Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

Abstract

בתאים אאוקריוטים, מרכיבי הממברנה, כולל חלבונים ושומנים, מועברים באופן מרחבי-זמני ליעדם בתוך מערכת האנדוממברנה. זה כולל הובלה הפרשה של חלבונים מסונתזים חדשים אל פני התא או אל מחוץ לתא, הובלה אנדוציטית של מטענים חוץ-תאיים או רכיבי קרום פלזמה לתוך התא, והובלה מיחזור או העברה של מטענים בין האברונים התת-תאיים וכו'. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות, צמיחה והסתגלות סביבתית של כל התאים האיקריוטים, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה. קינאזות קולטן פני השטח של התא, אשר קולטות אותות ליגנד מהמרחב החוץ-תאי, עוברות הן הובלה הפרשה והן הובלה אנדוציטית. גישות נפוצות לחקר אירועי סחר בממברנות באמצעות קינאז קולטן לאוצין עשיר בחזרת פלזמה, ERL1, מתוארות כאן. הגישות כוללות הכנת חומר צמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית. כדי לעקוב אחר הוויסות המרחבי-זמני של ERL1, מחקר זה מתאר את ניתוח הלוקליזציה המשותפת בין ERL1 לבין חלבון סמן גוף רב-שלפוחיתי, RFP-Ara7, ניתוח סדרות הזמן של שני חלבונים אלה, וניתוח מחסנית z של ERL1-YFP שטופל במעכבי סחר בקרום ברפלדין A וורטמנין.

Introduction

תנועת ממברנות היא תהליך תאי שמור המפיץ רכיבי ממברנה (הידועים גם בשם מטענים), כולל חלבונים, שומנים ומוצרים ביולוגיים אחרים, בין אברונים שונים בתוך תא אאוקריוטי או על פני קרום הפלזמה אל החלל החוץ תאי וממנו1. תהליך זה מתאפשר על ידי אוסף של ממברנות ואברונים הנקראים מערכת האנדוממברנה, המורכבת מקרום הגרעין, הרשתית האנדופלסמית, מנגנון גולג'י, החללית / ליזוזומים, קרום הפלזמה ואנדוזומים מרובים1. מערכת האנדוממברנה מאפשרת שינוי, אריזה ושינוע של רכיבי הממברנה באמצעות שלפוחיות דינמיות העוברות בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות חיוניים להתפתחות תאים, גדילה והסתגלות סביבתית, ולכן הם נמצאים תחת רגולציה מחמירה ומורכבת2. כיום, גישות רבות בביולוגיה מולקולרית, ביולוגיה כימית, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסות פותחו ויושמו בתחום הסחר בממברנות וקידמו מאוד את ההבנה של הוויסות המרחבי-זמני של מערכת האנדוממברנה 3,4. ביולוגיה מולקולרית משמשת למניפולציות גנטיות קלאסיות של שחקנים פוטנציאליים המעורבים בסחר בממברנה, כגון שינוי ביטוי הגנים של החלבון המעניין או תיוג החלבון המעניין בתגים מסוימים. כלים בביולוגיה כימית כוללים שימוש במולקולות המפריעות באופן ספציפי לתנועה של נתיבים מסוימים 4,5. ספקטרומטריית מסות היא רבת עוצמה לזיהוי הרכיבים באברון שבודד מכנית על ידי גישות ביוכימיות 3,4. עם זאת, תנועת הממברנות היא תהליך ביולוגי דינמי, מגוון ומורכב1. כדי להמחיש את תהליך הסחר בקרום בתאים חיים בתנאים שונים, מיקרוסקופ אור הוא כלי חיוני. התקדמות מתמדת נעשתה בטכניקות מיקרוסקופ מתקדמות כדי להתגבר על האתגרים במדידת היעילות, הקינטיקה והמגוון של האירועים4. כאן, מחקר זה מתמקד במתודולוגיות המקובלות בביולוגיה כימית/פרמקולוגית, ביולוגיה מולקולרית ומיקרוסקופ לחקר אירועי סחר בממברנות במערכת פשוטה ונגישה באופן טבעי, תהליך ההתפתחות הסטומטאלי.

סטומטות הן מיקרו-נקבוביות על משטחים אוויריים של צמחים שנפתחים ונסגרים כדי להקל על חילופי הגזים בין התאים הפנימיים לסביבה 6,7,8. לפיכך, הפיוניות חיוניות לפוטוסינתזה ולטרנספירציה, שני אירועים חיוניים להישרדות הצמח ולצמיחתו. התפתחות סטומטית מותאמת באופן דינמי על ידי רמזים סביבתיים כדי לייעל את הסתגלות הצמח לסביבה9. זיהוי חלבון הקולטן Too Many Mouths (TMM), שראשיתו במחקרים בשנת 2002, פתח את הדלת לעידן חדש של חקירת המנגנונים המולקולריים של התפתחות סטומטית בצמח המודל Arabidopsis thaliana10. לאחר כמה עשורים בלבד, זוהה מסלול איתות קלאסי. ממעלה הזרם אל במורד הזרם, מסלול זה כולל קבוצה של ליגנדות פפטידים מפרישים ממשפחת גורמי דפוס האפידרמיס (EFP), מספר קינאזות קולטן לאוצין עשיר בחוזר (LRR) ממשפחת EREECTA (ER), חלבון קולטן LRR TMM, מפל MAPK, וכמה גורמי שעתוק bHLH כולל SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA וצעקה (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. עבודות קודמות מצביעות על כך שאחת הקינאזות של הקולטן, ER-LIKE 1 (ERL1), מדגימה התנהגויות תת-תאיות פעילות בתפיסת EPF20. ERL2 גם נע באופן דינמי בין קרום הפלזמה לבין כמה אברונים תוך-תאיים27. חסימת שלבי תנועת הממברנות גורמת לדפוס סטומטלי לא תקין, וכתוצאה מכך נוצרים אשכולות סטומטיים על פני העלה28. תוצאות אלה מצביעות על כך שתעבורת הממברנות ממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות סטומטלית. מחקר זה מתאר פרוטוקול לחקירה מרחבית-זמנית של דינמיקת ERL1 באמצעות ניתוח לוקליזציה תת-תאית של חלבון-חלבון בשילוב עם טיפול תרופתי באמצעות כמה מעכבי סחר בממברנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הפתרונות

  1. הכן תמיסת עיקור זרעים על ידי ערבוב 15 מ"ל אקונומיקה עם 35 מ"ל מים מזוקקים ו 50 מיקרוליטר של טריטון X-100.
  2. הכינו תמיסת ברפלדין A (BFA) על ידי המסת אבקת BFA באתנול לריכוז סופי של 10 mM (מלאי). הכן תמיסת וורטמנין (Wm) על ידי המסת אבקת Wm ב- DMSO לריכוז סופי של 10 mM (מלאי).

2. זריעת הזרעים

  1. Aliquot 10-50 זרעים מכל אחד מהצמחים הטרנסגניים הדרושים לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת עיקור זרעים לכל צינור, וערבב היטב על ידי היפוך הצינור בעדינות במשך 10 דקות על שייקר.
  2. השליכו את תמיסת עיקור הזרעים ושטפו את הזרעים ב-1 מ"ל מים מזוקקים חמש פעמים.
  3. הוסיפו 300 μL של מים מזוקקים אוטוקלאביים לכל צינור, וזרעו את הזרעים על מצע טרשת נפוצה בחצי חוזק המכיל 1% (w/v) סוכרוז ו-0.75% (w/v) אגר. השלם את המדיום עם אנטיביוטיקה המתאימה לפי הצורך.
  4. שמור את הצלחת הפוכה ב 4 ° C בחושך במשך 2 ימים כדי לסנכרן את הנביטה.
  5. לאחר יומיים, העבירו את הצלחת לחדר גדילה עם מחזור אור / 8 שעות חושך של 16 שעות (80 μmol / m2/s1) ב 22 ° C. זה נחשב היום הראשון לאחר הנביטה (1 dpg).
  6. שתול את השתילים באדמה ב 10 dpg לצמיחה נוספת.

3. הכנת צמחים טרנסגניים F1 בצבע כפול

  1. לגדל צמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים ERL1-YFP (צמח A) וצמחים טרנסגניים הומוזיגוטיים הנושאים חלבון סמן RFP-Ara7 (צמח B)20 זה לצד זה עד לפריחה בחדר צמיחה עם מחזור אור / 8 שעות כהה (80 μmol/ m 2/s1) ב 22 ° C.
  2. בחרו תפרחת צעירה מצמח A. שמרו על פרח אחד שעומד להיפתח על התפרחת להצלבות גנטיות. מוציאים את כל הפרחים והסיליקים הישנים יותר. בנוסף, הסירו בזהירות את הפרחים הצעירים ואת המריסטמים הפרחוניים כדי למנוע בלבול עתידי.
  3. נתחו בעדינות את הפרח שלא נפתח על ידי הסרת עלי הגביע, עלי הכותרת והאבקנים באמצעות זוג פינצטות חדות. השאירו רק את הפיסטיל על התפרחת.
  4. לוקחים אבקן בוגר מפרח פתוח על צמח B, ומפקידים את גרגרי האבקה על הצלקת של הפיסטיל המנותח על צמח A.
  5. תייגו את הפרח המוצלב ידנית על ידי ציון אביו, אמו ותאריך הצלב הגנטי. תנו לפרח להתבגר, וקצרו את זרעי F1 כאשר הסיליק הופך צהוב/חום (~ 20 יום לאחר הצלב). בדוק אם יש מפעל F1 מוצלח שיש לו גם אותות YFP וגם RFP.

4. טיפול תרופתי

  1. לטיפול BFA, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת דמה (0.3% אתנול) או בתמיסת BFA של 30 מיקרומטר, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה במשך 30 דקות לפני ההדמיה.
  2. לטיפול בוורטמנין, הסר את הקוטילדונים של שתילים בני 7 ימים, טבול את שאר השתילים בתמיסת DMSO 0.25% או וורטמנין 25 mM, החל ואקום למשך דקה אחת ושמור את הדגימה שקועה למשך 30 דקות לפני ההדמיה.
  3. לטיפול ואקום של דגימות, בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, להוסיף 500 μL של פתרון התרופה המתאימה, ולטבול את שתילים מנותחים לתוך הפתרון. חברו בחוזקה מזרק בנפח 10 מ"ל לצינור המיקרוצנטריפוגה, והפעילו ואקום למשך דקה אחת (איור 1). הסר את המזרק, ולשמור את הדגימה בתמיסה למשך הזמן הנדרש. מוציאים בעדינות את השתילים להכנת הדמיה.

Figure 1
איור 1: התקן ואקום פשוט. מזרק 10 מ"ל מחובר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל לטיפול ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. הכנת דגימה להדמיה

  1. נתחו את העלה האמיתי מהדגימה שטופלה באמצעות סכין גילוח חד. הניחו בעדינות את העלה האמיתי בטיפת מים על מגלשת זכוכית, והשאירו את הצד האבקסי למעלה. כסו באיטיות את העלה האמיתי עם כיסוי תוך הימנעות מלכידת בועות.

6. הדמיה קונפוקלית

הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוכה של Leica SP8 שימש לצילום האות הפלואורסצנטי של הדגימות בעבודה זו.

  1. הגדרת נתיב אלומה
    1. בחר לייזר של 514 ננומטר לעירור YFP. השתמש בעוצמת לייזר גבוהה כדי להגביר את עוצמת האות, ובכך להשיג איכות תמונה גבוהה. עם זאת, עוצמת לייזר מעל 5% מסתכנת בהלבנה, ובריאות הדגימה עלולה להיפגע. אם אות הדגימה אינו עמום מדי, התחל בעוצמת לייזר נמוכה.
    2. הפעל PMT/HyD לצורך זיהוי, והגדר את ספי פס הפליטה העליון והתחתון בהתבסס על הספקטרום של פלואורופור YFP. הגדר חלון זיהוי של 530-570 ננומטר כדי לאסוף את אות YFP.
    3. הדמיה רציפה לצבע השני: לחצו על כפתור Seq והוסיפו ערוץ חדש. כברירת מחדל, נתיב קרן YFP שתוכנן בעבר יהיה Seq 1. ב- Seq 2, בחר לייזר של 561 ננומטר עבור עירור RFP, והגדר חלון זיהוי של 570-630 ננומטר כדי לאסוף את אות ה- RFP.
  2. הגדרת תנאי סריקה (איור 2)
    1. כדי לדמות את פעילות התנועה של הממברנה התת-תאית בתוך תאים מקדימים סטומאטליים, בחר עדשת Corr 63x/1.2 W במערכת לצורך הדמיה.
    2. התבנית מתייחסת לגודל התמונה בפיקסלים. התחל עם 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים, ולאחר מכן מטב זאת בהתבסס על גורם הזום והגדרות המטרה לקבלת רזולוציה טובה של איכות פרסום.
    3. המהירות מתייחסת למהירות ראש הסריקה כאשר הלייזר עובר מעל כל פיקסל. למרות שמהירויות סריקה איטיות גורמות לעתים קרובות ליחס אות לרעש טוב יותר, ייתכן שהן לא ילכדו ביעילות את אירועי הסחר בממברנות המשתנים במהירות. התחל במהירות של 400 הרץ, ובצע אופטימיזציה זו בהתבסס על המצב הספציפי של הדגימות.
    4. מקדם הזום משמש להתקרבות של אזור עניין מבלי לשנות את עדשת המטרה. התחל עם מקדם זום של 1, ומטב אותו בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי.
    5. ממוצע הקו מתייחס למספר הפעמים שכל קו X ייסרק כדי לקבל תוצאה ממוצעת. ממוצע קו גדול יותר מפחית את הרעש בתמונה המתקבלת, אך גם מאריך את זמן הסריקה ואת זמן החשיפה לאור הלייזר. כדי לדמות אירועי סחר בממברנה, אל תשתמש בממוצע קו גבוה. התחל עם ממוצע שורות פי 2, ומטב לפי הצורך.
  3. איסוף סדרת זמן
    הערה: כאשר חוקרים אירועי סחר בממברנה, לעתים קרובות יש צורך בסדרת זמן כדי לתעד את התנועה המהירה של האנדוזומים התת-תאיים.
    1. במצב רכישה, בחר במצב סריקה xyt כדי להפעיל את כלי השירות של סידרת הזמן.
    2. החלט על תקופת המתנה בין נקודות הזמן תחת מרווח זמן. לחלופין, לחץ על מזער כדי לצלם את התמונות מיד בזו אחר זו. מרווח זמן של 7 שניות שימש בניסוי סדרת הזמן הבאה.
    3. בחר משך זמן והזן את הזמן הכולל להפעלת הניסוי. לחלופין, הגדר את מספר המסגרות שייאספו על-ידי בחירה באפשרות 'מסגרות ' (איור 3).
  4. כדי לאסוף את המידע התלת-ממדי בנוגע לאירוע הסחר בממברנה בתוך התא כולו, השתמש במצב סריקה Z-stack. הקרנת העוצמה המרבית של תמונות מחסנית Z משמשת לעתים קרובות לניתוח.
    1. בחר את מצב הסריקה xyz במצב רכישה, ולאחר מכן כלי השירות Z-Stack יהפוך לנגיש.
    2. בחר באפשרות Z-wide. תחת מצב סריקה, הגדר את התמונה העליונה ואת התמונה התחתונה של ערימת Z באמצעות הלחצנים התחלה וסיום.
    3. הגדר את העובי של z-step על ידי לחיצה על גודל z-step. לחלופין, הגדירו כמה תמונות לצלם כדי לכסות את כל הטווח של ערימת Z. כדי להבטיח עקביות בין הדגימות, הגדירו את גודל שלב z (איור 4).
  5. עיבוד תמונה
    1. הקרנת העוצמה המרבית של תמונות z-stack נוצרת על ידי התוכנה הקונפוקלית (http://www.leica-microsystems.com). בכרטיסייה ראשית תהליך , בחר תחילה את קובץ z-stack המעוניין תחת הכרטיסייה פתיחת פרויקטים בצד שמאל קיצוני. לאחר מכן, עבור לכרטיסייה האמצעית בשם Process Tools, בחר את פונקציית ההקרנה , בחר Maximum בחלונית הנפתחת של Method, ולחץ על הלחצן Apply . תמונת הקרנה של מחסנית z תיווצר תחת הכרטיסיה פרוייקטים פתוחים.
    2. הווידאו של תמונות סדרת הזמן נוצר על ידי פיג'י (https://imagej.net/Fiji). בכרטיסיה קובץ , השתמש בפונקציה פתח כדי לפתוח את כל התמונות של סדרות הזמן בסדר הנכון. בכרטיסייה תמונה , אתר את הפונקציה Stack ובחר Images to stack כדי ליצור סרטון. שמור את הקובץ בתבנית .avi עם קצב המסגרות הרצוי (5 מסגרות לשנייה לווידאו 1).

Figure 2
איור 2: לוח מצב הסריקה של ממד XY. החלונית 'מצב סריקה' משמשת להגדרת תנאי סריקת התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: כלי השירות של סדרת הזמן במצב סריקה xyt. כלי השירות Time Series משמש להגדרת תנאי ההדמיה לאיסוף רצף של סידרת תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כלי השירות z-stack במצב סריקה xyz. כלי השירות z-stack משמש להגדרת תנאי הדמיה לאיסוף סדרה של תמונות על ציר z. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר קודם הצביע על כך ש-ERL1 הוא קולטן קינאז פעיל שעובר אירועי סחר דינמיים בממברנות20. ERL1 הוא קינאז קולטן LRR טרנסממברנה על קרום הפלזמה. ERL1 מסונתז חדש ברשתית האנדופלסמית מעובד בגופי גולג'י ומועבר הלאה לקרום הפלזמה. מולקולות ERL1 על קרום הפלזמה יכולות לקלוט ליגנדות EPF באמצעות תחום LRRחוץ-תאי 18. עם הפעלתו על ידי EPF מעכבים, כולל EPF1, ERL1 מופנם לתוך אנדוזומים, מועבר לגוף הרב-שלפוחית (MVB), ולאחר מכן מועבר לתוך vacuoles עבור השפלה כדי לסיים את האות20. לעומת זאת, ליגנד EPFL9 אנטגוניסטי המקדם היווצרות סטומטלית14, שומר על ERL1 ברשתית האנדופלסמית. לחלופין, ERL1 מקומי של קרום הפלזמה יכול למחזר בין אנדוזומים לבין קרום פלזמה20.

כאן, צמחים טרנסגניים הנושאים מקדם ERL1: :ERL1-YFP גודלו במשך 7 ימים בהתאם לפרוטוקול שהוזכר לעיל. כאשר רק הופיע, העלה האמיתי נותח לצורך הדמיה, שכן ERL1 מתבטא רק בתאי שושלת סטומטית בעלים צעירים20. כצפוי, תאים מפוזרים הודגשו על-ידי אות YFP, כאשר ERL1-YFP תייג את קרום הפלזמה (איור 5). בנוסף, נצפו גם אותות ניקוב מרובים, מה שמרמז על כך ש-ERL1 היה גם מקומי לאנדוזומים.

מספר אברונים בתאי צמחים נוכחים כאותות פלואורסצנטיים מנוקבים כאשר הם נצפים תחת מיקרוסקופ אור, כגון רשת טרנס-גולג'י וה-MVBs. כאשר קו סמן MVB הנושא RFP-Ara7 נחצה גנטית עם הקו המהונדס ERL1-YFP , שני חלבוני הסמנים נצפו באמצעות גישת הדמיה רציפה כמתואר לעיל. כפי שניתן לראות באיור 6, RFP-Ara7 הדגיש אותות ניקוב מרובים כמעט בכל התאים, מה שמצביע על MVB בתאים האלה (איור 6B). בעת מיזוג עם אות ERL1-YFP, רוב הניקוב החיובי ERL1-YFP חפף לניקוב המסומן בתווית RFP-Ara7. תוצאה זו מצביעה על כך שחלק ממולקולות ERL1-YFP מועברות ל-MVBs.

כדי לעקוב אחר הדינמיקה של האנדוזומים המהירים האלה, נאספו תמונות מסדרות זמן של עלים אמיתיים בני 7 ימים הנושאים ERL1-YFP ו-RFP-Ara7 (איור 7). מרווחי זמן של 7 שניות הוחלו במשך 203 שניות, ו-30 התמונות שנאספו שימשו ליצירת סרטון בתמונה J (וידאו 1). הסרטון הראה כי אנדוזומים המסומנים בתווית ERL1-YFP נעו יחד עם RFP-Ara7 בתוך תאי השושלת הסטומאטלית, ובכך אישרו כי ERL1-YFP היה מקומי ל- MVBs.

כדי לבחון את נתיבי הסחר ב-ERL1 בגישה פרמקולוגית, נותחה השפעתם של שני סמי סחר נפוצים בממברנה, ברפלדין A (BFA) וורטמנין (Wm). BFA, על ידי עיכוב גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטיד ADP-ריבוסילציה, כולל GNOM, יכול לחסום את המיחזור האנדוזומלי והאנדוציטוזה של חלבוני ממברנה29. לאחר 30 דקות של חשיפה לתמיסת BFA, ERL1-YFP זוהה בכמה תאים גדולים המכונים גופי BFA (איור 8B, C). זה מצביע על כך שסחר ERL1 יכול להיחסם על ידי BFA, מה שמרמז על כך ש- ERL1 עובר מחזור או אנדוציטוזה. Wm יכול לעכב phosphatidylinositol-3 ו phosphatidylinositol-4 kinases, ובכך גורם לאיחוי של MVBs5. כאשר טופלו ב-Wm במשך 30 דקות, נצפו כמה מבנים דמויי טבעת שהודגשו על-ידי ERL1-YFP, אשר נקראים בדרך כלל גופי Wm (איור 8C). תוצאה זו מצביעה על כך ש-ERL1-YFP מועבר ל-MVBs, מה שמרמז על כך ש-ERL1 עוקב אחר המסלול ל-vacuoles לצורך התפרקות.

Figure 5
איור 5: תמונת מישור יחיד של ERL1-YFP. (A) התמונה הפלואורסצנטית, (B) תמונת השדה הבהיר, ו-(C) התמונה הממוזגת מראות ש-ERL1-YFP מסמן את קרום הפלזמה וכמה נקבים ניידים מאוד בתוך תאי שושלת סטומטלית. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונות רציפות של ERL1-YFP ו-RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP ו-(B) RFP-Ara7 שניהם מסמנים אותות ניקוב בתוך התא. הניקוב הלבן ב-(C) התמונה הממוזגת ו-(D) התמונה המשובצת מציין ששני החלבונים מתמקמים יחד ב-MVB בתוך תאי שושלת סטומטלית. החיצים הלבנים מציינים אנדוזומים המסומנים הן על ידי ERL1-YFP והן על ידי RFP-Ara7. החיצים האדומים מציינים אנדוזומים המסומנים על ידי RFP-Ara7. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונות מסדרות זמן של ERL1-YFP ו-RFP-Ara7. התמונות צולמו במרווח זמן של 7 שניות. נקודת הזמן של כל תמונה מצוינת בפינה השמאלית העליונה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות Z-stack של ERL1-YFP. (A, B) תמונות Z-stack של צמחי ERL1-YFP שטופלו ב-(A) מדומה או (B) BFA.  המספרים בפינה השמאלית העליונה מציינים את מיקום התמונה בערימת z מלמעלה למטה. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (C) הקרנה של תמונות z-stack של ERL1-YFP שטופלו בתמיסת דמה או BFA ותמיסת דמה או Wm, כפי שמצוין בפינה השמאלית העליונה. החיצים מציינים את גופי הצבירה של ERL1-YFP הנגרמים על ידי התרופות. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: סרטון של תמונות סדרת הזמן של ERL1-YFP ו- RFP-Ara7. תמונות סדרת הזמן של ERL1-YFP ו- RFP-Ara7 נערמות לסרטון באמצעות פיג'י במהירות של 5 פריימים לשנייה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת האנדוממברנה מפרידה את הציטופלסמה של התא האיקריוטי לתאים שונים, מה שמאפשר את התפקוד הביולוגי המיוחד של אברונים אלה. כדי להעביר חלבוני מטען ומקרומולקולות ליעדם הסופי בזמן הנכון, שלפוחיות רבות מונחות לעבור בין אברונים אלה. אירועי סחר בממברנות מוסדרים מאוד ממלאים תפקידים בסיסיים בכדאיות, התפתחות וצמיחה של תאים. המנגנון המסדיר את התהליך החיוני והמסובך הזה עדיין אינו מובן.

תוארו כאן מספר גישות לצפייה בלוקליזציה תת-תאית של חלבוני ממברנה, ניתוח הקו-לוקליזציה בין שני חלבוני ממברנה המתויגים בחלבונים פלואורסצנטיים שונים, ניטור התנועה הדינמית של חלבון ממברנה באמצעות תמונות מסדרות זמן, ואיסוף מידע תלת-ממדי על חלבון ממברנה על ידי ביצוע הדמיה של מחסנית z המכסה את התא כולו. מלבד אירועי הסחר בממברנות המתוארים כאן, ניתן ליישם גישות אלה בקלות על תהליכים ביולוגיים אחרים. לדוגמה, הדמיה של סדרת הזמן יכולה להתבצע על פני תקופה ארוכת טווח (מספר ימים) כדי לעקוב אחר תהליך התפתחותי30. ניתן לבצע את הדמיית מחסנית ה-z כדי לכמת את השפע של חלבון בתוך תא30. בנוסף, גישות הדמיה אלה יכולות להשתלב באופן מושלם עם יישומים פרמקולוגיים, כולל תרופות שונות, הורמונים ואפילו רמזים סביבתיים, מה שמצביע על כך שגישות הדמיה אלה ישימות בקלות לדגימות ביולוגיות חיות. מלבד הגמישות בטיפול המדגם, השיטות המתוארות כאן דורשות רק מכשירים משתלמים כלכלית, למעט המיקרוסקופ הקונפוקלי, ורק אימון אור של אנשי הצוות במיומנויות הטכניות, ולכן ניתן לאמץ שיטות אלה באופן נרחב.

נדרשת זהירות במספר שלבים קריטיים של הפרוטוקול. ראשית, הריכוזים האופטימליים של סמי הסחר בממברנות משתנים בהתאם לחומר ולטיפול. מחקר קודם מצביע על כך ש-30 מיקרומטר BFA הוא ריכוז נמוך שיכול לעורר היווצרות גוף BFA אופיינית מבלי לגרום לקריסת מנגנון גולג'י במריסטמואידים20. כמו כן, 25 μM Wm הוא ריכוז נמוך אך יעיל שיכול להעניק היווצרות גוף Wm מבלי לפגוע קשות במריסטמואידים. כאשר מטפלים בחומר חדש (מיני צמחים שונים, חלקים שונים של הצמח וכו'), יש לייעל את ריכוזי התרופות בהתאם. שנית, כדי לשמור על המצב הפיזיולוגי של הדגימות במידה מקסימלית במהלך הטיפול, השתילים נשמרים שלמים חלקית (רק הסרת הקוטילדונים) עד לשלב ההדמיה. עלים אמיתיים נחתכים להכנת שקופיות, והדגימה מצולמת לאחר מכן. כל דגימה צריכה להיות מטופלת בנפרד, ואת השקף צריך להיות טרי עבור הדמיה. לבסוף, הן הדמיה של מחסנית z והן הדמיה של סדרות זמן דורשות סריקה חוזרת ונשנית בלייזר של הדגימה. כדי למזער את הסיכון של photobleaching ו phototoxicity על הדגימות, כוח לייזר נמוך מומלץ מאוד.

היעילות הגבוהה של אירועי סחר בממברנות מובטחת על ידי מגוון נתיבי הסחר והקינטיקה שלהם בתגובה לתנאים ההתפתחותיים והסביבתיים הספציפיים של תא1. לשיטות המתוארות יש רזולוציה מרחבית-זמנית מוגבלת, ולכן טכניקות מיקרוסקופיות אור מתוחכמות יותר מתפתחות כדי להשיג ידע מפורט על תנועת הממברנות בתוך תא איקריוטי. לדוגמה, מיקרוסקופיה ברזולוציית על, כולל מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי (PALM), מגדילים מאוד את הרזולוציה המרחבית של חלבון מתויג פלואורסצנטי31,32, אם כי ניתן לנתח רק דגימות קבועות; מיקרוסקופ דיסק מסתובב מאיץ באופן משמעותי את מהירות הסריקה ומפחית את ההלבנה של הדגימות33, אם כי מאתגר לתעד את הדינמיקה של חלבונים עם שפע נמוך באמצעות שיטה זו; מיקרוסקופ גיליון אור מספק הדמיה תלת-ממדית מהירה ועדינה34,35; ומיקרוסקופ דו-פוטוני מאפשר זיהוי אותות פלואורסצנטיים מרקמות עמוקות יותר35,36, אם כי במחיר של רזולוציה מעט נמוכה יותר וכו'. בנוסף, ביולוגיה כימית זיהתה תרופות ספציפיות יותר המפריעות לנתיבי סחר מסוימים. למרות המגבלות, טכניקות אלו יחד עם טכניקות מתקדמות אחרות ישפרו מאוד את הידע שלנו וישפכו אור על מנגנוני מערכת הסחר בקרום התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-2217757) (X.Q.) ופרס קרן ברונסון של אוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (UAMS) (H.Z).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

ביולוגיה גיליון 195
שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter