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Biology

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Abstract

En las células eucariotas, los componentes de la membrana, incluidas las proteínas y los lípidos, se transportan espacio-temporalmente a su destino dentro del sistema de endomembranas. Esto incluye el transporte secretor de proteínas recién sintetizadas a la superficie celular o al exterior de la célula, el transporte endocítico de cargas extracelulares o componentes de la membrana plasmática dentro de la célula, y el transporte de reciclaje o transporte de cargas entre los orgánulos subcelulares, etc. Los eventos de tráfico de membrana son cruciales para el desarrollo, el crecimiento y la adaptación ambiental de todas las células eucariotas y, por lo tanto, están sujetos a una estricta regulación. Las quinasas receptoras de la superficie celular, que perciben las señales de ligandos del espacio extracelular, experimentan tanto el transporte secretor como el endocítico. Aquí se describen los enfoques comúnmente utilizados para estudiar los eventos de tráfico de membrana utilizando una quinasa receptora de repetición rica en leucina localizada en la membrana plasmática, ERL1. Los enfoques incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocal. Para monitorizar la regulación espacio-temporal de ERL1, en este estudio se describe el análisis de colocalización entre ERL1 y una proteína marcador corporal multivesicular, RFP-Ara7, el análisis de series temporales de estas dos proteínas y el análisis de la pila z de ERL1-YFP tratada con los inhibidores del tráfico de membrana brefeldina A y wortmannina.

Introduction

El tráfico de membrana es un proceso celular conservado que distribuye los componentes de la membrana (también conocidos como cargas), incluidas proteínas, lípidos y otros productos biológicos, entre diferentes orgánulos dentro de una célula eucariota o a través de la membrana plasmática hacia y desdeel espacio extracelular. Este proceso es facilitado por una colección de membranas y orgánulos denominada sistema de endomembranas, que consiste en la membrana nuclear, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, las vacuolas/lisosomas, la membrana plasmática y múltiples endosomas1. El sistema de endomembranas permite la modificación, el empaquetado y el transporte de los componentes de la membrana mediante vesículas dinámicas que se desplazan entre estos orgánulos. Los eventos de tráfico de membranas son cruciales para el desarrollo, el crecimiento y la adaptación ambiental de las células y, por lo tanto, están sujetos a una regulación estricta y compleja2. En la actualidad, se han desarrollado y aplicado múltiples enfoques en biología molecular, biología química, microscopía y espectrometría de masas al campo del tráfico de membranas y han avanzado enormemente en la comprensión de la regulación espacio-temporal del sistema de endomembranas 3,4. La biología molecular se utiliza para las manipulaciones genéticas clásicas de los supuestos actores implicados en el tráfico de membranas, como la alteración de la expresión génica de la proteína de interés o el etiquetado de la proteína de interés con ciertas etiquetas. Las herramientas de la biología química incluyen el uso de moléculas que interfieren específicamente con el tráfico de ciertas rutas 4,5. La espectrometría de masas es potente para identificar los componentes de un orgánulo que ha sido aislado mecánicamente por aproximaciones bioquímicas 3,4. Sin embargo, el tráfico de membranas es un proceso biológico dinámico, diverso y complejo1. Para visualizar el proceso de tráfico de membranas en células vivas en diversas condiciones, la microscopía óptica es una herramienta esencial. Se ha avanzado continuamente en las técnicas avanzadas de microscopio para superar los desafíos en la medición de la eficiencia, cinética y diversidad de los eventos4. Aquí, este estudio se centra en las metodologías ampliamente adoptadas en biología química/farmacológica, biología molecular y microscopía para estudiar los eventos de tráfico de membrana en un sistema naturalmente simplificado y experimentalmente accesible, el proceso de desarrollo de estomas.

Los estomas son microporos en las superficies aéreas de las plantas que se abren y cierran para facilitar el intercambio de gases entre las células internas y el medio ambiente 6,7,8. Por lo tanto, los estomas son esenciales para la fotosíntesis y la transpiración, dos eventos que son cruciales para la supervivencia y el crecimiento de las plantas. El desarrollo de los estomas se ajusta dinámicamente mediante señales ambientales para optimizar la adaptación de la planta al entorno9. La identificación de la proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abrió la puerta a una nueva era de investigación de los mecanismos moleculares del desarrollo estomatológico en la planta modelo Arabidopsis thaliana10. Después de unas pocas décadas, se ha identificado una vía de señalización clásica. De arriba a abajo, esta vía incluye un grupo de ligandos de péptidos secretores de la familia de los factores de patrón epidérmico (EFP), varias quinasas del receptor de repeticiones ricas en leucina (LRR) de la superficie celular de la familia EREECTA (ER), la proteína del receptor LRR TMM, una cascada de MAPK y varios factores de transcripción de bHLH, incluidos SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA y SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabajos previos indican que uno de los receptores quinasas, ER-LIKE 1 (ERL1), demuestra comportamientos subcelulares activos sobre la percepción de EPF20. ERL2 también transita dinámicamente entre la membrana plasmática y algunos orgánulos intracelulares27. El bloqueo de los pasos de tráfico de membrana causa un patrón estomático anormal, lo que resulta en grupos de estomas en la superficie de la hoja28. Estos resultados sugieren que el tráfico de membranas juega un papel esencial en el desarrollo de los estomas. En este estudio se describe un protocolo para investigar espacio-temporalmente la dinámica de ERL1 mediante el análisis de colocalización subcelular proteína-proteína combinado con el tratamiento farmacológico mediante algunos inhibidores del tráfico de membrana.

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Protocol

1. Preparación de las soluciones

  1. Prepare la solución de esterilización de semillas mezclando 15 ml de lejía con 35 ml de agua destilada y 50 μl de Triton X-100.
  2. Preparar la solución de brefeldina A (BFA) disolviendo el polvo de BFA en etanol hasta una concentración final de 10 mM (stock). Prepare la solución de wortmannina (Wm) disolviendo el polvo de Wm en DMSO hasta una concentración final de 10 mM (stock).

2. Sembrando las semillas

  1. Alícuota 10-50 semillas de cada una de las plantas transgénicas requeridas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Agregue 1 ml de solución de esterilización de semillas en cada tubo y mezcle bien invirtiendo el tubo suavemente durante 10 minutos en un agitador.
  2. Deseche la solución de esterilización de semillas y lave las semillas con 1 ml de agua destilada esterilizada en autoclave cinco veces.
  3. Agregue 300 μL de agua destilada esterilizada en autoclave en cada tubo y siembre las semillas en medios MS de concentración media que contengan 1% (p/v) de sacarosa y 0,75% (p/v) de agar. Complemente el medio con los antibióticos correspondientes según sea necesario.
  4. Mantener la placa boca abajo a 4 °C en la oscuridad durante 2 días para sincronizar la germinación.
  5. Después de 2 días, transfiera la placa a una sala de crecimiento con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad (80 μmol/m2/s1) a 22 °C. Esto se considera el primer día después de la germinación (1 dpg).
  6. Trasplante las plántulas al suelo a 10 dpg para un mayor crecimiento.

3. Preparación de plantas transgénicas F1 de dos colores

  1. Cultive plantas transgénicas homocigóticas portadoras de ERL1-YFP (planta A) y plantas transgénicas homocigóticas portadoras de una proteína marcadora marcada con RFP RFP-Ara7 (planta B)20 una al lado de la otra hasta que florezcan en una sala de crecimiento con un ciclo de 16 h de luz/8 h de oscuridad (80 μmol/m2/s1) a 22 °C.
  2. Elija una inflorescencia joven de la planta A. Mantenga una flor que esté a punto de abrirse en la inflorescencia para los cruces genéticos. Retira todas las flores y siluas más viejas. Además, retire con cuidado las flores más jóvenes y los meristemos florales para evitar confusiones futuras.
  3. Disecciona suavemente la flor sin abrir quitando los sépalos, los pétalos y el estambre con un par de pinzas afiladas. Solo deje el pistilo en la inflorescencia.
  4. Tome un estambre maduro de una flor abierta en la planta B y deposite los granos de polen en el estigma del pistilo disecado en la planta A.
  5. Etiquete esta flor cruzada manualmente indicando su padre, madre y la fecha del cruce genético. Deje que la flor madure y coseche las semillas F1 cuando la sílice se vuelva amarilla / marrón (~ 20 días después del cruce). Compruebe si hay una planta de F1 exitosa que tenga señales YFP y RFP.

4. Tratamiento farmacológico

  1. Para el tratamiento con BFA, retire los cotiledones de las plántulas de 7 días de edad, sumerja el resto de las plántulas en una solución simulada (etanol al 0,3%) o en una solución de BFA de 30 μM, aplique vacío durante 1 minuto y mantenga la muestra sumergida durante 30 minutos antes de obtener imágenes.
  2. Para el tratamiento con wortmannin, retire los cotiledones de las plántulas de 7 días de edad, sumerja el resto de las plántulas en una solución de DMSO al 0,25% o en 25 mM de wortmannina, aplique vacío durante 1 minuto y mantenga la muestra sumergida durante 30 minutos antes de obtener imágenes.
  3. Para el tratamiento al vacío de muestras, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 500 μl de la solución de fármaco correspondiente y sumerja las plántulas disecadas en la solución. Conecte firmemente una jeringa de 10 ml al tubo de microcentrífuga y aplique vacío durante 1 minuto (Figura 1). Retire la jeringa y mantenga la muestra en la solución durante el tiempo requerido. Saque con cuidado las plántulas para prepararlas para la obtención de imágenes.

Figure 1
Figura 1: Dispositivo de vacío simple. Se conecta una jeringa de 10 ml a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para el tratamiento al vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Preparación de la muestra para la obtención de imágenes

  1. Diseccione la hoja verdadera de la muestra tratada con una cuchilla de afeitar afilada. Coloque suavemente la hoja verdadera en una gota de agua en un portaobjetos de vidrio y mantenga el lado abaxial hacia arriba. Cubra lentamente la hoja verdadera con un cubreobjetos mientras evita atrapar burbujas.

6. Imágenes confocales

NOTA: Se utilizó un microscopio confocal de barrido invertido Leica SP8 para obtener imágenes de la señal de fluorescencia de las muestras de este trabajo.

  1. Configuración de la trayectoria del haz
    1. Seleccione un láser de 514 nm para la excitación YFP. Utilice una alta potencia láser para aumentar la intensidad de la señal y, así, obtener una alta calidad de imagen. Sin embargo, las potencias del láser superiores al 5% corren el riesgo de fotoblanqueo y la salud de la muestra puede verse afectada. Si la señal de muestra no es demasiado tenue, comience con una intensidad láser baja.
    2. Active PMT/HyD para la detección y defina los umbrales de la banda de emisión superior e inferior en función del espectro del fluoróforo YFP. Establezca una ventana de detección de 530-570 nm para recoger la señal YFP.
    3. Imágenes secuenciales para el segundo color: Haga clic en el botón Seq y agregue un nuevo canal. De forma predeterminada, la trayectoria del haz YFP diseñada anteriormente será Seq 1. En la Secuencia 2, seleccione un láser de 561 nm para la excitación RFP y establezca una ventana de detección de 570-630 nm para recopilar la señal RFP.
  2. Configuración de las condiciones de escaneo (Figura 2)
    1. Para obtener imágenes de la actividad de tráfico de la membrana subcelular dentro de las células precursoras estomáticas, elija una lente Corr de 63x/1,2 W en el sistema para obtener imágenes.
    2. El formato se refiere al tamaño de la imagen en píxeles. Comience con 1.024 píxeles x 1.024 píxeles y, a continuación, optimícelo en función del factor de zoom y la configuración del objetivo para obtener una buena resolución de calidad de publicación.
    3. La velocidad se refiere a la velocidad del cabezal de escaneo a medida que el láser pasa sobre cada píxel. Aunque las velocidades de escaneo lentas a menudo dan como resultado una mejor relación señal-ruido, es posible que no capturen de manera eficiente los eventos de tráfico de membrana que cambian rápidamente. Comience con una velocidad de 400 Hz y optimícela en función de la situación específica de las muestras.
    4. El factor de zoom se utiliza para acercar una región de interés sin cambiar la lente del objetivo. Comience con un factor de zoom de 1 y optimícelo en función de las necesidades específicas del experimento.
    5. El promedio de línea se refiere al número de veces que se escaneará cada línea X para obtener un resultado promedio . Un promedio de línea mayor reduce el ruido en la imagen resultante, pero también aumenta el tiempo de escaneo y el tiempo de exposición a la luz láser. Para obtener imágenes de eventos de tráfico de membranas, no utilice un promedio de línea alto. Comience con un promedio de línea de 2x y optimice según sea necesario.
  3. Recopilación de una serie temporal
    NOTA: Cuando se estudian los eventos de tráfico de membranas, a menudo se necesita una serie temporal para registrar el rápido movimiento de los endosomas subcelulares.
    1. En el modo de adquisición, seleccione el modo de escaneo xyt para habilitar la utilidad de serie temporal.
    2. Decida un período de espera entre los puntos de tiempo en Intervalo de tiempo. Alternativamente, haga clic en Minimizar para tomar las imágenes inmediatamente una tras otra. Se utilizó un intervalo de tiempo de 7 s en el siguiente experimento de series temporales.
    3. Seleccione Duración e introduzca el tiempo total que tarda en ejecutarse el experimento. Como alternativa, defina el número de fotogramas que se van a recopilar seleccionando Fotogramas (Figura 3).
  4. Para recopilar la información tridimensional sobre el evento de tráfico de membrana dentro de toda la célula, utilice el modo de escaneo Z-stack. La proyección de máxima intensidad de las imágenes de la pila Z se utiliza a menudo para el análisis.
    1. Seleccione el modo de escaneo xyz en el modo de adquisición y, a continuación, se podrá acceder a la utilidad Z-Stack.
    2. Seleccione la opción Z-wide . En el modo de escaneo, defina la imagen superior y la imagen inferior de la pila Z con los botones Iniciar y Fin .
    3. Defina el grosor del paso z haciendo clic en el tamaño del paso z. Alternativamente, defina cuántas imágenes tomar para cubrir todo el rango de la pila Z. Para garantizar la coherencia entre las muestras, defina el tamaño del paso z (Figura 4).
  5. Tratamiento de imágenes
    1. La proyección de máxima intensidad de las imágenes de la pila z es generada por el software confocal (http://www.leica-microsystems.com). En la pestaña Proceso principal, primero elija el archivo z-stack interesado en la pestaña Abrir proyectos en el extremo izquierdo. Luego, cambie a la pestaña central llamada Herramientas de proceso, seleccione la función Proyección , elija Máximo en el panel desplegable de Método y haga clic en el botón Aplicar . Se generará una imagen de proyección de pila z en la pestaña Proyectos abiertos.
    2. El vídeo de las imágenes de la serie temporal ha sido generado por Fiji (https://imagej.net/Fiji). En la pestaña Archivo , utilice la función Abrir para abrir todas las imágenes de series temporales en el orden correcto. En la pestaña Imagen , busque la función Apilar y elija Imágenes para apilar para generar un vídeo. Guarde el archivo en formato .avi con la velocidad de fotogramas deseada (5 fotogramas / s para Video 1).

Figure 2
Figura 2: El panel de modo de escaneo de la dimensión XY. El panel de modo de escaneo se utiliza para configurar las condiciones de escaneo de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: La utilidad de serie temporal en el modo de escaneo xyt. La utilidad de serie temporal se utiliza para configurar las condiciones de imagen para recopilar consecutivamente una serie de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: La utilidad z-stack en el modo de escaneo xyz. La utilidad z-stack se utiliza para configurar las condiciones de imagen para recopilar una serie de imágenes en el eje z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Un estudio previo indicó que ERL1 es un receptor quinasa activo que experimenta eventos dinámicos de tráfico de membrana20. ERL1 es una quinasa transmembrana del receptor LRR en la membrana plasmática. La ERL1 recién sintetizada en el retículo endoplásmico se procesa en los cuerpos de Golgi y se transporta posteriormente a la membrana plasmática. Las moléculas ERL1 de la membrana plasmática pueden percibir ligandos EPF utilizando su dominio18 LRR extracelular. Tras la activación por los EPF inhibidores, incluido el EPF1, ERL1 se internaliza en los endosomas, se transporta a los cuerpos multivesiculares (MVB) y luego se transporta a las vacuolas para su degradación y terminación de la señal20. Por el contrario, el ligando antagonista EPFL9, que promueve la formación de estomas14, retiene ERL1 en el retículo endoplásmico. Alternativamente, el ERL1 localizado en la membrana plasmática puede reciclarse entre los endosomas y la membrana plasmática20.

Aquí, las plantas transgénicas portadoras del promotor ERL1: :ERL1-YFP se cultivaron durante 7 días siguiendo el protocolo mencionado anteriormente. Cuando recién emergía, la hoja verdadera fue diseccionada para obtener imágenes, ya que ERL1 solo se expresa en las células del linaje estomatológico en las hojas jóvenes20. Como era de esperar, las células dispersas fueron resaltadas por la señal YFP, donde ERL1-YFP marcó la membrana plasmática (Figura 5). Además, también se observaron múltiples señales punteadas, lo que sugiere que ERL1 también estaba localizada en los endosomas.

Varios orgánulos en las células vegetales se presentan como señales fluorescentes punteadas cuando se observan bajo un microscopio óptico, como la red trans-Golgi y los MVB. Cuando la línea marcadora MVB portadora de RFP-Ara7 se cruzó genéticamente con la línea transgénica ERL1-YFP , ambas proteínas marcadoras se observaron utilizando el enfoque de imágenes secuenciales descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 6, RFP-Ara7 resaltó múltiples señales punteadas en casi todas las células, lo que indica los MVB en estas células (Figura 6B). Al fusionarse con la señal ERL1-YFP, la mayor parte de la puntuación positiva para ERL1-YFP se superpuso con la puntuación etiquetada con RFP-Ara7. Este resultado sugiere que algunas de las moléculas de ERL1-YFP son transportadas a los MVB.

Para monitorear la dinámica de estos endosomas de rápido movimiento, se recolectaron imágenes de series de tiempo de las hojas verdaderas de 7 días de edad con ERL1-YFP y RFP-Ara7 (Figura 7). Se aplicaron intervalos de tiempo de 7 s durante 203 s, y las 30 imágenes recolectadas se utilizaron para generar un video en la Imagen J (Video 1). El video mostró que los endosomas marcados con ERL1-YFP se movieron junto con RFP-Ara7 dentro de las células del linaje estomático, confirmando así que ERL1-YFP estaba localizado en los MVB.

Para examinar las rutas de tráfico de ERL1 utilizando un enfoque farmacológico, se analizó el efecto de dos fármacos de tráfico de membrana de uso común, la brefeldina A (BFA) y la wortmannina (Wm). El BFA, al inhibir los factores de intercambio guanina-nucleótidos del factor de ribosilación ADP, incluido el GNOM, puede bloquear el reciclaje endosomal y la endocitosis de las proteínas de membrana29. Después de 30 minutos de exposición a la solución de BFA, se detectó ERL1-YFP en algunos compartimentos grandes conocidos como cuerpos de BFA (Figura 8B, C). Esto indica que el tráfico de ERL1 puede ser bloqueado por BFA, lo que sugiere que ERL1 sufre reciclaje o endocitosis. Wm puede inhibir las quinasas fosfatidilinositol-3 y fosfatidilinositol-4 y, por lo tanto, provoca la fusión de MVB5. Cuando se trataron con Wm durante 30 min, se observaron algunas estructuras en forma de anillo resaltadas por ERL1-YFP, que típicamente se denominan cuerpos Wm (Figura 8C). Este resultado indica que ERL1-YFP es transportado a MVBs, lo que sugiere que ERL1 sigue la ruta a las vacuolas para su degradación.

Figure 5
Figura 5: Imagen de un solo plano de ERL1-YFP. (A) La imagen de fluorescencia, (B) la imagen de campo claro y (C) la imagen combinada muestran que ERL1-YFP marca la membrana plasmática y algunos punteados altamente móviles dentro de las células del linaje estomático. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes secuenciales de ERL1-YFP y RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP y (B) RFP-Ara7 etiquetan señales punteadas dentro de la célula. La punteada blanca en (C) la imagen combinada y (D) la imagen insertada indica que las dos proteínas se colocalizan en las MVB dentro de las células del linaje estomático. Las flechas blancas indican endosomas marcados tanto por ERL1-YFP como por RFP-Ara7. Las flechas rojas indican endosomas marcados por RFP-Ara7. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Imágenes de series temporales de ERL1-YFP y RFP-Ara7. Las imágenes fueron tomadas con un intervalo de tiempo de 7 s. El punto de tiempo de cada imagen se indica en la esquina superior izquierda. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Imágenes de la pila Z de ERL1-YFP. (A, B) Imágenes de la pila Z de las plantas ERL1-YFP tratadas con (A) simulacro o (B) BFA. Los números en la esquina superior derecha indican la posición de la imagen en la pila z de arriba a abajo. Barra de escala: 10 μm. (C) Proyección de las imágenes de la pila z de ERL1-YFP tratadas con solución simulada o BFA y solución simulada o Wm, como se indica en la esquina superior derecha. Las flechas indican los cuerpos de agregación de ERL1-YFP causados por los fármacos. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Video de las imágenes de series temporales de ERL1-YFP y RFP-Ara7. Las imágenes de series temporales de ERL1-YFP y RFP-Ara7 se apilan en un vídeo utilizando Fiji a una velocidad de 5 fotogramas/s. Haga clic aquí para descargar este vídeo.

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Discussion

El sistema de endomembranas separa el citoplasma de una célula eucariota en diferentes compartimentos, lo que permite la función biológica especializada de estos orgánulos. Para llevar las proteínas de carga y las macromoléculas a su destino final en el momento adecuado, se guían numerosas vesículas para que se transporten entre estos orgánulos. Los eventos de tráfico de membranas altamente regulados juegan un papel fundamental en la viabilidad, el desarrollo y el crecimiento de las células. El mecanismo que regula este proceso crucial y complicado aún no se conoce bien.

Aquí se han descrito varios enfoques para observar la localización subcelular de las proteínas de membrana, analizar la colocalización entre dos proteínas de membrana marcadas con diferentes proteínas fluorescentes, monitorear el movimiento dinámico de una proteína de membrana utilizando imágenes de series temporales y recopilar información en 3D sobre una proteína de membrana mediante la realización de imágenes de pila z que cubren toda la célula. Además de los eventos de tráfico de membranas descritos aquí, estos enfoques se pueden aplicar fácilmente a otros procesos biológicos. Por ejemplo, las imágenes de series de tiempo se pueden realizar durante un período a largo plazo (varios días) para monitorear un proceso de desarrollo30. La imagen de la pila z se puede realizar para cuantificar la abundancia de una proteína dentro de una célula30. Además, estos enfoques de imagen pueden combinarse perfectamente con aplicaciones farmacológicas, incluidos varios fármacos, hormonas e incluso señales ambientales, lo que indica que estos enfoques de imagen son fácilmente aplicables a muestras biológicas vivas. Además de la flexibilidad en el tratamiento de la muestra, los métodos aquí descritos requieren solo dispositivos económicamente asequibles, excepto el microscopio confocal, y solo una ligera capacitación del personal en las habilidades técnicas, lo que significa que estos métodos pueden ser ampliamente adoptados.

Se necesita precaución en varios pasos críticos del protocolo. En primer lugar, las concentraciones óptimas de las drogas de tráfico de membrana varían según el material y el tratamiento. Un estudio previo sugiere que 30 μM de BFA es una concentración baja que puede desencadenar la formación característica del cuerpo de BFA sin causar el colapso del aparato de Golgi en los meristemoides20. Del mismo modo, 25 μM Wm es una concentración baja pero efectiva que puede conferir la formación del cuerpo Wm sin dañar gravemente los meristemoides. Cuando se trata un nuevo material (diferentes especies de plantas, diferentes partes de la planta, etc.), las concentraciones de los fármacos deben optimizarse en consecuencia. En segundo lugar, para mantener al máximo el estado fisiológico de las muestras durante el tratamiento, las plántulas se mantienen parcialmente intactas (solo se eliminan los cotiledones) hasta la etapa de obtención de imágenes. Las hojas verdaderas se diseccionan para la preparación del portaobjetos y luego se obtienen imágenes de la muestra. Cada muestra debe tratarse individualmente y el portaobjetos debe hacerse fresco para la obtención de imágenes. Por último, tanto las imágenes de pila z como las imágenes de series temporales requieren un escaneo láser repetido de la muestra. Para minimizar el riesgo de fotoblanqueo y fototoxicidad en las muestras, se recomienda encarecidamente una potencia láser baja.

La alta eficiencia de los eventos de tráfico de membranas está garantizada por la diversidad de las rutas de tráfico y su cinética en respuesta a las condiciones ambientales y de desarrollo específicas de la célula1. Los métodos descritos tienen una resolución espacio-temporal limitada, por lo que están surgiendo técnicas de microscopía óptica más sofisticadas para obtener un conocimiento detallado del tráfico de membrana dentro de una célula eucariota. Por ejemplo, la microscopía de superresolución, incluida la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM), aumentan en gran medida la resolución espacial de una proteína marcada con fluorescencia31,32, aunque solo se pueden analizar muestras fijas; La microscopía de disco giratorio acelera sustancialmente la velocidad de barrido y reduce el fotoblanqueo de las muestras33, aunque es difícil registrar la dinámica de proteínas con baja abundancia utilizando este método; La microscopía de lámina de luz proporciona imágenes 3D rápidas y suaves34,35; y la microscopía de dos fotones permite la detección de señales de fluorescencia de tejidos más profundos35,36, aunque a costa de una resolución ligeramente menor, etc. Además, la biología química ha identificado drogas más específicas que interfieren con ciertas rutas de tráfico. A pesar de las limitaciones, estas técnicas, junto con otras técnicas avanzadas emergentes, mejorarán en gran medida nuestro conocimiento y arrojarán luz sobre los mecanismos del sistema de tráfico de membranas celulares.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (IOS-2217757) (X.Q.) y el Premio de la Fundación Bronson de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS) (H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

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References

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Biología Número 195
Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática
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He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

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