Summary
원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
진핵 세포에서 단백질과 지질을 포함한 막 구성 요소는 내막 시스템 내에서 시공간적으로 목적지로 운반됩니다. 여기에는 새로 합성된 단백질을 세포 표면 또는 세포 외부로 분비 수송하는 것, 세포외 화물 또는 원형질막 성분을 세포로 세포내로 운반하는 것, 세포내 소기관 사이에서 화물을 재활용하거나 이동하는 것 등이 포함됩니다. 막 밀매 사건은 모든 진핵 세포의 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격한 규제를 받고 있습니다. 세포외 공간에서 리간드 신호를 감지하는 세포 표면 수용체 키나아제는 분비 및 세포내 수송을 모두 거칩니다. 원형질막-국소화된 류신-풍부한-반복 수용체 키나아제, ERL1을 사용하여 막 트래피킹 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법이 여기에 기재되어 있다. 접근 방식에는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정이 포함됩니다. ERL1의 시공간 조절을 모니터링하기 위해 이 연구에서는 ERL1과 다소포체 마커 단백질인 RFP-Ara7 사이의 공동 국소화 분석, 이 두 단백질의 시계열 분석, 막 밀매 억제제 brefeldin A 및 wortmannin으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 분석에 대해 설명합니다.
Introduction
막 이동(Membrane traffic)은 단백질, 지질 및 기타 생물학적 산물을 포함한 막 구성 요소(화물이라고도 함)를 진핵 세포 내의 서로 다른 세포 기관 사이 또는 원형질막을 가로질러 세포외 공간으로 또는 세포외 공간으로 분배하는 보존된 세포 과정입니다1. 이 과정은 핵막, 소포체, 골지체, 액포/리소좀, 원형질막 및 다중 엔도솜으로 구성된 내막 시스템(endomembrane system)이라는 막과 세포 기관의 집합체에 의해 촉진된다1. 내막 시스템은 이러한 세포 기관 사이를 왕복하는 동적 소포를 사용하여 막 구성 요소의 수정, 포장 및 운송을 가능하게 합니다. 세포막 밀매 현상은 세포 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격하고 복잡한 규제를 받고 있습니다2. 현재, 분자 생물학, 화학 생물학, 현미경 및 질량 분석법의 여러 접근법이 개발되어 막 이동 분야에 적용되었으며 내막 시스템 3,4의 시공간 조절에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 분자 생물학은 관심 단백질의 유전자 발현을 변경하거나 관심 단백질에 특정 태그를 표시하는 것과 같이 막 이동에 관여하는 것으로 추정되는 플레이어의 고전적인 유전자 조작에 사용됩니다. 화학 생물학의 도구에는 특정 경로의 교통을 구체적으로 방해하는 분자의 사용이 포함됩니다 4,5. 질량 분석법은 생화학적 접근법 3,4에 의해 기계적으로 분리된 세포 기관의 구성 요소를 식별하는 데 강력합니다. 그러나 막 교통은 역동적이고 다양하며 복잡한 생물학적 과정이다1. 다양한 조건에서 살아있는 세포의 막 이동 과정을 시각화하기 위해서는 광학 현미경이 필수적인 도구입니다. 사건의 효율성, 동역학 및 다양성을 측정하는 문제를 극복하기 위해 첨단 현미경 기술이 지속적으로 발전해 왔습니다4. 여기에서 이 연구는 화학/약리학 생물학, 분자 생물학 및 현미경 검사에서 널리 채택된 방법론에 중점을 두어 자연적으로 단순화되고 실험적으로 접근 가능한 시스템인 기공 발달 과정에서 막 이동 사건을 연구합니다.
기공은 내부 세포와 환경사이의 가스 교환을 촉진하기 위해 열리고 닫히는 식물 공중 표면의 미세 기공입니다 6,7,8. 따라서 기공은 식물의 생존과 성장에 중요한 두 가지 사건인 광합성과 증산에 필수적입니다. 기공 발달은 주변 환경에 대한 식물의 적응을 최적화하기 위해 환경 신호에 의해 동적으로 조정된다9. 2002년 연구로 거슬러 올라가면, 수용체 단백질인 TMM(Too Many Mouths)의 식별은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana10에서 기공 발달의 분자 메커니즘을 조사하는 새로운 시대의 문을 열었습니다. 불과 수십 년 후, 고전적인 신호 전달 경로가 확인되었습니다. 상류에서 하류로, 이 경로는 표피 패턴 인자 (EFP) 패밀리의 분비 펩티드 리간드 그룹, EREECTA (ER) 패밀리의 여러 세포 표면 류신 풍부 반복 (LRR) 수용체 키나아제, LRR 수용체 단백질 TMM, MAPK 캐스케이드 및 SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA 및 SCREAM (SCRM)을 포함한 여러 bHLH 전사 인자를 포함합니다11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. 이전 연구는 수용체 키나아제 중 하나인 ER-LIKE 1(ERL1)이 EPF 인식 시 활성 세포내 행동을 나타낸다는 것을 나타냅니다 20. ERL2는 또한 원형질막과 일부 세포내 소기관 사이를 동적으로 이동한다27. 막 트래피킹 단계를 차단하는 것은 비정상적인 기공 패터닝을 일으켜 잎 표면에 기공 클러스터를 생성한다(28). 이러한 결과는 막 교통량이 기공 발달에 필수적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 일부 막 이동 억제제를 사용한 약리학적 치료와 결합된 단백질-단백질 세포 내 공동 국소화 분석을 사용하여 ERL1 역학을 시공간적으로 조사하는 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 용액 준비
- 표백제 15mL와 증류수 35mL 및 Triton X-100 50μL를 혼합하여 종자 살균 용액을 준비합니다.
- BFA 분말을 에탄올에 용해시켜 브레펠딘 A(BFA) 용액을 최종 농도 10 mM(스톡)으로 제조한다. Wm 분말을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM(stock)이 되도록 맥아즙만닌(Wm) 용액을 제조한다.
2. 씨앗 파종
- 필요한 형질전환 식물 각각에서 10-50개의 종자를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 종자 멸균 용액 1mL를 넣고 셰이커에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 완전히 혼합합니다.
- 종자 살균 용액을 버리고 1mL의 오토클레이브 증류수로 종자를 5회 세척합니다.
- 오토클레이브 증류수 300μL를 각 튜브에 넣고 1%(w/v) 자당과 0.75%(w/v) 한천을 포함하는 절반 강도 MS 배지에 종자를 뿌립니다. 필요에 따라 해당 항생제로 배지를 보충하십시오.
- 플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 2일 동안 거꾸로 보관하여 발아를 동기화합니다.
- 2일 후, 플레이트를 22°C에서 16시간 라이트/8시간 다크 사이클(80μmol/m2/s1)로 성장실로 옮깁니다. 이것은 발아 후 첫날 (1 dpg)로 간주됩니다.
- 추가 성장을 위해 묘목을 10dpg의 토양에 이식하십시오.
3. 이중 착색 F1 형질전환 식물의 제조
- ERL1-YFP(식물 A)를 포함하는 동형접합 형질전환 식물과 RFP 표지 마커 단백질 RFP-Ara7(식물 B)20을 포함하는 동형접합 형질전환 식물을 16시간 조명/8시간 암주기(80μmol/m2/s1)로 성장실에서 개화할 때까지 나란히 성장시킵니다.
- 식물 A에서 어린 꽃차례를 선택하십시오. 유전 적 십자가를 위해 꽃차례에 막 열려는 꽃 한 송이를 유지하십시오. 오래된 꽃과 실리크를 모두 제거하십시오. 또한 미래의 혼란을 피하기 위해 어린 꽃과 꽃 분열 조직을 조심스럽게 제거하십시오.
- 한 쌍의 날카로운 핀셋을 사용하여 꽃받침, 꽃잎, 수술을 제거하여 개봉하지 않은 꽃을 부드럽게 해부합니다. 꽃차례에 암술을 남겨 두십시오.
- 식물 B의 열린 꽃에서 성숙한 수술을 취하고 식물 A의 해부 된 암술의 암술머리에 꽃가루 알갱이를 놓습니다.
- 이 수동으로 교차 된 꽃은 아버지, 어머니 및 유전 적 십자가의 날짜를 표시하여 레이블을 지정합니다. 꽃을 성숙시키고 실리크가 노란색 / 갈색으로 변할 때 F1 씨앗을 수확합니다 (십자가 후 ~ 20 일). YFP 및 RFP 신호가 모두 있는 성공적인 F1 플랜트를 확인합니다.
4. 약리학 적 치료
- BFA 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 모의 용액 (0.3 % 에탄올) 또는 30 μM BFA 용액에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.
- 맥아즙 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 0.25 % DMSO 용액 또는 25 mM 맥아 즙 만닌에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 이미징하기 전에 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.
- 샘플의 진공 처리를 위해 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 해당 약물 용액 500μL를 넣고 해부된 묘목을 용액에 담그십시오. 10mL 주사기를 미세 원심분리기 튜브에 단단히 부착하고 1분 동안 진공을 적용합니다(그림 1). 주사기를 제거하고 필요한 시간 동안 용액에 샘플을 보관하십시오. 이미징 준비를 위해 묘목을 부드럽게 꺼냅니다.
그림 1: 간단한 진공 장치. 진공 처리를 위해 10mL 주사기를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 부착합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 이미징을 위한 샘플 준비
- 날카로운 면도날을 사용하여 처리 된 샘플에서 실제 잎을 해부하십시오. 유리 슬라이드의 물 한 방울에 진정한 잎을 부드럽게 넣고 축 방향면을 위로 유지하십시오. 거품이 끼지 않도록 덮개 슬립으로 실제 잎을 천천히 덮으십시오.
6. 컨포칼 이미징
참고: 라이카 SP8 도립 주사 컨포칼 현미경을 사용하여 이 작업에서 샘플의 형광 신호를 이미지화했습니다.
- 빔 경로 설정
- YFP 여기를 위한 514nm 레이저를 선택합니다. 높은 레이저 출력을 사용하여 신호 강도를 높여 높은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 그러나 5% 이상의 레이저 출력은 광표백의 위험이 있으며 샘플의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 샘플 신호가 너무 어둡지 않으면 낮은 레이저 강도에서 시작합니다.
- 검출을 위해 PMT/HyD를 켜고 YFP 형광단의 스펙트럼을 기반으로 방출 대역 상한 및 하한 임계값을 정의합니다. YFP 신호를 수집하기 위해 530-570nm의 감지 창을 설정합니다.
- 두 번째 색상에 대한 순차 이미징: Seq 버튼을 클릭하고 새 채널을 추가합니다. 기본적으로 이전에 설계된 YFP 빔 경로는 Seq 1입니다. Seq 2에서 RFP 여기용 561nm 레이저를 선택하고 RFP 신호를 수집하기 위해 570-630nm의 검출 창을 설정합니다.
- 스캔 조건 설정(그림 2)
- 기공 전구체 세포 내의 세포내 막 트래픽 활동을 이미지화하려면 이미징을 위해 시스템에서 63x/1.2W Corr 렌즈를 선택하십시오.
- 형식은 픽셀 단위의 이미지 크기를 나타냅니다. 1,024 픽셀 x 1,024 픽셀로 시작한 다음 확대/축소 비율과 목표 설정을 기반으로 최적화하여 게시 품질의 좋은 해상도를 제공합니다.
- 속도는 레이저가 각 픽셀을 통과할 때 스캔헤드의 속도를 나타냅니다. 스캔 속도가 느리면 신호 대 잡음비가 향상되는 경우가 많지만 빠르게 변화하는 멤브레인 트래피킹 이벤트를 효율적으로 캡처하지 못할 수 있습니다. 400Hz의 속도로 시작하여 샘플의 특정 상황에 따라 이를 최적화합니다.
- 확대/축소 비율은 대물 렌즈를 변경하지 않고 관심 영역을 확대하는 데 사용됩니다. 확대/축소 계수 1로 시작하고 실험의 특정 요구 사항에 따라 최적화합니다.
- 라인 평균은 평균 결과를 얻기 위해 각 X-라인을 스캔하는 횟수를 나타냅니다. 라인 평균이 클수록 결과 이미지의 노이즈가 줄어들지만 스캔 시간과 레이저 광에 대한 노출 시간도 늘어납니다. 멤브레인 트래피킹 이벤트를 이미지화하려면 높은 라인 평균을 사용하지 마십시오. 2x 라인 평균으로 시작하여 필요에 따라 최적화합니다.
- 시계열 수집
참고: 막 트래피킹 사건을 연구할 때 세포내 엔도솜의 빠른 움직임을 기록하기 위해 시계열이 필요한 경우가 많습니다.- 획득 모드에서 xyt 스캔 모드를 선택하여 시계열 유틸리티를 활성화합니다.
- 시간 간격에서 시점 사이의 대기 기간을 결정합니다. 또는 최소화를 클릭하여 이미지를 차례로 즉시 촬영합니다. 7초의 시간 간격이 다음 시계열 실험에 사용되었습니다.
- 기간을 선택하고 실험을 실행할 총 시간을 입력합니다. 또는 Frames(프레임)를 선택하여 수집할 프레임 수를 정의합니다(그림 3).
- 전체 세포 내의 멤브레인 트래피킹 이벤트에 대한 3차원 정보를 수집하려면 Z-스택 스캔 모드를 사용합니다. Z 스택 이미지의 최대 강도 투영은 종종 분석에 사용됩니다.
- 획득 모드에서 xyz 스캔 모드를 선택하면 Z-Stack 유틸리티에 액세스할 수 있습니다.
- Z 와이드 옵션을 선택합니다. Scan Mode(스캔 모드)에서 Begin(시작) 및 End(종료) 버튼을 사용하여 Z 스택의 상단 이미지와 하단 이미지를 정의합니다.
- z-스텝 크기를 클릭하여 z-스텝의 두께를 정의합니다. 또는 Z 스택의 전체 범위를 커버하기 위해 촬영할 이미지 수를 정의합니다. 샘플 간의 일관성을 보장하려면 z-스텝 크기를 정의합니다(그림 4).
- 이미지 처리
- z-스택 이미지의 최대 강도 투영은 컨포칼 소프트웨어(http://www.leica-microsystems.com)에 의해 생성됩니다. 기본 프로세스(Primary Process) 탭에서 맨 왼쪽의 프로젝트 열기(Open Projects) 탭 아래에서 관심 있는 z-stack 파일을 먼저 선택합니다. 그런 다음 Process Tools라는 중간 탭으로 전환하고 투영 기능을 선택한 다음 방법 드롭다운 패널에서 최대를 선택하고 적용 버튼을 클릭합니다. z-stack 프로젝션 이미지는 Open Projects 탭 아래에 생성됩니다.
- 시계열 영상의 영상은 피지(https://imagej.net/Fiji)에 의해 생성된다. 파일 탭에서 열기 함수를 사용하여 모든 시계열 이미지를 올바른 순서로 엽니다. [Image ] 탭에서 [ Stack ] 함수를 찾고 [Images to stack ]을 선택하여 비디오를 생성합니다. 원하는 프레임 속도( 비디오 1의 경우 5프레임/초)로 .avi 형식으로 파일을 저장합니다.
그림 2: XY 치수의 스캔 모드 패널 스캔 모드 패널은 이미지 스캔 조건을 설정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: xyt 스캔 모드의 시계열 유틸리티. 시계열 유틸리티는 일련의 이미지를 연속적으로 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: xyz 스캔 모드의 z-stack 유틸리티 z-stack 유틸리티는 z축에서 일련의 이미지를 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
이전 연구에서는 ERL1이 동적 막 트래피킹 사건을 겪는 활성 수용체 키나아제임을 나타냈다20. ERL1은 원형질막의 막횡단 LRR-수용체 키나아제입니다. 소포체에서 새로 합성된 ERL1은 골지체에서 처리되어 원형질막으로 추가로 운반됩니다. 원형질막 상의 ERL1 분자는 그의 세포외 LRR 도메인18을 사용하여 EPF 리간드를 인지할 수 있다. EPF1을 포함한 억제성 EPF에 의해 활성화되면 ERL1은 엔도솜으로 내재화되고 다소포체(MVB)로 운반된 다음 분해를 위해 액포로 운반되어 신호를 종료합니다(20). 대조적으로, 기공 형성을 촉진하는 길항적 EPFL9 리간드(14)는 소포체에 ERL1을 보유한다. 대안적으로, 원형질막-국소화된 ERL1은 엔도솜과 원형질막(20) 사이에서 재순환할 수 있다.
여기서, ERL1 프로모터::ERL1-YFP 를 함유하는 형질전환 식물은 위에서 언급한 프로토콜에 따라 7일 동안 성장하였다. 막 나왔을 때, ERL1 은 어린 잎의 기공 계통 세포에서만 발현되기 때문에 이미징을 위해 실제 잎을 해부했습니다20. 예상한 바와 같이, 산란된 세포는 YFP 신호에 의해 강조되었고, 여기서 ERL1-YFP는 원형질막을 표지하였다(도 5). 또한, 다중 점상 신호도 관찰되었으며, 이는 ERL1이 엔도솜에도 국한되었음을 시사합니다.
식물 세포의 여러 세포 소기관은 trans-Golgi 네트워크 및 MVB와 같이 광학 현미경으로 관찰할 때 점상 형광 신호로 존재합니다. RFP-Ara7 을 함유한 MVB 마커 라인이 ERL1-YFP 형질전환 라인과 유전적으로 교차되었을 때, 두 마커 단백질은 상기와 같은 순차적 이미징 접근법을 사용하여 관찰되었습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 RFP-Ara7은 거의 모든 셀에서 여러 개의 점점 신호를 강조 표시하여 이러한 셀의 MVB를 나타냅니다(그림 6B). ERL1-YFP 신호와 병합할 때 대부분의 ERL1-YFP 양성 점액은 RFP-Ara7 표지 점액과 겹쳤습니다. 이 결과는 ERL1-YFP 분자 중 일부가 MVB로 운반됨을 시사합니다.
빠르게 움직이는 엔도솜의 역학을 모니터링하기 위해 ERL1-YFP 및 RFP-Ara7 이 있는 7일 된 실제 잎의 시계열 이미지를 수집했습니다(그림 7). 203초 동안 7초의 시간 간격을 적용하고, 수집된 30개의 이미지를 사용하여 이미지 J(비디오 1)에서 비디오를 생성했습니다. 비디오는 ERL1-YFP 표지 엔도솜이 기공 계통 세포 내에서 RFP-Ara7과 함께 이동하여 ERL1-YFP가 MVB에 국한되었음을 확인했습니다.
약리학적 접근을 사용하여 ERL1 밀매 경로를 조사하기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 막 밀매 약물인 브레펠딘 A(BFA)와 워트마닌(Wm)의 효과를 분석했습니다. BFA는 ADP-리보실화 인자인 구아닌-GNOM을 포함한 뉴클레오티드 교환 인자를 억제함으로써 막 단백질의 엔도솜 재활용 및 엔도사이토시스를 차단할 수 있다29. BFA 용액에 30분 동안 노출된 후 BFA 본체로 알려진 일부 큰 구획에서 ERL1-YFP가 검출되었습니다(그림 8B, C). 이는 ERL1 트래피킹이 BFA에 의해 차단될 수 있음을 나타내며, 이는 ERL1이 재활용 또는 엔도사이토시스를 겪는다는 것을 시사합니다. Wm은 포스파티딜이노시톨-3 및 포스파티딜이노시톨-4 키나아제를 억제할 수 있으며, 따라서 MVB5의 융합을 일으킨다. 30분 동안 Wm으로 처리했을 때 ERL1-YFP로 강조된 일부 고리 모양의 구조가 관찰되었으며, 이는 일반적으로 Wm 본체라고 합니다(그림 8C). 이 결과는 ERL1-YFP가 MVB로 운반됨을 나타내며, 따라서 ERL1이 분해를 위해 액포로의 경로를 따른다는 것을 시사합니다.
그림 5: ERL1-YFP의 단일 평면 이미지. (A) 형광 이미지, (B) 명시야 이미지 및 (C) 병합된 이미지는 ERL1-YFP가 원형질막과 기공 계통 세포 내에서 이동성이 높은 점점을 라벨링한다는 것을 보여줍니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: ERL1-YFP 및 RFP-Ara7의 순차 이미지. (A) ERL1-YFP와 (B) RFP-Ara7은 모두 셀 내에서 점액 신호에 라벨을 붙입니다. (C) 병합된 이미지 및 (D) 삽입 이미지의 흰색 점액은 두 단백질이 기공 계통 세포 내의 MVB에 공동 국소화됨을 나타냅니다. 흰색 화살표는 ERL1-YFP와 RFP-Ara7 모두에 의해 표지된 엔도솜을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 RFP-Ara7로 표지된 엔도솜을 나타냅니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: ERL1-YFP 및 RFP-Ara7의 시계열 이미지. 이미지는 7초 간격으로 촬영되었습니다. 각 이미지의 시점은 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: ERL1-YFP의 Z-스택 이미지. (A, B) (A) 모의 또는 (B) BFA로 처리된 ERL1-YFP 식물의 Z-스택 이미지. 오른쪽 상단 모서리에 있는 숫자는 z-스택에서 이미지의 위치를 위에서 아래로 나타냅니다. 스케일 바: 10μm. (C) 오른쪽 상단 모서리에 표시된 대로 모의 또는 BFA 용액 및 모의 또는 Wm 용액으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 이미지 투영. 화살표는 약물에 의한 ERL1-YFP의 응집체를 나타낸다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: ERL1-YFP 및 RFP-Ara7의 시계열 이미지 비디오. ERL1-YFP와 RFP-Ara7의 시계열 영상은 Fiji를 사용하여 5 frames/s의 속도로 영상으로 쌓입니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
내막 시스템은 진핵 세포의 세포질을 서로 다른 구획으로 분리하여 이러한 세포 기관의 특수한 생물학적 기능을 가능하게 합니다. 화물 단백질과 거대분자를 적시에 최종 목적지로 전달하기 위해 수많은 소포가 이러한 세포 기관 사이를 왕복하도록 안내됩니다. 고도로 조절된 막 밀매 사건은 세포의 생존력, 발달 및 성장에 근본적인 역할을 합니다. 이 중요하고 복잡한 과정을 조절하는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.
여기에서는 막 단백질의 세포 내 국소화를 관찰하고, 서로 다른 형광 단백질로 태그된 두 막 단백질 간의 공동 국소화를 분석하고, 시계열 이미지를 사용하여 막 단백질의 동적 이동을 모니터링하고, 전체 세포를 덮는 z-스택 이미징을 수행하여 막 단백질에 대한 3D 정보를 수집하기 위한 몇 가지 접근 방식을 설명했습니다. 여기에 설명된 막 밀매 사건 외에도 이러한 접근 방식은 다른 생물학적 과정에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 시계열 이미징은 발달 과정(30)을 모니터링하기 위해 장기간(수일)에 걸쳐 수행될 수 있다. z-스택 이미징은 세포(30) 내의 단백질의 풍부도를 정량화하기 위해 수행될 수 있다. 또한 이러한 이미징 접근법은 다양한 약물, 호르몬 및 환경 신호를 포함한 약리학적 응용 분야와 완벽하게 결합될 수 있으며, 이는 이러한 이미징 접근법이 살아있는 생물학적 샘플에 쉽게 적용할 수 있음을 나타냅니다. 시료 처리의 유연성 외에도 여기에 설명된 방법은 컨포칼 현미경을 제외하고 경제적으로 저렴한 장치만 필요하고 기술 능력에 대한 직원의 가벼운 교육만 필요하므로 이러한 방법이 널리 채택될 수 있습니다.
프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에서 주의가 필요합니다. 첫째, 막 밀매 약물의 최적 농도는 재료 및 치료에 따라 다릅니다. 이전 연구에서는 30μM BFA가 분열조직(20)에서 골지체의 붕괴를 일으키지 않으면서 특징적인 BFA체 형성을 유발할 수 있는 낮은 농도임을 시사한다. 마찬가지로, 25μM Wm은 분열조직을 심각하게 손상시키지 않으면서 Wm 체형성을 부여할 수 있는 낮지만 효과적인 농도입니다. 새로운 물질(다른 식물 종, 식물의 다른 부분 등)을 처리할 때 그에 따라 약물의 농도를 최적화해야 합니다. 둘째, 처리 동안 샘플의 생리적 상태를 최대한 유지하기 위해 묘목은 이미징 단계까지 부분적으로 손상되지 않은 상태로 유지됩니다(자엽만 제거). 슬라이드 준비를 위해 실제 잎을 해부하고 나중에 샘플을 이미지화합니다. 각 샘플은 개별적으로 처리해야 하며 이미징을 위해 슬라이드를 새로 만들어야 합니다. 마지막으로, z-stack 이미징과 시계열 이미징 모두 샘플의 반복적인 레이저 스캐닝이 필요합니다. 샘플에 대한 광표백 및 광독성의 위험을 최소화하려면 낮은 레이저 출력을 사용하는 것이 좋습니다.
멤브레인 밀매 사건의 높은 효율성은 세포의 특정 발달 및 환경 조건에 대한 반응으로 인신 매매 경로와 그 동역학의 다양성에 의해 보장된다1. 설명된 방법은 시공간 해상도가 제한되어 있으므로 진핵 세포 내의 막 이동에 대한 자세한 지식을 얻기 위해 보다 정교한 광학 현미경 기술이 등장하고 있습니다. 예를 들어, 확률적 광학 재구성 현미경(STORM) 및 광활성화 국소화 현미경(PALM)을 포함하는 초해상도 현미경은 형광 태그가 부착된 단백질(31,32)의 공간 분해능을 크게 증가시키지만, 고정된 샘플만 분석할 수 있습니다. 스피닝 디스크 현미경은 스캐닝 속도를 실질적으로 가속화하고 샘플(33)의 광표백을 감소시키지만, 이 방법을 사용하여 낮은 존재비로 단백질의 역학을 기록하는 것은 어렵습니다. 광시트 현미경은 빠르고 부드러운 3D 이미징을 제공합니다34,35; 그리고 이광자 현미경은 더 깊은 조직(35,36)에서 형광 신호를 검출할 수 있지만 약간 낮은 해상도 등을 희생합니다. 또한 화학 생물학은 특정 인신 매매 경로를 방해하는보다 구체적인 약물을 확인했습니다. 한계에도 불구하고 이러한 기술은 다른 새로운 첨단 기술과 함께 우리의 지식을 크게 향상시키고 세포막 밀매 시스템의 메커니즘에 대해 밝힐 것입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 National Science Foundation(IOS-2217757)(XQ)과 University of Arkansas for Medical Sciences(UAMS) Bronson Foundation Award(H.Z.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
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| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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