanismer förekommer i hemolymfen 8,9,10,11,12. Till exempel är SBPH:s vertikala överföring av RSV beroende av en molekylär interaktion mellan SBPH-vitellogeninproteinet och RSV-kapsidproteinet13,14 (risstripevirus). Vissa virus kan undkomma hemolymfens immunsvar genom att binda specifika vektorfaktorer15,16,17,18. Därför är det viktigt att undersöka vektor-virusinteraktioner i hemolymfen hos leddjur för att utveckla en bättre förståelse för arbovirusöverföring.

Hemolymfen hos vissa små insekter, såsom planthoppers, leafhoppers och vissa myggor, är svår att samla på grund av deras storlek. För att lösa detta problem har flera metoder utvecklats för att samla hemolymf, inklusive att sätta in en sprutnål direkt i insektskroppen för att extrahera en mikrovolym av hemolymfen, samla exsudat från sårplatsen med pincett med fin spets och direkt centrifugering. Dessa metoder har möjliggjort mätning av relativa genuttrycksnivåer och virustitrar inom hemolymfan 19,20,21. En effektiv metod för att kvantifiera hemolymfvolymen, som är nödvändig för hemocyträkning, proteinkvantifiering och enzymaktivitetsanalys, är dock för närvarande inte tillgänglig för dessa små insekter.

SBPH (small brown planthopper) är en typ av liten insektsvektor med en kroppslängd på ca 2-4 mm. SBPH kan överföra en mängd olika växtvirus, inklusive RSV, majs grovt dvärgvirus och ris svart streckat dvärgvirus22,23,24. Samspelet mellan SBPH och RSV har studerats ingående under det senaste decenniet. För att underlätta arbetet med SBPHs utvecklade vi en ny och enkel metod för att samla hemolymf. Denna metod, som är baserad på principen om kapillärkrafter, använder en kapillär med ett skalmärke för att förvärva insektens hemolymf på ett exakt och kvantifierbart sätt. Detta gör det möjligt för oss att samla en specifik volym hemolymf från små insekter effektivt och att studera hemolymfmiljön hos små vektorer mer detaljerat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Insektsuppfödning

  1. Höj SBPH: erna som används i detta experiment i risplantor (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantera 20 risplantor i en inkubator (65 mm x 200 mm) och odla vid 25 °C under en 16 h ljus/8 h mörk fotoperiod.

2. Dissektion av SBPH för hemolymfsamling

  1. Sätt SBPH: erna i ett centrifugrör och placera dem i ett isbad i 10-30 minuter.
    OBS: Placera inte SBPH i isbadet i mindre än 10 minuter, annars kan insekterna återupplivas.
  2. Placera en frusen SBPH på en glasskiva (se Materialförteckning) under ett stereomikroskop (se Materialförteckning) med buken uppåt. Justera fokus på insektens sex ben.
  3. Förbered två pincett med hög precision (se Materialtabell) med ultrafina spetsar. Använd en pincett för att trycka ner insektens kropp för att hålla den på plats och använd den andra för att försiktigt dra ett av benen från insekten.
    OBS: För insekter med ett hårt skal kan en oftalmisk skalpell användas för att skära av ett av benen.
  4. Tryck försiktigt på insektens bröst med en pincett för att få hemolymfen att strömma ut genom såret.
    OBS: Hemolymfen presenteras som transparenta droppar utan någon synlig vit flock. Kassera lipiden om det finns någon vit flock, vilket representerar fettkroppsförorening.

3. Hemolymfsamling med mikropipetter

  1. Förbered en mikropipett. Placera ett kapillärrör (se Materialförteckning) med en volym på 1 μl i pipettlampan (se Materialförteckning). För noggranna mätningar, se till att skallinjen är synlig.
    OBS: Ett litet hål som finns på toppen av pipettlampan är nödvändigt.
  2. När du samlar hemolymfen, håll pipettlampan på mikropipetten och placera kapillärröret nära insektssåret. Samla hemolymfen som utsöndras från såret genom att helt enkelt röra spetsen av kapillären till hemolymfen.
  3. Blockera det lilla hålet på toppen av pipettlampan något med fingret för att stoppa absorberingsprocessen när vätskan inuti kapillärröret når önskad skallinje.
    OBS: Samla ett prov på 1 μl hemolymf oavbrutet och snabbt för att undvika lipidkontaminering och slangpluggning.
  4. Tryck på pipettlampan för att tömma den uppsamlade hemolymfen i 100 μL PBS-buffert (137 mmol / L NaCI, 2,7 mmol / L KCI, 4,3 mmol / LNa2HPO 4, 1,4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
    OBS: Kapillärröret sätts in i PBS-bufferten.
  5. Byt till ett nytt kapillärrör när du samlar in ytterligare ett 1 μL prov av hemolymf.

4. Coomassie Blue-färgning

  1. Samla in 3 hemolymfprover med samma volym (1 μl) från larver i tredje stadiet enligt de protokoll som beskrivs i steg 3 och släpp ut den uppsamlade hemolymfen i PBS-bufferten för att göra en total volym på 100 μl.
  2. Tillsätt 25 μL 5x proteinladdningsbuffert (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V bromfenolblått, 50% W/V glycerol, 5% W/V β-merkaptoetanol) i 100 μL av de utspädda hemolymfproverna och värm till denaturering av proteinerna.
  3. Fyll 20 μL av de kokta proverna på en 10% SDS-PAGE proteingel (se materialtabell) för att separera proteinerna.
  4. Färga gelén i en Coomassie Blue-lösning (blanda 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 med 250 ml isopropanol, 100 ml isättika och 650 mlddH2Ooch filtrera bort eventuella partiklar med filterpapper) i 1 timme vid rumstemperatur och avfärga sedan gelén i 1 timme med avfärgningslösning (100 ml ättiksyra, 400 ml metanol, 500 mlddH2O).

5. Bestämning av proteinkoncentration

  1. Späd 10 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) till 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml och 0,3125 mg/ml med PBS-buffert med tvåfaldig utspädningsmetod.
  2. Aspirera 5 μL PBS-buffert och varje koncentration av BSA-lösningar i steg 5.1, tillsätt 1 ml 1x Bradford-färgämnesreagens (se materialtabell) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Använd PBS-buffert i Bradford-färgämnesreagens som kontroll och noll vid OD = 595 nm. Mät absorbansvärdena för var och en av de återstående proteinkoncentrationerna och gör en standardkurva.
  3. Tillsätt 1 μl hemolymf från SBPH hos larver, honor eller hanar till 100 μl PBS-buffert och centrifugera sedan proverna vid 1 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna hemocyterna.
  4. Aspirera 90 μL supernatant till ett nytt centrifugrör och mät supernatantens absorbansvärden enligt anvisningarna i steg 5.2.
  5. Beräkna proteinkoncentrationerna i hemolymfproverna enligt regressionsekvationen för standardkurvan. Inkludera tre biologiska replikat med tre tekniska replikat i experimenten.

6. Mikroskopiska detektioner

  1. Använd mikropipetter för att samla hemolymf från 10-15 SBPH i olika utvecklingsstadier. Tillsätt den uppsamlade hemolymfen i ett rör innehållande 20 μl 4% paraformaldehydlösning (se materialförteckning). Inkubera blandningen vid rumstemperatur i 30 minuter för att fixera hemolymfen.
  2. Pipettera 20 μL fasta hemocyter på mitten av ett objektglas belagt med silan (se Materialförteckning).
  3. Torka droppen i en rutschtork.
    OBS: Undvik överdriven torkning.
  4. Täck provet med guldantifadreagenset 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (se materialförteckning) och inspektera objektglaset under ett inverterat mikroskop (se Materialförteckning).

7. Kvantifiering av celler

  1. Samla upp 1 μl hemolymf från SBPH med en mikropipett och lös upp den i 20 μl PBS-buffert.
  2. Späd hemolymfproverna fem gånger med PBS-buffert.
  3. Pipettera 20 μl hemolymflösning in i mitten av cellräkningskammaren (se Materialförteckning). Täck droppen med ett täckglas (se Materialförteckning).
  4. Räkna cellerna i de fem rutorna på cellräkningskammaren (kompletterande figur 1), under ett inverterat mikroskop (se materialtabell). Inkludera tre biologiska replikat med tre tekniska replikat i vart och ett av experimenten.
    Celler/μl = totalt antal fem mellersta kvadrater × 5 × utspädningsfaktor × 104

8. Statistiska analyser

  1. Utföra statistiska analyser med motsvarande programvara (se Materialförteckning). Skapa en ny fil och markera kolumnen, importera data och generera ett punktdiagram med en stapel.
  2. Beräkna medelvärdet och SD för varje grupp av data med hjälp av kolumnstatistik och använd ett enkelriktat ANOVA-verktyg för att utvärdera betydelsen av skillnaderna mellan grupperna. Bestäm medelvärdet och SD från tre biologiska replikat med tre oberoende experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikropipettmodell och hemolymfsamling
Vi har utvecklat en enkel mikropipett vars verkan är baserad på kapillärrörets kapillärkrafter. Mikropipetten består av ett kapillärrör och en pipettlampa (figur 1A). Kapillärrör finns i olika volymstorlekar från 1 μL till 20 μL, och kapillärrörvolymerna väljs enligt kraven. Kapillärrör med mindre volymer rekommenderas inte eftersom de extra fina öppningarna i rör med mindre volymer kan göra det svårt att absorbera vätska som hemolymf. Pipettlampan innehåller ett hål på toppen som inte kan pluggas under hemolymfuppsamlingen. Denna pipettlampa är lämplig för att hålla mikropipetten under vätskeuppsamlingen (figur 1B) och hjälper också till att överföra den uppsamlade vätskan från kapillärröret till uppsamlingsbufferten.

För att enkelt samla hemolymf, i detta arbete, frystes SBPH: erna först i is eller i kylskåpet. Dessa frysta SBPH lokaliserades sedan på en bild under ett stereomikroskop, och ett av benen på varje SBPH drogs av med pincett med finspets (figur 1C). För att säkerställa ett stort sår och optimal hemolymfsamling är det bäst att dra av benet vid roten (Figur 1Ca, b). För att minimera risken för kontaminering av fettkroppen samlades endast klara vätskedroppar utan vita flockar (figur 1Cc). Mikropipetten användes för att absorbera de önskade volymerna hemolymf (figur 1Cd). För att samla in 1 μL hemolymf måste cirka 30-40 larvala SBPH eller 8-15 vuxna SPBH dissekeras.

Analys av den uppsamlade hemolymfen
För att bedöma noggrannheten hos mikropipetten som metod för att utvärdera volymen av uppsamlad hemolymf testade vi proteinkoncentrationerna i olika prover. Hemolymf från larver samlades in med hjälp av en mikropipett med en kapillärvolym på 1 μL, och tre proteinprover samlades in separat och testades genom att köra en SDS-PAGE-gel. Resultaten visade att mängden protein i de tre banorna var nästan lika stor (Figur 2A). För larver var det totala proteininnehållet 3,707 mg/ml ± 1,382 mg/ml. Vi samlade också in samma volym hemolymf från vuxna kvinnliga och manliga SBPH, och dessa visade proteinkoncentrationer på 3,515 mg / ml ± 1,400 mg / ml respektive 3,621 mg / ml ± 0,860 mg / ml (tabell 1). Det fanns inga signifikanta skillnader i proteinet mellan de tre proverna (figur 2B).

Dessutom observerade vi också hemocyterna inuti den uppsamlade larvhemolymfen för att bedöma kvaliteten och renheten hos hemolymfproverna. Hemocyterna varierade i storlek mellan 2-20 nm, och ingen fettkropp detekterades (figur 2C). Majoriteten av de identifierade cellerna var plasmatocyter, som sträckte sig från 5-15 nm i diameter och uppträdde ofta i aggregat25. Vi räknade sedan cellkoncentrationerna av hemolymfen från larver, vuxna honor och vuxna män, och de identifierade cellkoncentrationerna var 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL respektive 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL (tabell 2). Hemocytcellantalet hos larverna, vuxna honor och vuxna hanar visade inga signifikanta skillnader (figur 2D). Dessa resultat indikerar att mikropipettuppsamlingsmetoden är ett tillförlitligt och korrekt sätt att samla hemolymf från SBPH.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av mikropipettmodellen och hemolymfsamlingen. a) Mikropipettens sammansättning. Mikropipetten består av en kapillär och en pipettlampa. Kapillärvolymerna sträcker sig från 1-20 μL. Pipettlampan har ett litet hål på toppen och botten. Kapillären sätts in i bottenhålet och skalan är synlig. (B) Översiktsdiagram över hemolymfsamling med en mikropipett. Insektsbuken hålls uppåt medan ett ben lossnar, hemolymfutflöde induceras och hemolymfen samlas in i pipetten under ett stereomikroskop. c) Hemolymfuppsamlingsprocess med mikropipett. Ett av benen dras av vid roten med pincett med fin spets (a), och insektens kropp pressas för att få hemolymfan att rinna ut (b, c). Hemolymfen från såret samlas in i kapillären (d). Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Analys av SBPH-hemolymfan . (A) Coomassie Blue-färgning som visar tre replikat av insamlad larvhemolymf. Hem indikerar hemolymf. (B) Totala proteinkoncentrationer av hemolymfan hos SBPH hos larver, honor och hanar. (C) Mikroskopiska bilder som visar cellerna i hemolymfan i SBPH vid 20x respektive 60x förstoring. Kärnan färgades med DAPI (blå). Skalstapel = 50 μm. (D) Hemocytdensitet hos larv-, hon- och han-SBPH. Medelvärdet och SD beräknades från tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

hemolymf Proteinkoncentration (mg/ml)
Larv 3.707±1.382
Kvinnlig 3.515±1.400
Manlig 3.621±0.860

Tabell 1: Proteinkoncentrationer av hemolymf från olika SBPH. Data erhölls från tre biologiska replikat.

hemolymf Cellkoncentration (10,5 / μL)
Larv 1.794±0.614
Kvinnlig 1.256±0.603
Manlig 1.553±0.474

Tabell 2: De totala koncentrationerna av hemocyter i hemolymfen från olika SBPH. Data erhölls från tre biologiska replikat.

Kompletterande figur 1: Bestämning av antalet celler. De fyra hörnrutorna (1, 2, 3 och 4) och den centrala kvadraten (5) räknas på cellräkningskammaren. För kantlinjeceller räknas endast de två gränserna (överst och vänster). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hemolymph är mediet i cirkulationssystemet hos leddjur, och arbovirus kan bara invadera andra leddjurvävnader om de kan överleva den fientliga hemolymfmiljön. Att samla ett högkvalitativt prov av hemolymf är det första steget i att studera vektorvirusinteraktionerna som uppträder i hemolymfen. Det har rapporterats att insektshemolymf kan erhållas från flera ställen på insektens kropp, inklusive ett sår på frambenet, ett mindre snitt i huvudområdet eller ett tårsår i buken26,27,28,29. Olika insamlingsmetoder kan fungera för vissa förvärv. Metoden som innebär att man skapar ett litet snitt vid huvud-halsleden är mer lämplig för hemolymfsamling från stora insekter som honungsbin26. Att skapa ett sår i SBPH: s huvudområde är utmanande eftersom det kan skada andra organ och införa kontaminering från andra vävnader. Efter att ha gjort ett tårsår i buken nedsänks insekterna i bufferten, och sedan centrifugeras bufferten för att extrahera hemolymfen. Detta är en bekväm metod för att samla lipider från små insekter21. Men eftersom det finns en hög mängd fettkropp i hemocoel av SBPH, kan ett sår på kroppsdelen orsaka läckage av fettkroppen från såret och leda till kontaminering av hemolymfen. Denna metod är mer lämplig för att samla hemolymf från vuxna SBPH, som har mindre fettkropp än larver. För att effektivt förhindra kontaminering av fettkroppen rekommenderas det att göra ett sår på benplatsen snarare än direkt på kroppen. I tidigare studier av SBPH-hemolymf användes finspetspincett för att underlätta insamlingen av små droppar vätska från såret13. Även om den uppsamlade hemolymfen var fri från föroreningar, mättes inte volymen hemolymf. I denna studie utvecklade vi en enkel mikropipett som kan användas för att exakt och kvantitativt samla hemolymf från mycket små insektsvektorer.

För framgångsrik hemolymfsamling måste flera kritiska steg beaktas. För det första är det viktigt att bedöva insekterna vid 4 ° C i 15 minuter för att producera hemolymf som är fri från fettkropp. För det andra är det enklare att få ren hemolymf genom att dra av det första benet. För det tredje bör insamlingen av hemolymfen ske på ett kontinuerligt och snabbt sätt, eftersom hemolymfen annars kan koagulera i botten och blockera kapillären.

Kapilläruppsamlingstekniken har använts i stor utsträckning för insamling av djurblod30,31. Vi modifierade tekniken för att passa de distinkta egenskaperna hos insektshemolymf. Eftersom SBPH har en liten kroppsstorlek valdes en kapillär med en minimal volym på 1 μL. Användning av en kapillär med en volym lägre än 1 μL rekommenderas inte. Det är anmärkningsvärt att hemolymf innehåller en hög densitet av proteiner och ett betydande antal celler (figur 2), vilket höjer dess vätsketäthet och gör det svårt att absorbera hemolymf via kapillärer med mindre volymer.

Metoden att samla hemolymf med kapillär är en enkel, kostnadseffektiv och livskraftig teknik som möjliggör tillförlitlig och exakt kvantifiering av hemolymfen. Denna nyutvecklade metod kan också tillämpas för insamling av andra spårvätskor från små vektorer, såsom honungsdagg. Det är viktigt att markera att insekterna förblir levande efter extraktion av hemolymf med denna metod. Detta är fördelaktigt för studier med andra insektsorgan eller för upprepad hemolymfsamling. Detta arbete presenterar en värdefull teknik för studier av entomologi och virus-vektorinteraktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Kinas nationella viktiga FoU-program (nr 2022YFD1401700) och av National Science Foundation of China (nr 32090013 och nr 32072385).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE protein gel Bio-rad 4561035 Protein separation and detection
4% paraformaldehyde Solarbio P1110 For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagent Bio-rad 5000205 Protein concentration detection
Capillary Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Cell counting chamber ACMEC AYA0810 Hemocytes counting
Glass slide Gitoglas 10127105A For holding insects
Glass slide coated with silane Sigma S4651-72EA For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 Nucleus staining
Microscope cover glass Gitoglas 10212424C For microscopic observation
Pipette bulb Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Prism 8.0 software GraphPad Software / Statistical analyses
Stereomicroscope  Motic SMZ-168 For insect dissection
Tweezers Tianld P5622 For insect dissection
Zeiss inverted microscope Zeiss Observer Z1 Hemocytes observation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
  3. Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
  4. Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
  5. Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
  6. Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
  7. Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
  8. Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
  9. Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
  10. Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
  11. Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
  12. Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
  13. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
  14. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
  16. Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
  17. Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
  18. Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
  19. Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
  20. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
  21. Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
  22. Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
  23. Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
  24. Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
  25. Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
  26. Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
  27. Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
  28. Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
  29. Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
  30. Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
  31. Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).

Tags

Biologi nummer 194
En exakt och kvantifierbar metod för att samla hemolymf från små leddjur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo,More

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods. J. Vis. Exp. (194), e65250, doi:10.3791/65250 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter