Summary
Diversi metodi comunemente usati sono introdotti qui per studiare gli eventi di traffico di membrana di una chinasi del recettore della membrana plasmatica. Questo manoscritto descrive protocolli dettagliati tra cui la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale.
Abstract
Nelle cellule eucariotiche, i componenti della membrana, comprese le proteine e i lipidi, vengono trasportati spaziotemporalmente a destinazione all'interno del sistema endomembrana. Ciò include il trasporto secretorio di proteine di nuova sintesi sulla superficie cellulare o all'esterno della cellula, il trasporto endocitico di carichi extracellulari o componenti della membrana plasmatica nella cellula e il riciclaggio o il trasporto di carichi tra gli organelli subcellulari, ecc. Gli eventi di traffico di membrana sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l'adattamento ambientale di tutte le cellule eucariotiche e, quindi, sono sottoposti a una regolamentazione rigorosa. Le chinasi recettoriali della superficie cellulare, che percepiscono i segnali del ligando dallo spazio extracellulare, subiscono sia il trasporto secretorio che quello endocitico. Gli approcci comunemente usati per studiare gli eventi di traffico di membrana utilizzando una chinasi recettoriale ricca di ripetizione leucina localizzata nella membrana plasmatica, ERL1, sono descritti qui. Gli approcci includono la preparazione del materiale vegetale, il trattamento farmacologico e la configurazione dell'imaging confocale. Per monitorare la regolazione spaziotemporale di ERL1, questo studio descrive l'analisi di co-localizzazione tra ERL1 e una proteina marcatrice del corpo multi-vescicolare, RFP-Ara7, l'analisi delle serie temporali di queste due proteine e l'analisi z-stack di ERL1-YFP trattata con gli inibitori del traffico di membrana brefeldina A e wortmannin.
Introduction
Il traffico di membrana è un processo cellulare conservato che distribuisce componenti di membrana (noti anche come carichi), tra cui proteine, lipidi e altri prodotti biologici, tra diversi organelli all'interno di una cellula eucariotica o attraverso la membrana plasmatica da e verso lo spazio extracellulare1. Questo processo è facilitato da un insieme di membrane e organelli chiamati sistema endomembrana, che consiste nella membrana nucleare, nel reticolo endoplasmatico, nell'apparato di Golgi, nel vacuolo / lisosomi, nella membrana plasmatica e negli endosomi multipli1. Il sistema endomembrana consente la modifica, il confezionamento e il trasporto dei componenti della membrana utilizzando vescicole dinamiche che fanno la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrane sono cruciali per lo sviluppo, la crescita e l'adattamento ambientale delle cellule e, pertanto, sono soggetti a una regolamentazione rigorosa e complessa2. Attualmente, molteplici approcci in biologia molecolare, biologia chimica, microscopia e spettrometria di massa sono stati sviluppati e applicati al campo del traffico di membrana e hanno notevolmente migliorato la comprensione della regolazione spaziotemporale del sistema endomembrana 3,4. La biologia molecolare viene utilizzata per le classiche manipolazioni genetiche dei presunti attori coinvolti nel traffico di membrana, come alterare l'espressione genica della proteina di interesse o etichettare la proteina di interesse con determinati tag. Gli strumenti di biologia chimica includono l'uso di molecole che interferiscono specificamente con il traffico di determinate rotte 4,5. La spettrometria di massa è potente per identificare i componenti in un organello che è stato isolato meccanicamente con approcci biochimici 3,4. Tuttavia, il traffico di membrana è un processo biologico dinamico, diversificato e complesso1. Per visualizzare il processo di traffico di membrana in cellule vive in varie condizioni, la microscopia ottica è uno strumento essenziale. Sono stati fatti continui progressi nelle tecniche avanzate di microscopio per superare le sfide nella misurazione dell'efficienza, della cinetica e della diversità degli eventi4. Qui, questo studio si concentra sulle metodologie ampiamente adottate in biologia chimica / farmacologica, biologia molecolare e microscopia per studiare gli eventi di traffico di membrana in un sistema naturalmente semplificato e sperimentalmente accessibile, il processo di sviluppo stomatico.
Gli stomi sono micropori sulle superfici aeree delle piante che si aprono e si chiudono per facilitare lo scambio di gas tra le cellule interne e l'ambiente 6,7,8. Quindi, gli stomi sono essenziali per la fotosintesi e la traspirazione, due eventi cruciali per la sopravvivenza e la crescita delle piante. Lo sviluppo stomatico viene regolato dinamicamente da segnali ambientali per ottimizzare l'adattamento della pianta all'ambiente circostante9. Risalente a studi nel 2002, l'identificazione della proteina recettore Too Many Mouths (TMM) ha aperto le porte a una nuova era di studio dei meccanismi molecolari dello sviluppo stomatico nella pianta modello Arabidopsis thaliana10. Dopo pochi decenni, è stata identificata una via di segnalazione classica. Da monte a valle, questa via include un gruppo di ligandi peptidici secretori nella famiglia dei fattori di pattern epidermico (EFP), diverse chinasi del recettore LRR (leucine-rich-repeat) della superficie cellulare nella famiglia EREECTA (ER), la proteina del recettore LRR TMM, una cascata MAPK e diversi fattori di trascrizione bHLH tra cui SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA e SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Lavori precedenti indicano che una delle chinasi recettoriali, ER-LIKE 1 (ERL1), dimostra comportamenti subcellulari attivi sulla percezione di EPF20. ERL2 traffica anche dinamicamente tra la membrana plasmatica e alcuni organelli intracellulari27. Il blocco delle fasi di traffico della membrana provoca un pattern stomatico anomalo, con conseguente ammasso stomatico sulla superficie fogliare28. Questi risultati suggeriscono che il traffico di membrana svolge un ruolo essenziale nello sviluppo stomatico. Questo studio descrive un protocollo per studiare spaziotemporalmente le dinamiche ERL1 utilizzando l'analisi di co-localizzazione subcellulare proteina-proteina combinata con un trattamento farmacologico utilizzando alcuni inibitori del traffico di membrana.
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Protocol
1. Preparazione delle soluzioni
- Preparare la soluzione di sterilizzazione dei semi mescolando 15 ml di candeggina con 35 ml di acqua distillata e 50 μL di Triton X-100.
- Preparare la soluzione di brefeldina A (BFA) sciogliendo la polvere di BFA in etanolo fino a una concentrazione finale di 10 mM (stock). Preparare la soluzione di wortmannin (Wm) sciogliendo la polvere di Wm in DMSO ad una concentrazione finale di 10 mM (stock).
2. Semina i semi
- Aliquote 10-50 semi da ciascuna delle piante transgeniche necessarie in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 mL di soluzione di sterilizzazione dei semi in ogni tubo e mescolare accuratamente capovolgendo delicatamente il tubo per 10 minuti su uno shaker.
- Scartare la soluzione di sterilizzazione dei semi e lavare i semi con 1 ml di acqua distillata autoclavata cinque volte.
- Aggiungere 300 μL di acqua distillata autoclavata in ciascuna provetta e seminare i semi su terreni MS a metà forza contenenti 1% (p/v) di saccarosio e 0,75% (p/v) di agar. Integrare il mezzo con gli antibiotici corrispondenti, se necessario.
- Tenere la piastra capovolta a 4 °C al buio per 2 giorni per sincronizzare la germinazione.
- Dopo 2 giorni, trasferire la piastra in una camera di crescita con un ciclo di luce di 16 ore / buio di 8 ore (80 μmol/m2/s1) a 22 °C. Questo è considerato il primo giorno dopo la germinazione (1 dpg).
- Trapiantare le piantine nel terreno a 10 dpg per un'ulteriore crescita.
3. Preparazione di piante transgeniche F1 bicolore
- Coltivare piante transgeniche omozigoti portatrici di ERL1-YFP (pianta A) e piante transgeniche omozigoti portatrici di una proteina marcatrice RFP-Ara7 (pianta B)20 marcata con RFP fianco a fianco fino alla fioritura in una stanza di crescita con un ciclo di luce di 16 ore / 8 ore di buio (80 μmol / m2 / s1) a 22 ° C.
- Scegli una giovane infiorescenza dalla pianta A. Tieni un fiore che sta per aprirsi sull'infiorescenza per le croci genetiche. Rimuovere tutti i fiori e le siliques più vecchi. Inoltre, rimuovere con cura i fiori più giovani e i meristemi floreali per evitare confusione futura.
- Sezionare delicatamente il fiore non aperto rimuovendo i sepali, i petali e lo stame usando un paio di pinzette affilate. Lascia solo il pistillo sull'infiorescenza.
- Prendi uno stame maturo da un fiore aperto sulla pianta B e deposita i grani di polline sullo stigma del pistillo sezionato sulla pianta A.
- Etichetta questo fiore incrociato manualmente indicando suo padre, sua madre e la data dell'incrocio genetico. Lascia maturare il fiore e raccogli i semi F1 quando la silique diventa gialla / marrone (~ 20 giorni dopo la croce). Verifica la presenza di un impianto F1 di successo con segnali YFP e RFP.
4. Trattamento farmacologico
- Per il trattamento BFA, rimuovere i cotiledoni delle piantine di 7 giorni, immergere il resto delle piantine in una soluzione fittizia (etanolo allo 0,3%) o in una soluzione di BFA da 30 μM, applicare il vuoto per 1 minuto e mantenere il campione immerso per 30 minuti prima dell'imaging.
- Per il trattamento con wortmannin, rimuovere i cotiledoni delle piantine di 7 giorni, immergere il resto delle piantine in una soluzione DMSO allo 0,25% o in una mostomannina da 25 mM, applicare il vuoto per 1 minuto e mantenere il campione immerso per 30 minuti prima dell'imaging.
- Per il trattamento sottovuoto dei campioni, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 500 μL della soluzione farmacologica corrispondente e immergere le piantine sezionate nella soluzione. Collegare saldamente una siringa da 10 mL alla provetta della microcentrifuga e applicare il vuoto per 1 minuto (Figura 1). Rimuovere la siringa e conservare il campione nella soluzione per il tempo richiesto. Estrarre delicatamente le piantine per la preparazione dell'imaging.
Figura 1: Dispositivo di vuoto semplice. Una siringa da 10 ml è collegata a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per il trattamento sotto vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
5. Preparazione del campione per l'imaging
- Sezionare la vera foglia dal campione trattato usando una lama di rasoio affilata. Metti delicatamente la foglia vera in una goccia d'acqua su un vetrino e mantieni il lato abassiale verso l'alto. Coprire lentamente la foglia vera con un coprivetrino evitando di intrappolare eventuali bolle.
6. Imaging confocale
NOTA: Un microscopio confocale a scansione invertita Leica SP8 è stato utilizzato per visualizzare il segnale di fluorescenza dei campioni in questo lavoro.
- Impostazione del percorso del fascio
- Selezionare un laser a 514 nm per l'eccitazione YFP. Utilizzare un'elevata potenza laser per aumentare l'intensità del segnale e, quindi, ottenere un'elevata qualità dell'immagine. Tuttavia, potenze laser superiori al 5% corrono il rischio di fotosbiancamento e la salute del campione può essere influenzata. Se il segnale del campione non è troppo debole, iniziare a bassa intensità laser.
- Attivare PMT/HyD per il rilevamento e definire le soglie della banda di emissione superiore e inferiore in base allo spettro per il fluoroforo YFP. Impostare una finestra di rilevamento di 530-570 nm per raccogliere il segnale YFP.
- Imaging sequenziale per il secondo colore: fai clic sul pulsante Seq e aggiungi un nuovo canale. Per impostazione predefinita, il percorso del fascio YFP progettato in precedenza sarà Seq 1. In Seq 2, selezionare un laser a 561 nm per l'eccitazione RFP e impostare una finestra di rilevamento di 570-630 nm per raccogliere il segnale RFP.
- Impostazione delle condizioni di scansione (Figura 2)
- Per visualizzare l'attività del traffico della membrana subcellulare all'interno delle cellule precursori stomatiche, scegliere una lente Corr 63x/1,2 W sul sistema per l'imaging.
- Il formato si riferisce alla dimensione dell'immagine in pixel. Inizia con 1.024 pixel x 1.024 pixel, quindi ottimizza questo in base al fattore di zoom e alle impostazioni dell'obiettivo per una buona risoluzione della qualità di pubblicazione.
- La velocità si riferisce alla velocità della testina di scansione mentre il laser passa su ciascun pixel. Sebbene le basse velocità di scansione spesso comportino un migliore rapporto segnale-rumore, potrebbero non catturare in modo efficiente gli eventi di traffico di membrane in rapida evoluzione. Inizia con una velocità di 400 Hz e ottimizzala in base alla situazione specifica dei campioni.
- Il fattore di zoom viene utilizzato per ingrandire una regione di interesse senza modificare l'obiettivo dell'obiettivo. Inizia con un fattore di zoom pari a 1 e ottimizzalo in base alle esigenze specifiche dell'esperimento.
- La media della linea si riferisce al numero di volte in cui ogni linea X verrà scansionata per ottenere un risultato medio. Una media di linea maggiore riduce il rumore nell'immagine risultante, ma aumenta anche il tempo di scansione e il tempo di esposizione alla luce laser. Per visualizzare gli eventi di traffico di membrana, non utilizzare una linea media alta. Inizia con una media di 2 righe e ottimizza secondo necessità.
- Raccolta di una serie temporale
NOTA: Quando si studiano gli eventi di traffico di membrana, è spesso necessaria una serie temporale per registrare il rapido movimento degli endosomi subcellulari.- Nella modalità di acquisizione, selezionare la modalità di scansione xyt per abilitare l'utilità Time Series.
- Decidi un periodo di attesa tra i punti temporali in Intervallo di tempo. In alternativa, fai clic su Riduci a icona per scattare immediatamente le immagini una dopo l'altra. Un intervallo di tempo di 7 s è stato utilizzato nel seguente esperimento di serie temporali.
- Seleziona Durata e immetti il tempo totale di esecuzione dell'esperimento. In alternativa, definite il numero di fotogrammi da raccogliere selezionando Fotogrammi (Figura 3).
- Per raccogliere le informazioni tridimensionali relative all'evento di traffico di membrana all'interno dell'intera cella, utilizzare la modalità di scansione Z-stack. La proiezione di massima intensità delle immagini Z-stack viene spesso utilizzata per l'analisi.
- Selezionare la modalità di scansione xyz nella modalità di acquisizione, quindi l'utilità Z-Stack diventerà accessibile.
- Selezionare l'opzione Z-wide . In modalità di scansione, definire l'immagine superiore e l'immagine inferiore dello stack Z utilizzando i pulsanti Inizio e Fine .
- Definite lo spessore dello z-step facendo clic su z-step size. In alternativa, definire quante immagini scattare per coprire l'intera gamma dello Z-stack. Per garantire la coerenza tra i campioni, definire la dimensione z-step (Figura 4).
- Elaborazione di immagini
- La proiezione di massima intensità delle immagini z-stack è generata dal software confocale (http://www.leica-microsystems.com). Nella scheda Processo principale, scegli innanzitutto il file z-stack interessato nella scheda Apri progetti all'estrema sinistra. Quindi, passare alla scheda centrale denominata Strumenti di processo, selezionare la funzione Proiezione , scegliere Massimo nel pannello a discesa di Metodo e fare clic sul pulsante Applica . Un'immagine di proiezione z-stack verrà generata nella scheda Apri progetti.
- Il video delle immagini della serie temporale è generato da Fiji (https://imagej.net/Fiji). Nella scheda File , utilizzare la funzione Apri per aprire tutte le immagini delle serie temporali nell'ordine corretto. Nella scheda Immagine , trova la funzione Stack e scegli Immagini da impilare per generare un video. Salvate il file nel formato .avi con la frequenza fotogrammi desiderata (5 fotogrammi/s per Video 1).
Figura 2: Il pannello della modalità di scansione della dimensione XY. Il pannello della modalità di scansione viene utilizzato per impostare le condizioni di scansione dell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'utilità Time Series in modalità di scansione xyt. L'utilità Time Series viene utilizzata per impostare le condizioni di imaging per raccogliere consecutivamente una serie di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: L'utilità z-stack in modalità di scansione xyz. L'utilità z-stack viene utilizzata per impostare le condizioni di imaging per raccogliere una serie di immagini sull'asse z. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Representative Results
Uno studio precedente ha indicato che ERL1 è una chinasi recettore attiva che subisce eventi di traffico dinamico di membrana20. ERL1 è una chinasi transmembrana del recettore LRR sulla membrana plasmatica. L'ERL1 appena sintetizzato nel reticolo endoplasmatico viene elaborato nei corpi del Golgi e ulteriormente trasportato alla membrana plasmatica. Le molecole ERL1 sulla membrana plasmatica possono percepire i ligandi EPF usando il loro dominio LRR extracellulare18. Dopo l'attivazione da parte degli EPF inibitori, incluso EPF1, ERL1 viene internalizzato negli endosomi, trasportato ai corpi multi-vescicolari (MVB) e quindi trasportato nei vacuoli per la degradazione per terminare il segnale20. Al contrario, il ligando antagonista EPFL9, che promuove la formazione stomatica14, trattiene ERL1 nel reticolo endoplasmatico. In alternativa, l'ERL1 localizzato sulla membrana plasmatica può riciclarsi tra gli endosomi e la membrana plasmatica20.
Qui, piante transgeniche con promotore ERL1: :ERL1-YFP sono state coltivate per 7 giorni seguendo il protocollo sopra menzionato. Quando è appena emersa, la vera foglia è stata sezionata per l'imaging, poiché ERL1 è espresso solo nelle cellule della linea stomatica nelle foglie giovani20. Come previsto, le cellule sparse sono state evidenziate dal segnale YFP, dove ERL1-YFP ha etichettato la membrana plasmatica (Figura 5). Inoltre, sono stati osservati anche più segnali puntati, suggerendo che ERL1 era anche localizzato negli endosomi.
Diversi organelli nelle cellule vegetali si presentano come segnali fluorescenti puntati quando osservati al microscopio ottico, come la rete trans-Golgi e gli MVB. Quando la linea marcatrice MVB contenente RFP-Ara7 è stata geneticamente incrociata con la linea transgenica ERL1-YFP , entrambe le proteine marcatrici sono state osservate utilizzando l'approccio di imaging sequenziale come descritto sopra. Come mostrato nella Figura 6, RFP-Ara7 ha evidenziato più segnali puntati in quasi tutte le celle, indicando gli MVB in queste celle (Figura 6B). Durante la fusione con il segnale ERL1-YFP, la maggior parte del punteggiato ERL1-YFP-positivo si sovrapponeva al puntato marcato RFP-Ara7. Questo risultato suggerisce che alcune delle molecole ERL1-YFP vengono trasportate agli MVB.
Per monitorare la dinamica di questi endosomi in rapido movimento, sono state raccolte immagini di serie temporali delle foglie vere di 7 giorni recanti ERL1-YFP e RFP-Ara7 (Figura 7). Sono stati applicati intervalli di tempo di 7 s per 203 s e le 30 immagini raccolte sono state utilizzate per generare un video nell'immagine J (video 1). Il video ha mostrato che gli endosomi marcati con ERL1-YFP si muovevano insieme a RFP-Ara7 all'interno delle cellule della linea stomatica, confermando così che ERL1-YFP era localizzato negli MVB.
Per esaminare le rotte di traffico ERL1 utilizzando un approccio farmacologico, è stato analizzato l'effetto di due farmaci comunemente usati per il traffico di membrana, brefeldina A (BFA) e wortmannin (Wm). Il BFA, inibendo i fattori di scambio guanina-nucleotide del fattore ADP-ribosilazione, incluso il GNOM, può bloccare il riciclaggio endosomico e l'endocitosi delle proteine di membrana29. Dopo 30 minuti di esposizione alla soluzione di BFA, ERL1-YFP è stato rilevato in alcuni grandi compartimenti noti come corpi BFA (Figura 8B, C). Ciò indica che il traffico di ERL1 può essere bloccato dal BFA, suggerendo che ERL1 subisce riciclaggio o endocitosi. Wm può inibire fosfatidilinositolo-3 e fosfatidilinositolo-4 chinasi e, quindi, provoca la fusione di MVB5. Quando trattati con Wm per 30 minuti, sono state osservate alcune strutture ad anello evidenziate da ERL1-YFP, che sono tipicamente chiamate corpi Wm (Figura 8C). Questo risultato indica che ERL1-YFP viene trasportato agli MVB, suggerendo così che ERL1 segue il percorso verso i vacuoli per la degradazione.
Figura 5: Immagine a piano singolo di ERL1-YFP. (A) L'immagine di fluorescenza, (B) l'immagine a campo chiaro e (C) l'immagine unita mostrano che ERL1-YFP etichetta la membrana plasmatica e alcuni punteggiati altamente mobili all'interno delle cellule della linea stomatica. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Immagini sequenziali di ERL1-YFP e RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP e (B) RFP-Ara7 etichettano entrambi i segnali puntati all'interno della cella. La punteggiatura bianca in (C) l'immagine unita e (D) l'immagine inserita indica che le due proteine co-localizzano sugli MVB all'interno delle cellule della linea stomatica. Le frecce bianche indicano gli endosomi etichettati sia da ERL1-YFP che da RFP-Ara7. Le frecce rosse indicano gli endosomi etichettati da RFP-Ara7. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Immagini delle serie temporali di ERL1-YFP e RFP-Ara7. Le immagini sono state scattate con un intervallo di tempo di 7 s. Il punto temporale di ogni immagine è indicato nell'angolo in alto a sinistra. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Immagini Z-stack di ERL1-YFP. (A, B) Immagini Z-stack degli impianti ERL1-YFP trattati con (A) mock o (B) BFA. I numeri nell'angolo in alto a destra indicano la posizione dell'immagine nello z-stack dall'alto verso il basso. Barra scala: 10 μm. (C) Proiezione delle immagini z-stack di ERL1-YFP trattate con soluzione mock o BFA e soluzione mock o Wm, come indicato nell'angolo in alto a destra. Le frecce indicano i corpi di aggregazione di ERL1-YFP causati dai farmaci. Barra scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Video delle immagini delle serie temporali di ERL1-YFP e RFP-Ara7. Le immagini della serie temporale di ERL1-YFP e RFP-Ara7 sono impilate in un video utilizzando Fiji ad una velocità di 5 fotogrammi / s. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il sistema endomembrana separa il citoplasma di una cellula eucariotica in diversi compartimenti, che consente la funzione biologica specializzata di questi organelli. Per consegnare le proteine cargo e le macromolecole alla loro destinazione finale al momento giusto, numerose vescicole sono guidate per fare la spola tra questi organelli. Gli eventi di traffico di membrana altamente regolamentati svolgono un ruolo fondamentale nella vitalità, nello sviluppo e nella crescita delle cellule. Il meccanismo che regola questo processo cruciale e complicato è ancora poco compreso.
Diversi approcci sono stati descritti qui per osservare la localizzazione subcellulare delle proteine di membrana, analizzare la co-localizzazione tra due proteine di membrana etichettate con diverse proteine fluorescenti, monitorare il movimento dinamico di una proteina di membrana utilizzando immagini di serie temporali e raccogliere informazioni 3D su una proteina di membrana eseguendo l'imaging z-stack che copre l'intera cellula. Oltre agli eventi di traffico di membrana qui descritti, questi approcci possono essere facilmente applicati ad altri processi biologici. Ad esempio, l'imaging di serie temporali può essere condotto su un periodo a lungo termine (diversi giorni) per monitorare un processo di sviluppo30. L'imaging z-stack può essere eseguito per quantificare l'abbondanza di una proteina all'interno di una cellula30. Inoltre, questi approcci di imaging possono combinarsi perfettamente con applicazioni farmacologiche, tra cui vari farmaci, ormoni e persino segnali ambientali, indicando che questi approcci di imaging sono facilmente applicabili a campioni biologici vivi. Oltre alla flessibilità nel trattamento del campione, i metodi qui descritti richiedono solo dispositivi economicamente accessibili, ad eccezione del microscopio confocale, e solo una leggera formazione del personale nelle competenze tecniche, il che significa che questi metodi possono essere ampiamente adottati.
È necessaria cautela in diversi passaggi critici del protocollo. In primo luogo, le concentrazioni ottimali dei farmaci per il traffico di membrana variano a seconda del materiale e del trattamento. Uno studio precedente suggerisce che 30 μM BFA è una bassa concentrazione che può innescare la formazione di corpi BFA caratteristici senza causare il collasso dell'apparato di Golgi nei meristemoidi20. Allo stesso modo, 25 μM Wm è una concentrazione bassa ma efficace che può conferire formazione corporea Wm senza danneggiare gravemente i meristemoidi. Quando viene trattato un nuovo materiale (diverse specie vegetali, diverse parti della pianta, ecc.), le concentrazioni dei farmaci devono essere ottimizzate di conseguenza. In secondo luogo, per mantenere la condizione fisiologica dei campioni in misura massima durante il trattamento, le piantine vengono mantenute parzialmente intatte (rimuovendo solo i cotiledoni) fino alla fase di imaging. Le foglie vere vengono sezionate per la preparazione del vetrino e il campione viene ripreso in seguito. Ogni campione deve essere trattato individualmente e il vetrino deve essere preparato fresco per l'imaging. Infine, sia l'imaging z-stack che l'imaging di serie temporali richiedono una scansione laser ripetuta del campione. Per ridurre al minimo il rischio di fotosbiancamento e fototossicità sui campioni, si raccomanda vivamente una bassa potenza laser.
L'elevata efficienza degli eventi di traffico su membrana è assicurata dalla diversità delle rotte di traffico e dalla loro cinetica in risposta alle specifiche condizioni di sviluppo e ambientali della cellula1. I metodi descritti hanno una risoluzione spaziotemporale limitata, quindi stanno emergendo tecniche di microscopia ottica più sofisticate per acquisire una conoscenza dettagliata del traffico di membrana all'interno di una cellula eucariotica. Ad esempio, la microscopia a super-risoluzione, compresa la microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM) e la microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM), aumentano notevolmente la risoluzione spaziale di una proteina31,32 marcata con fluorescenza, sebbene possano essere analizzati solo campioni fissi; La microscopia a disco rotante accelera sostanzialmente la velocità di scansione e riduce il fotosbiancamento dei campioni33, sebbene sia difficile registrare la dinamica delle proteine con bassa abbondanza usando questo metodo; la microscopia a foglio luminoso fornisce immagini 3D veloci e delicate34,35; e la microscopia a due fotoni consente la rilevazione di segnali di fluorescenza da tessuti più profondi35,36, anche se al costo di una risoluzione leggermente inferiore, ecc. Inoltre, la biologia chimica ha identificato farmaci più specifici che interferiscono con determinate rotte di traffico. Nonostante i limiti, queste tecniche insieme ad altre tecniche avanzate emergenti miglioreranno notevolmente le nostre conoscenze e faranno luce sui meccanismi del sistema di traffico delle membrane cellulari.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e dal Bronson Foundation Award (H.Z.) dell'Università dell'Arkansas per le scienze mediche (UAMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
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