Summary
这里介绍了几种常用的方法来研究质膜受体激酶的膜运输事件。本手稿描述了详细的方案，包括植物材料制备、药物治疗和共聚焦成像设置。
Abstract
在真核细胞中，膜成分（包括蛋白质和脂质）在时空上运输到内膜系统内的目的地。这包括新合成的蛋白质向细胞表面或细胞外部的分泌运输，细胞外货物或质膜成分进入细胞的内吞运输，以及货物在亚细胞器之间的循环或穿梭运输等。膜运输事件对于所有真核细胞的发育、生长和环境适应至关重要，因此受到严格的监管。细胞表面受体激酶感知来自细胞外空间的配体信号，经历分泌和内吞转运。本文介绍了使用质膜定位的富含亮氨酸重复受体激酶ERL1来研究膜运输事件的常用方法。这些方法包括植物材料制备、药物治疗和共聚焦成像设置。为了监测ERL1的时空调控，本研究描述了ERL1与多泡体标志蛋白RFP-Ara7之间的共定位分析，这两种蛋白质的时间序列分析，以及用膜运输抑制剂brefeldin A和wortmannin处理的ERL1-YFP的z-stack分析。
Introduction
膜运输是一种保守的细胞过程，它将膜成分（也称为货物），包括蛋白质、脂质和其他生物产物，在真核细胞内的不同细胞器之间或穿过质膜进出细胞外空间1。该过程由称为内膜系统的膜和细胞器的集合促进，内膜系统由核膜、内质网、高尔基体、液泡/溶酶体、质膜和多个内体组成1.内膜系统能够使用在这些细胞器之间穿梭的动态囊泡对膜组件进行修饰、包装和运输。膜运输事件对细胞发育、生长和环境适应至关重要，因此受到严格而复杂的监管2。目前，分子生物学、化学生物学、显微镜和质谱的多种方法已被开发并应用于膜运输领域，并极大地促进了对内膜系统时空调控的理解3,4。分子生物学用于对参与膜运输的假定参与者进行经典的遗传操作，例如改变目标蛋白质的基因表达或用某些标签标记感兴趣的蛋白质。化学生物学中的工具包括使用专门干扰某些路线4,5的交通的分子。质谱法对于鉴定通过生化方法机械分离的细胞器中的成分非常强大 3,4.然而，膜交通是一个动态、多样和复杂的生物过程1。为了可视化各种条件下活细胞中的膜运输过程，光学显微镜是必不可少的工具。先进的显微镜技术不断取得进展，以克服测量事件的效率、动力学和多样性的挑战4.在这里，本研究侧重于化学/药理生物学，分子生物学和显微镜中广泛采用的方法，以研究自然简化和实验可访问的系统（气孔发育过程）中的膜运输事件。
气孔是植物空中表面上的微孔，它们打开和关闭以促进内部细胞与环境之间的气体交换6,7,8。因此，气孔对于光合作用和蒸腾作用至关重要，这两个事件对植物的生存和生长至关重要。气孔发育通过环境线索动态调整，以优化植物对周围环境的适应9.追溯到2002年的研究，受体蛋白太多嘴（TMM）的鉴定为研究模式植物拟南芥10气孔发育的分子机制打开了新时代。仅仅几十年后，一种经典的信号通路就被确定了。从上游到下游，该途径包括表皮模式因子（EFP）家族中的一组分泌肽配体，EREECTA（ER）家族中的几种细胞表面富含亮氨酸重复（LRR）受体激酶，LRR受体蛋白TMM，MAPK级联反应和几种bHLH转录因子，包括SPEECHLESS（SPCH），MUTE，FAMA和SCREAM（SCRM）11,12,13,14， 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26.先前的工作表明，其中一种受体激酶ER-LIKE 1（ERL1）在EPF感知20时表现出活跃的亚细胞行为。ERL2还在质膜和一些细胞内细胞器之间动态运输27。阻断膜运输步骤会导致气孔图案异常，导致叶片表面出现气孔簇28。这些结果表明，膜交通在气孔发育中起着至关重要的作用。本研究描述了一种使用蛋白质 - 蛋白质亚细胞共定位分析结合使用某些膜运输抑制剂的药物治疗来时空研究ERL1动力学的方案。
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Protocol
1. 溶液的制备
- 通过将 15 mL 漂白剂与 35 mL 蒸馏水和 50 μL Triton X-100 混合来制备种子灭菌溶液。
- 通过将BFA粉末溶解在乙醇中至终浓度为10mM（储备液）来制备布雷菲尔丁A（BFA）溶液。通过将Wm粉末溶解在DMSO中至终浓度为10mM（储备液）来制备麦芽汁（Wm）溶液。
2. 播下种子
- 将来自每个所需转基因植物的 10-50 颗种子等分到 1.5 mL 微量离心管中。向每个管中加入1mL种子灭菌溶液，并通过在摇床上轻轻倒置试管10分钟来彻底混合。
- 弃去种子灭菌溶液，用1mL高压灭菌的蒸馏水洗涤种子五次。
- 向每个试管中加入 300 μL 高压灭菌的蒸馏水，并将种子播种在含有 1% （w/v） 蔗糖和 0.75% （w/v） 琼脂的半强度 MS 培养基上。根据需要用相应的抗生素补充培养基。
- 将板倒置在4°C下在黑暗中2天以同步发芽。
- 2天后，将板转移到22°C下具有16小时光照/ 8小时黑暗循环（80μmol/ m2 /s 1）的生长室中。 这被认为是发芽后的第一天（1 dpg）。
- 将幼苗移植到10 dpg的土壤中以进一步生长。
3. 双色F1转基因植物的制备
- 并排生长带有 ERL1-YFP （植物A）的纯合转基因植物和带有RFP标记标记蛋白 RFP-Ara7 （植物B）20 的纯合转基因植物，直到在22°C下在生长室中开花16小时光照/ 8小时黑暗循环（80μmol/ m2 / s1）。
- 从植物A中选择一个年轻的花序，保留一朵即将在花序上开放的花朵进行遗传杂交。去除所有较老的花朵和长方形。此外，小心地去除年轻的花朵和花分生组织，以避免将来混淆。
- 用锋利的镊子去除萼片、花瓣和雄蕊，轻轻解剖未开封的花朵。只将雌蕊留在花序上。
- 从植物B上开放的花中取出成熟的雄蕊，并将花粉粒沉积在植物A上解剖的雌蕊的柱头上。
- 通过指出其父亲、母亲和遗传杂交的日期来标记这种手动杂交的花。让花成熟，并在长方形变成黄色/棕色时收获 F1 种子（杂交后~20 天）。检查同时具有 YFP 和 RFP 信号的成功 F1 工厂。
4. 药物治疗
- 对于BFA处理，去除7日龄幼苗的子叶，将其余幼苗浸入模拟溶液（0.3%乙醇）或30μM BFA溶液中，真空应用1分钟，并保持样品浸入30分钟前成像。
- 对于麦芽汁酶处理，去除7天龄幼苗的子叶，将其余幼苗浸入0.25%DMSO溶液或25mM麦芽甘素中，真空应用1分钟，并在成像前保持样品浸泡30分钟。
- 对于样品的真空处理，在1.5 mL微量离心管中，加入500μL相应的药物溶液，并将解剖的幼苗浸入溶液中。将10 mL注射器紧紧连接到微量离心管上，并真空1分钟（图1）。取出注射器，并将样品在溶液中保持所需的时间。轻轻取出幼苗进行成像准备。
图 1：简单的真空装置。 将 10 mL 注射器连接到 1.5 mL 微量离心管上进行真空处理。 请点击此处查看此图的大图。
5. 成像样品制备
- 使用锋利的剃须刀片从处理过的样品中解剖真实的叶子。轻轻地将真叶放入载玻片上的一滴水中，并保持远轴面朝上。用盖玻片慢慢覆盖真叶，同时避免捕获任何气泡。
6. 共聚焦成像
注意：在这项工作中，使用徕卡SP8倒置扫描共聚焦显微镜对样品的荧光信号进行成像。
- 光束路径设置
- 选择 514 nm 激光器进行 YFP 激发。使用高激光功率来增加信号强度，从而获得高图像质量。但是，激光功率高于5%存在光漂白的风险，并且样品的健康可能会受到影响。如果样品信号不太暗，则从低激光强度开始。
- 打开PMT/HyD进行检测，并根据YFP荧光基团的光谱定义发射带上限和下限阈值。设置530-570nm的检测窗口以收集YFP信号。
- 第二种颜色的顺序成像：单击Seq按钮，然后添加新通道。默认情况下，先前设计的YFP光束路径将为Seq 1。在序列2中，选择561 nm激光器进行RFP激发，并设置570-630 nm的检测窗口以收集RFP信号。
- 扫描条件设置（图2）
- 要对气孔前体细胞内的亚细胞膜交通活动进行成像，请在系统上选择63x/1.2 W Corr透镜进行成像。
- 格式是指以像素为单位的图像大小。从 1,024 像素 x 1,024 像素开始，然后根据缩放系数和物镜设置对其进行优化，以获得良好的出版质量分辨率。
- 速度是指激光经过每个像素时扫描头的速度。虽然较低的扫描速度通常会导致更好的信噪比，但它们可能无法有效地捕获快速变化的膜运输事件。从 400 Hz 的速度开始，并根据样本的具体情况进行优化。
- 变焦系数用于在不更改物镜的情况下放大感兴趣区域。从缩放因子 1 开始，并根据实验的特定需求对其进行优化。
- 线 平均值 是指扫描每条X线以获得平均结果的次数。较大的线平均值会降低结果图像中的噪声，但也会增加扫描时间和对激光的曝光时间。要对膜贩运事件进行成像，请勿使用高线平均值。从 2 倍线平均值开始，然后根据需要进行优化。
- 收集时间序列
注意：在研究膜运输事件时，通常需要一个时间序列来记录亚细胞内体的快速运动。- 在 采集模式下，选择 xyt 扫描模式以启用时间序列实用程序。
- 在 时间间隔下确定时间点之间的等待期。或者， 单击最小化以 立即一个接一个地拍摄图像。在以下时间序列实验中使用了7 s时间间隔。
- 选择 持续时间，然后输入实验运行的总时间。或者，通过选择帧来定义要收集的 帧 数（图3）。
- 要收集有关整个细胞内膜运输事件的三维信息，请使用Z-stack扫描模式。Z 堆栈图像的最大强度投影通常用于分析。
- 在采集模式下选择 xyz 扫描模式，然后 Z-Stack 实用程序将变得可访问。
- 选择 Z 宽度 选项。在 扫描模式下，使用“ 开始 ”和 “结束 ”按钮定义 Z 堆栈的顶部图像和底部图像。
- 通过单击 z 步长来定义 z 步长的粗细。或者，定义要拍摄的图像数量以覆盖 Z 堆栈的整个范围。为确保样本之间的一致性，请定义 z 步长（图 4）。
- 图像处理
- z-stack图像的最大强度投影由共聚焦软件（http://www.leica-microsystems.com）生成。在主“进程”选项卡中，首先在最左侧的“打开项目”选项卡下选择感兴趣的 z 堆栈文件。然后，切换到名为“过程工具”的中间选项卡，选择“投影”功能，在“方法”的下拉面板中选择“最大值”，然后单击“应用”按钮。z 堆栈投影图像将在“打开的项目”选项卡下生成。
- 时间序列图像的视频由斐济（https://imagej.net/Fiji）生成。在文件 选项卡中，使用 打开 函数以正确的顺序打开所有时间序列图像。在“ 图像 ”选项卡中，找到 “堆栈 ”功能，然后选择 “要堆叠的图像 ”以生成视频。以具有所需帧速率（ 视频 1 为 5 帧/秒）的 .avi 格式保存文件。
图 2：XY 维度的扫描模式面板。 扫描模式面板用于设置图像扫描条件。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：xyt 扫描模式下的时间序列实用程序。 时间序列实用程序用于设置成像条件以连续收集一系列图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：xyz 扫描模式下的 z 堆栈实用程序。 z 堆栈实用程序用于设置成像条件以在 z 轴上收集一系列图像。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
先前的一项研究表明，ERL1是一种经历动态膜运输事件的活性受体激酶20。ERL1是质膜上的跨膜LRR受体激酶。内质网中新合成的ERL1在高尔基体中处理并进一步运输到质膜。质膜上的ERL1分子可以使用其细胞外LRR结构域18感知EPF配体。在被抑制性EPFs（包括EPF1）激活后，ERL1被内化到内体中，运输到多泡体（MVB），然后运输到液泡中降解以终止信号20。相反，促进气孔形成14的拮抗性EPFL9配体在内质网中保留ERL1。或者，质膜定位的ERL1可以在内体和质膜20之间循环。
在这里，携带ERL1 启动子：：ERL1-YFP 的转基因植物按照上述方案生长7天。当刚刚出现时，解剖真正的叶子进行成像，因为 ERL1 仅在幼叶20的气孔谱系细胞中表达。正如预期的那样，散射的细胞被YFP信号突出显示，其中ERL1-YFP标记质膜（图5）。此外，还观察到多个点状信号，表明ERL1也定位于内体。
在光学显微镜下观察时，植物细胞中的几种细胞器表现为点状荧光信号，例如反式高尔基体网络和MVB。当携带 RFP-Ara7 的MVB标记系与 ERL1-YFP 转基因系进行遗传杂交时，使用上述顺序成像方法观察两种标记蛋白。 如图 6 所示，RFP-Ara7 突出显示了几乎所有细胞中的多个点状信号，表明这些细胞中的 MVB（图 6B）。当与ERL1-YFP信号合并时，大多数ERL1-YFP阳性点状物与RFP-Ara7标记的点状点状点重叠。这一结果表明，一些ERL1-YFP分子被转运到MVB。
为了监测这些快速移动的内体的动力学，收集了带有 ERL1-YFP 和 RFP-Ara7 的7天龄真叶的时间序列图像（图7）。应用7 s的时间间隔为203 s，收集的30张图像用于生成图像J中的视频（视频1）。该视频显示，ERL1-YFP标记的内体与RFP-Ara7在气孔谱系细胞内一起移动，从而证实了ERL1-YFP定位于MVB。
为了使用药理学方法检查ERL1运输路线，分析了两种常用的膜运输药物brefeldin A（BFA）和wortmannin（Wm）的效果。BFA通过抑制ADP-核糖基化因子鸟嘌呤-核苷酸交换因子（包括GNOM）可以阻断膜蛋白的内体循环和内吞作用29。暴露于BFA溶液30分钟后，在一些称为BFA体的大隔室中检测到ERL1-YFP（图8B，C）。 这表明 BFA 可以阻断 ERL1 的运输，这表明 ERL1 经历了回收或内吞作用。Wm可以抑制磷脂酰肌醇-3和磷脂酰肌醇-4激酶，从而引起MVB的融合5。当用Wm处理30分钟时，观察到ERL1-YFP突出显示的一些环状结构，通常称为Wm体（图8C）。该结果表明ERL1-YFP被转运到MVB，因此表明ERL1遵循液泡降解的途径。
图5：ERL1-YFP的单平面图像 。 （A）荧光图像，（B）明场图像和（C）合并图像显示ERL1-YFP标记气孔谱系细胞内的质膜和一些高度移动的点状物。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：ERL1-YFP和RFP-Ara7的顺序图像 。 （A）ERL1-YFP和（B）RFP-Ara7都标记细胞内的点状信号。（C）合并图像和（D）插图中的白色点状物表明这两种蛋白质在气孔谱系细胞内的MVB上共定位。白色箭头表示由ERL1-YFP和RFP-Ara7标记的内体。红色箭头表示由RFP-Ara7标记的内体。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：ERL1-YFP 和 RFP-Ara7 的时间序列图像。 图像以7秒的时间间隔拍摄。每个图像的时间点显示在左上角。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图8：ERL1-YFP的Z堆栈图像。 （A，B）用（A）模拟或（B）BFA处理的ERL1-YFP植物的Z堆栈图像。右上角的数字从上到下表示图像在 z 堆栈中的位置。比例尺：10 μm。 （C）用模拟或BFA溶液和模拟或Wm溶液处理的ERL1-YFP的z堆栈图像的投影，如右上角所示。箭头表示由药物引起的ERL1-YFP的聚集体。比例尺：10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
视频1：ERL1-YFP和RFP-Ara7的时间序列图像视频。 ERL1-YFP和RFP-Ara7的时间序列图像使用斐济以5帧/秒的速度堆叠成视频。 请 点击这里下载此视频。
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Discussion
内膜系统将真核细胞的细胞质分离成不同的区室，从而使这些细胞器具有专门的生物学功能。为了在正确的时间将货物蛋白和大分子运送到它们的最终目的地，许多囊泡被引导到这些细胞器之间穿梭。高度调控的膜运输事件在细胞的活力、发育和生长中起着重要作用。调节这一关键而复杂的过程的机制仍然知之甚少。
这里已经描述了几种方法，用于观察膜蛋白的亚细胞定位，分析用不同荧光蛋白标记的两个膜蛋白之间的共定位，使用时间序列图像监测膜蛋白的动态运动，以及通过执行覆盖整个细胞的z-stack成像来收集有关膜蛋白的3D信息。除了这里描述的膜运输事件外，这些方法可以很容易地应用于其他生物过程。例如，可以在长期（几天）内进行时间序列成像以监测发育过程30。可以执行z-stack成像以量化细胞30内蛋白质的丰度。此外，这些成像方法可以与药理学应用完美结合，包括各种药物、激素，甚至环境线索，表明这些成像方法很容易应用于活体生物样品。除了样品处理的灵活性外，这里描述的方法只需要经济实惠的设备，共聚焦显微镜除外，并且只需要对人员进行技术技能的轻度培训，因此这意味着这些方法可以被广泛采用。
在协议的几个关键步骤中需要谨慎。首先，膜运输药物的最佳浓度因材料和治疗而异。先前的一项研究表明，30μM BFA是一种低浓度，可以触发特征性的BFA体形成，而不会导致分生组织20中的高尔基体崩溃。同样，25μM Wm是一种低但有效的浓度，可以在不严重损害分生组织的情况下赋予Wm身体形成。当处理新材料（不同的植物物种，植物的不同部分等）时，需要相应地优化药物的浓度。其次，为了在处理过程中最大限度地保持样品的生理状况，幼苗保持部分完整（仅去除子叶），直到成像步骤。解剖真叶以进行载玻片制备，然后对样品进行成像。每个样品都需要单独处理，并且需要新鲜制作载玻片以进行成像。最后，z-stack成像和时间序列成像都需要对样品进行重复激光扫描。为了尽量减少样品上光漂白和光毒性的风险，强烈建议使用低激光功率。
膜运输事件的高效率是通过运输路线的多样性及其响应细胞1的特定发育和环境条件的动力学来保证的。所描述的方法具有有限的时空分辨率，因此正在出现更复杂的光学显微镜技术，以获得真核细胞内膜交通的详细知识。例如，超分辨率显微镜，包括随机光学重建显微镜（STORM）和光活化定位显微镜（PALM），大大提高了荧光标记蛋白的空间分辨率31,32，尽管只能分析固定样品;转盘显微镜大大加快了扫描速度并减少了样品的光漂白33，尽管使用这种方法记录低丰度蛋白质的动力学具有挑战性;光片显微镜提供快速温和的3D成像34,35;双光子显微镜能够检测来自更深层组织的荧光信号35,36，尽管代价是分辨率略低等。此外，化学生物学已经确定了与某些贩运路线有关的更具体的药物。尽管存在局限性，但这些技术与其他新兴的先进技术将大大提高我们的知识，并阐明细胞膜运输系统的机制。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家科学基金会（IOS-2217757）（X.Q.）和阿肯色大学医学科学（UAMS）布朗森基金会奖（H.Z.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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