Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Plusieurs méthodes couramment utilisées sont présentées ici pour étudier les événements de trafic membranaire d’une kinase du récepteur de la membrane plasmique. Ce manuscrit décrit les protocoles détaillés, y compris la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale.

Abstract

Dans les cellules eucaryotes, les composants membranaires, y compris les protéines et les lipides, sont transportés spatio-temporellement vers leur destination dans le système endomembranaire. Cela comprend le transport sécrétoire de protéines nouvellement synthétisées à la surface cellulaire ou à l’extérieur de la cellule, le transport endocytaire de cargaisons extracellulaires ou de composants de membrane plasmique dans la cellule, et le recyclage ou le transport de navettes entre les organites subcellulaires, etc. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement, la croissance et l’adaptation environnementale de toutes les cellules eucaryotes et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte. Les kinases réceptrices de surface cellulaire, qui perçoivent les signaux de ligand de l’espace extracellulaire, subissent à la fois un transport sécrétoire et endocytaire. Les approches couramment utilisées pour étudier les événements de trafic membranaire à l’aide d’une kinase à récepteurs riches en leucine et à répétition localisée par membrane plasmique, ERL1, sont décrites ici. Les approches comprennent la préparation du matériel végétal, le traitement pharmacologique et la configuration de l’imagerie confocale. Pour surveiller la régulation spatio-temporelle d’ERL1, cette étude décrit l’analyse de co-localisation entre ERL1 et une protéine marqueur corporel multi-vésiculaire, RFP-Ara7, l’analyse de séries chronologiques de ces deux protéines et l’analyse z-stack d’ERL1-YFP traitées avec les inhibiteurs du trafic membranaire brefeldin A et wortmannin.

Introduction

Le trafic membranaire est un processus cellulaire conservé qui distribue les composants membranaires (également appelés cargaisons), y compris les protéines, les lipides et d’autres produits biologiques, entre différents organites au sein d’une cellule eucaryote ou à travers la membrane plasmique vers et depuis l’espace extracellulaire1. Ce processus est facilité par une collection de membranes et d’organites appelée système endomembranaire, qui comprend la membrane nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les vaculoles/lysosomes, la membrane plasmique et de multiples endosomes1. Le système endomembranaire permet la modification, l’emballage et le transport des composants membranaires à l’aide de vésicules dynamiques qui font la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire sont cruciaux pour le développement cellulaire, la croissance et l’adaptation environnementale et, par conséquent, sont soumis à une réglementation stricte et complexe2. Actuellement, de multiples approches en biologie moléculaire, en biologie chimique, en microscopie et en spectrométrie de masse ont été développées et appliquées au domaine du trafic membranaire et ont grandement fait progresser la compréhension de la régulation spatio-temporelle du système endomembranaire 3,4. La biologie moléculaire est utilisée pour les manipulations génétiques classiques des acteurs présumés impliqués dans le trafic membranaire, telles que la modification de l’expression génique de la protéine d’intérêt ou l’étiquetage de la protéine d’intérêt avec certaines étiquettes. Les outils en biologie chimique comprennent l’utilisation de molécules qui interfèrent spécifiquement avec le trafic de certaines routes 4,5. La spectrométrie de masse est puissante pour identifier les composants d’un organite qui a été isolé mécaniquement par des approches biochimiques 3,4. Cependant, le trafic membranaire est un processus biologique dynamique, diversifié et complexe1. Pour visualiser le processus de trafic membranaire dans les cellules vivantes dans diverses conditions, la microscopie optique est un outil essentiel. Des progrès continus ont été réalisés dans les techniques de microscope avancées pour surmonter les défis liés à la mesure de l’efficacité, de la cinétique et de la diversité des événements4. Ici, cette étude se concentre sur les méthodologies largement adoptées en biologie chimique / pharmacologique, en biologie moléculaire et en microscopie pour étudier les événements de trafic membranaire dans un système naturellement simplifié et accessible expérimentalement, le processus de développement stomatique.

Les stomates sont des micropores sur les surfaces aériennes des plantes qui s’ouvrent et se ferment pour faciliter les échanges gazeux entre les cellules internes et l’environnement 6,7,8. Par conséquent, les stomates sont essentiels à la photosynthèse et à la transpiration, deux événements cruciaux pour la survie et la croissance des plantes. Le développement stomatique est ajusté dynamiquement par des indices environnementaux afin d’optimiser l’adaptation de la plante à l’environnement9. Datant d’études de 2002, l’identification de la protéine réceptrice Too Many Mouths (TMM) a ouvert la porte à une nouvelle ère d’étude des mécanismes moléculaires du développement stomatique chez la plante modèle Arabidopsis thaliana10. Après seulement quelques décennies, une voie de signalisation classique a été identifiée. De l’amont vers l’aval, cette voie comprend un groupe de ligands peptidiques sécrétoires de la famille des facteurs de structuration épidermique (EFP), plusieurs kinases des récepteurs LRR (Leucine-Rich-Repeat) à la surface cellulaire de la famille EREECTA (ER), la protéine réceptrice LRR TMM, une cascade MAPK et plusieurs facteurs de transcription bHLH, notamment SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA et SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Des travaux antérieurs indiquent que l’un des récepteurs kinases, ER-LIKE 1 (ERL1), démontre des comportements subcellulaires actifs lors de la perception EPF20. ERL2 circule également dynamiquement entre la membrane plasmique et certains organites intracellulaires27. Le blocage des étapes de trafic membranaire provoque une structuration stomatique anormale, entraînant des grappes stomatiques à la surface des feuilles28. Ces résultats suggèrent que le trafic membranaire joue un rôle essentiel dans le développement stomatique. Cette étude décrit un protocole pour étudier spatio-temporellement la dynamique ERL1 en utilisant une analyse de colocalisation sous-cellulaire protéine-protéine combinée à un traitement pharmacologique utilisant certains inhibiteurs du trafic membranaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation des solutions

  1. Préparer la solution de stérilisation des semences en mélangeant 15 mL d’eau de Javel avec 35 mL d’eau distillée et 50 μL de Triton X-100.
  2. Préparer la solution de brefeldine A (BFA) en dissolvant la poudre de BFA dans de l’éthanol jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock). Préparer la solution de wortmannin (Wm) en dissolvant la poudre de Wm dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 10 mM (stock).

2. Semer les graines

  1. Aliquote 10-50 graines de chacune des plantes transgéniques requises dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Ajouter 1 mL de solution de stérilisation des graines dans chaque tube et bien mélanger en retournant doucement le tube pendant 10 minutes sur un agitateur.
  2. Jeter la solution de stérilisation des graines et laver les graines avec 1 mL d’eau distillée autoclavée cinq fois.
  3. Ajouter 300 μL d’eau distillée autoclavée dans chaque tube et semer les graines sur un milieu MS à demi-concentration contenant 1 % (p/v) de saccharose et 0,75 % (p/v) d’agar. Complétez le milieu avec les antibiotiques correspondants au besoin.
  4. Gardez la plaque à l’envers à 4 °C dans l’obscurité pendant 2 jours pour synchroniser la germination.
  5. Après 2 jours, transférer la plaque dans une salle de culture avec un cycle d’obscurité de 16 h lumière/8 h (80 μmol/m2/s1) à 22 °C. Ceci est considéré comme le premier jour après la germination (1 dpg).
  6. Transplantez les plantules dans le sol à 10 dpg pour une croissance ultérieure.

3. Préparation de plantes transgéniques F1 bicolores

  1. Cultiver côte à côte des plantes transgéniques homozygotes portant ERL1-YFP (plante A) et des plantes transgéniques homozygotes portant une protéine marqueur marquée RFP-Ara7 (plante B)20 jusqu’à la floraison dans une salle de croissance avec un cycle d’obscurité de 16 h par la lumière et 8 h (80 μmol/m2/s1) à 22 °C.
  2. Choisissez une jeune inflorescence de la plante A. Gardez une fleur qui est sur le point de s’ouvrir sur l’inflorescence pour les croisements génétiques. Enlevez toutes les fleurs et siliques plus anciennes. De plus, retirez soigneusement les fleurs plus jeunes et les méristèmes floraux pour éviter toute confusion future.
  3. Disséquez délicatement la fleur non ouverte en enlevant les sépales, les pétales et les étamines à l’aide d’une pince à épiler pointue. Ne laissez que le pistil sur l’inflorescence.
  4. Prenez une étamine mature d’une fleur ouverte sur la plante B et déposez les grains de pollen sur le stigmate du pistil disséqué sur la plante A.
  5. Étiquetez cette fleur croisée manuellement en indiquant son père, sa mère et la date du croisement génétique. Laissez la fleur mûrir et récoltez les graines F1 lorsque la silique devient jaune/brune (~20 jours après la croix). Vérifiez si une usine F1 réussie possède à la fois des signaux YFP et RFP.

4. Traitement pharmacologique

  1. Pour le traitement BFA, retirer les cotylédons des plantules âgées de 7 jours, immerger le reste des plantules dans une solution fictive (éthanol à 0,3 %) ou une solution BFA à 30 μM, appliquer le vide pendant 1 min et maintenir l’échantillon immergé pendant 30 minutes avant l’imagerie.
  2. Pour le traitement du wortmannin, retirez les cotylédons des plantules âgées de 7 jours, immergez le reste des plantules dans une solution de DMSO à 0,25% ou dans du wortmannin à 25 mM, appliquez le vide pendant 1 min et maintenez l’échantillon immergé pendant 30 minutes avant l’imagerie.
  3. Pour le traitement sous vide des échantillons, dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL, ajouter 500 μL de la solution médicamenteuse correspondante et immerger les plantules disséquées dans la solution. Fixez hermétiquement une seringue de 10 mL au tube de microcentrifugation et appliquez le vide pendant 1 min (Figure 1). Retirez la seringue et conservez l’échantillon dans la solution pendant le temps requis. Retirez délicatement les plantules pour la préparation de l’imagerie.

Figure 1
Figure 1 : Dispositif à vide simple. Une seringue de 10 mL est fixée à un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour le traitement sous vide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Préparation des échantillons pour l’imagerie

  1. Disséquer la vraie feuille de l’échantillon traité à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Mettez doucement la vraie feuille dans une goutte d’eau sur une lame de verre et maintenez le côté abaxial vers le haut. Couvrez lentement la vraie feuille avec une lamelle de couverture tout en évitant de piéger les bulles.

6. Imagerie confocale

REMARQUE: Un microscope confocal à balayage inversé Leica SP8 a été utilisé pour imager le signal de fluorescence des échantillons dans ce travail.

  1. Configuration du trajet du faisceau
    1. Sélectionnez un laser 514 nm pour l’excitation YFP. Utilisez une puissance laser élevée pour augmenter l’intensité du signal et, ainsi, obtenir une qualité d’image élevée. Cependant, les puissances laser supérieures à 5% courent le risque de photoblanchiment, et la santé de l’échantillon peut être affectée. Si le signal de l’échantillon n’est pas trop faible, commencez à faible intensité laser.
    2. Activez PMT/HyD pour la détection et définissez les seuils de bande d’émission supérieurs et inférieurs en fonction du spectre du fluorophore YFP. Définissez une fenêtre de détection de 530 à 570 nm pour collecter le signal YFP.
    3. Imagerie séquentielle pour la deuxième couleur : Cliquez sur le bouton Seq et ajoutez un nouveau canal. Par défaut, le trajet de faisceau YFP précédemment conçu sera Seq 1. Dans Seq 2, sélectionnez un laser 561 nm pour l’excitation RFP et définissez une fenêtre de détection de 570-630 nm pour collecter le signal RFP.
  2. Configuration des conditions d’analyse (Figure 2)
    1. Pour imager l’activité du trafic de la membrane subcellulaire dans les cellules précurseurs stomatiques, choisissez une lentille Corr 63x/1,2 W sur le système pour l’imagerie.
    2. Le format fait référence à la taille de l’image en pixels. Commencez avec 1 024 pixels x 1 024 pixels, puis optimisez-le en fonction du facteur de zoom et des paramètres objectifs pour une bonne résolution de la qualité de la publication.
    3. La vitesse fait référence à la vitesse de la tête de balayage lorsque le laser passe sur chaque pixel. Bien que les vitesses de balayage lentes entraînent souvent un meilleur rapport signal/bruit, elles peuvent ne pas capturer efficacement les événements de trafic de membrane qui changent rapidement. Commencez avec une vitesse de 400 Hz et optimisez-la en fonction de la situation spécifique des échantillons.
    4. Le facteur zoom est utilisé pour zoomer sur une région d’intérêt sans changer l’objectif de l’objectif. Commencez avec un facteur de zoom de 1 et optimisez-le en fonction des besoins spécifiques de l’expérience.
    5. La moyenne des lignes fait référence au nombre de fois que chaque ligne X sera balayée pour obtenir un résultat moyen. Une moyenne de ligne plus élevée réduit le bruit dans l’image résultante, mais elle augmente également le temps de numérisation et le temps d’exposition à la lumière laser. Pour imager les événements de trafic de membrane, n’utilisez pas une moyenne de ligne élevée. Commencez avec une moyenne de lignes 2x et optimisez au besoin.
  3. Collecte d’une série chronologique
    REMARQUE: Lors de l’étude des événements de trafic membranaire, une série chronologique est souvent nécessaire pour enregistrer le mouvement rapide des endosomes subcellulaires.
    1. En mode d’acquisition, sélectionnez le mode d’analyse xyt pour activer l’utilitaire de séries chronologiques.
    2. Décidez d’une période d’attente entre les points de temps sous Intervalle de temps. Vous pouvez également cliquer sur Réduire pour prendre les images immédiatement l’une après l’autre. Un intervalle de temps de 7 s a été utilisé dans l’expérience de série chronologique suivante.
    3. Sélectionnez Durée, puis entrez la durée totale d’exécution de l’expérience. Vous pouvez également définir le nombre d’images à collecter en sélectionnant Images (Figure 3).
  4. Pour collecter les informations tridimensionnelles concernant l’événement de trafic de membrane dans l’ensemble de la cellule, utilisez le mode de balayage Z-stack. La projection d’intensité maximale des images Z-stack est souvent utilisée pour l’analyse.
    1. Sélectionnez le mode d’analyse xyz dans le mode d’acquisition, puis l’utilitaire Z-Stack deviendra accessible.
    2. Sélectionnez l’option Z-wide . Sous le mode de numérisation, définissez l’image supérieure et l’image inférieure de la pile Z à l’aide des boutons Début et Fin .
    3. Définissez l’épaisseur de l’étape z en cliquant sur taille de l’étape z. Vous pouvez également définir le nombre d’images à prendre afin de couvrir toute la gamme de la pile Z. Pour assurer la cohérence entre les échantillons, définissez la taille de l’étape z (Figure 4).
  5. Traitement d'images
    1. La projection d’intensité maximale des images z-stack est générée par le logiciel confocale (http://www.leica-microsystems.com). Dans l’onglet Processus principal, choisissez d’abord le fichier z-stack intéressé sous l’onglet Projets ouverts à l’extrême gauche. Ensuite, passez à l’onglet central nommé Outils de processus, sélectionnez la fonction Projection , choisissez Maximum dans le panneau déroulant de Méthode, puis cliquez sur le bouton Appliquer . Une image de projection z-stack sera générée sous l’onglet Projets ouverts.
    2. La vidéo des images de la série chronologique est générée par Fidji (https://imagej.net/Fiji). Dans l’onglet Fichier , utilisez la fonction Ouvrir pour ouvrir toutes les images de séries chronologiques dans le bon ordre. Dans l’onglet Image , recherchez la fonction Pile et choisissez Images à empiler pour générer une vidéo. Enregistrez le fichier au format .avi avec la fréquence d’images souhaitée (5 images/s pour la vidéo 1).

Figure 2
Figure 2 : panneau du mode de balayage de la dimension XY. Le panneau Mode de numérisation permet de configurer les conditions de numérisation de l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : utilitaire de série chronologique en mode d’analyse xyt. L’utilitaire de série chronologique est utilisé pour configurer les conditions d’imagerie afin de collecter consécutivement une série d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : L’utilitaire z-stack en mode d’analyse xyz. L’utilitaire z-stack est utilisé pour configurer les conditions d’imagerie afin de collecter une série d’images sur l’axe z. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Une étude antérieure a indiqué qu’ERL1 est une kinase réceptrice active qui subit des événements de trafic membranaire dynamique20. ERL1 est une kinase transmembranaire du récepteur LRR sur la membrane plasmique. ERL1 nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplasmique est traité dans les corps de Golgi et ensuite transporté vers la membrane plasmique. Les molécules ERL1 sur la membrane plasmique peuvent percevoir les ligands EPF en utilisant leur domaine LRRextracellulaire 18. Lors de l’activation par les EPF inhibiteurs, y compris EPF1, ERL1 est internalisé dans les endosomes, transporté vers les corps multi-vésiculaires (MVB), puis transporté dans les vacuoles pour la dégradation pour terminer le signal20. En revanche, le ligand antagoniste EPFL9, qui favorise la formation stomatique14, retient ERL1 dans le réticulum endoplasmique. Alternativement, la membrane plasmique localisée ERL1 peut se recycler entre les endosomes et la membrane plasmique20.

Ici, des plantes transgéniques portant le promoteur ERL1::ERL1-YFP ont été cultivées pendant 7 jours suivant le protocole mentionné ci-dessus. Lors de son émergence, la vraie feuille a été disséquée pour l’imagerie, car ERL1 n’est exprimé que dans les cellules de lignée stomatique des jeunes feuilles20. Comme prévu, les cellules dispersées ont été mises en évidence par le signal YFP, où ERL1-YFP a marqué la membrane plasmique (Figure 5). En outre, de multiples signaux ponctués ont également été observés, suggérant que ERL1 était également localisé aux endosomes.

Plusieurs organites dans les cellules végétales présentent des signaux fluorescents ponctués lorsqu’ils sont observés au microscope optique, tels que le réseau trans-Golgi et les MVB. Lorsque la lignée marqueuse MVB portant RFP-Ara7 a été génétiquement croisée avec la lignée transgénique ERL1-YFP , les deux protéines marqueurs ont été observées en utilisant l’approche d’imagerie séquentielle décrite ci-dessus. Comme le montre la figure 6, RFP-Ara7 a mis en évidence plusieurs signaux ponctués dans presque toutes les cellules, indiquant les MVB dans ces cellules (Figure 6B). Lors de la fusion avec le signal ERL1-YFP, la plupart des ponctués positifs ERL1-YFP chevauchaient le ponctué marqué RFP-Ara7. Ce résultat suggère que certaines des molécules ERL1-YFP sont transportées vers les MVB.

Pour surveiller la dynamique de ces endosomes à déplacement rapide, des images de séries chronologiques des vraies feuilles âgées de 7 jours portant ERL1-YFP et RFP-Ara7 ont été recueillies (Figure 7). Des intervalles de temps de 7 s ont été appliqués pendant 203 s, et les 30 images collectées ont été utilisées pour générer une vidéo dans l’image J (vidéo 1). La vidéo a montré que les endosomes marqués ERL1-YFP se déplaçaient avec RFP-Ara7 dans les cellules de la lignée stomatique, confirmant ainsi que ERL1-YFP était localisé dans les MVB.

Pour examiner les itinéraires de trafic ERL1 à l’aide d’une approche pharmacologique, l’effet de deux drogues couramment utilisées contre le trafic membranaire, la brefeldine A (BFA) et le wortmannin (Wm), a été analysé. Le BFA, en inhibant le facteur ADP-ribosylation des facteurs d’échange guanine-nucléotidiques, y compris GNOM, peut bloquer le recyclage endosomique et l’endocytose des protéines membranaires29. Après 30 minutes d’exposition à la solution BFA, ERL1-YFP a été détecté dans certains grands compartiments appelés corps BFA (Figure 8B, C). Cela indique que le trafic ERL1 peut être bloqué par BFA, ce qui suggère que ERL1 subit un recyclage ou une endocytose. Wm peut inhiber les kinases phosphatidylinositol-3 et phosphatidylinositol-4 et, ainsi, provoque la fusion des MVB5. Lorsqu’elles ont été traitées avec Wm pendant 30 minutes, certaines structures en forme d’anneau mises en évidence par ERL1-YFP ont été observées, qui sont généralement appelées corps Wm (Figure 8C). Ce résultat indique que ERL1-YFP est transporté vers les MVB, ce qui suggère que ERL1 suit la voie vers les vacuoles pour la dégradation.

Figure 5
Figure 5 : Image d’un seul plan d’ERL1-YFP. (A) L’image de fluorescence, (B) l’image en champ clair, et (C) l’image fusionnée montrent que ERL1-YFP marque la membrane plasmique et certains ponctués très mobiles dans les cellules de lignée stomatique. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Images séquentielles d’ERL1-YFP et RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP et (B) RFP-Ara7 marquent tous deux des signaux ponctués dans la cellule. Le blanc ponctué dans (C) l’image fusionnée et (D) l’image en médaillon indique que les deux protéines co-localisent sur les MVB dans les cellules de la lignée stomatique. Les flèches blanches indiquent les endosomes marqués à la fois par ERL1-YFP et RFP-Ara7. Les flèches rouges indiquent les endosomes marqués par RFP-Ara7. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Images chronologiques d’ERL1-YFP et RFP-Ara7. Les images ont été prises avec un intervalle de temps de 7 s. Le point temporel de chaque image est indiqué dans le coin supérieur gauche. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Images de la pile Z des usines ERL1-YFP. (A, B) Z-stack des plantes ERL1-YFP traitées avec (A) mock ou (B) BFA. Les chiffres dans le coin supérieur droit indiquent la position de l’image dans la pile z de haut en bas. Barre d’échelle: 10 μm. (C) Projection des images z-stack d’ERL1-YFP traitées avec une solution fictive ou BFA et une solution fictive ou Wm, comme indiqué dans le coin supérieur droit. Les flèches indiquent les corps d’agrégation d’ERL1-YFP causés par les médicaments. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Vidéo des images chronologiques d’ERL1-YFP et RFP-Ara7. Les images de séries chronologiques d’ERL1-YFP et RFP-Ara7 sont empilées dans une vidéo en utilisant Fidji à une vitesse de 5 images / s. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le système endomembranaire sépare le cytoplasme d’une cellule eucaryote en différents compartiments, ce qui permet la fonction biologique spécialisée de ces organites. Pour livrer les protéines et les macromolécules de cargaison à leur destination finale au bon moment, de nombreuses vésicules sont guidées pour faire la navette entre ces organites. Les événements de trafic membranaire hautement réglementés jouent un rôle fondamental dans la viabilité, le développement et la croissance des cellules. Le mécanisme régulant ce processus crucial et compliqué est encore mal compris.

Plusieurs approches ont été décrites ici pour observer la localisation subcellulaire des protéines membranaires, analyser la co-localisation entre deux protéines membranaires marquées avec différentes protéines fluorescentes, surveiller le mouvement dynamique d’une protéine membranaire à l’aide d’images de séries chronologiques et collecter des informations 3D sur une protéine membranaire en effectuant une imagerie z-stack couvrant toute la cellule. Outre les événements de trafic membranaire décrits ici, ces approches peuvent être facilement appliquées à d’autres processus biologiques. Par exemple, l’imagerie de séries chronologiques peut être réalisée sur une période à long terme (plusieurs jours) pour surveiller un processus de développement30. L’imagerie z-stack peut être réalisée pour quantifier l’abondance d’une protéine dans une cellule30. En outre, ces approches d’imagerie peuvent parfaitement se combiner avec des applications pharmacologiques, y compris divers médicaments, hormones et même des indices environnementaux, ce qui indique que ces approches d’imagerie sont facilement applicables aux échantillons biologiques vivants. Outre la flexibilité du traitement des échantillons, les méthodes décrites ici ne nécessitent que des dispositifs économiquement abordables, à l’exception du microscope confocal, et une formation légère du personnel aux compétences techniques, ce qui signifie que ces méthodes peuvent être largement adoptées.

La prudence est nécessaire dans plusieurs étapes critiques du protocole. Premièrement, les concentrations optimales des drogues membranaires varient en fonction du matériel et du traitement. Une étude antérieure suggère que 30 μM BFA est une faible concentration qui peut déclencher la formation caractéristique du corps BFA sans provoquer l’effondrement de l’appareil de Golgi dans les méristoïdes20. De même, 25 μM Wm est une concentration faible mais efficace qui peut conférer la formation de corps Wm sans endommager gravement les méristoïdes. Lorsqu’un nouveau matériau (différentes espèces végétales, différentes parties de la plante, etc.) est traité, les concentrations des médicaments doivent être optimisées en conséquence. Deuxièmement, pour maintenir l’état physiologique des échantillons dans une mesure maximale pendant le traitement, les plantules sont maintenues partiellement intactes (en enlevant seulement les cotylédons) jusqu’à l’étape d’imagerie. Les vraies feuilles sont disséquées pour la préparation de la lame, et l’échantillon est imagé par la suite. Chaque échantillon doit être traité individuellement et la lame doit être fraîchement préparée pour l’imagerie. Enfin, l’imagerie z-stack et l’imagerie de séries chronologiques nécessitent un balayage laser répété de l’échantillon. Pour minimiser le risque de photoblanchiment et de phototoxicité sur les échantillons, une faible puissance laser est fortement recommandée.

La grande efficacité des événements de trafic membranaire est assurée par la diversité des itinéraires de trafic et leur cinétique en réponse aux conditions spécifiques de développement et d’environnement de la cellule1. Les méthodes décrites ont une résolution spatio-temporelle limitée, de sorte que des techniques de microscopie optique plus sophistiquées émergent pour acquérir une connaissance détaillée du trafic membranaire dans une cellule eucaryote. Par exemple, la microscopie à superrésolution, y compris la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie de localisation photoactivée (PALM), augmente considérablement la résolution spatiale d’une protéine marquée par fluorescence31,32, bien que seuls des échantillons fixes puissent être analysés; La microscopie à disque rotatif accélère considérablement la vitesse de balayage et réduit le photoblanchiment des échantillons33, bien qu’il soit difficile d’enregistrer la dynamique des protéines à faible abondance en utilisant cette méthode; la microscopie à feuille de lumière fournit une imagerie 3D rapide et douce34,35; et la microscopie à deux photons permet la détection de signaux de fluorescence provenant de tissus plus profonds35,36, mais au prix d’une résolution légèrement inférieure, etc. En outre, la biologie chimique a identifié des drogues plus spécifiques interférant avec certains itinéraires de trafic. Malgré les limites, ces techniques ainsi que d’autres techniques avancées émergentes amélioreront considérablement nos connaissances et feront la lumière sur les mécanismes du système de trafic de la membrane cellulaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) et le prix de la Fondation Bronson (H.Z.) de l’Université de l’Arkansas pour les sciences médicales (UAMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

Biologie numéro 195
Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter