Summary
Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Ökaryotik hücrelerde, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere zar bileşenleri, endomembran sistemi içindeki hedeflerine uzamsal olarak taşınır. Bu, yeni sentezlenen proteinlerin hücre yüzeyine veya hücrenin dışına salgı yoluyla taşınmasını, hücre dışı yüklerin veya plazma zarı bileşenlerinin hücre içine endositik taşınmasını ve yüklerin hücre altı organeller arasında geri dönüştürülmesini veya taşınmasını vb. içerir. Membran kaçakçılığı olayları, tüm ökaryotik hücrelerin gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı düzenlemelere tabidir. Hücre dışı boşluktan ligand sinyallerini algılayan hücre yüzeyi reseptör kinazları hem salgı hem de endositik taşımaya uğrar. Plazma membranı lokalize lösin açısından zengin tekrar reseptör kinazı (ERL1) kullanarak membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlar burada açıklanmaktadır. Yaklaşımlar arasında bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu yer alır. ERL1'in uzay-zamansal regülasyonunu izlemek için bu çalışma, ERL1 ile bir multi-veziküler vücut belirteç proteini olan RFP-Ara7 arasındaki ko-lokalizasyon analizini, bu iki proteinin zaman serisi analizini ve membran kaçakçılığı inhibitörleri brefeldin A ve wortmannin ile tedavi edilen ERL1-YFP'nin z-yığın analizini açıklamaktadır.
Introduction
Membran trafiği, proteinler, lipitler ve diğer biyolojik ürünler dahil olmak üzere membran bileşenlerini (kargolar olarak da bilinir) ökaryotik bir hücre içindeki farklı organeller arasında veya plazma zarı boyunca hücre dışı boşluğa ve hücre dışı boşluğadağıtan korunmuş bir hücresel süreçtir 1. Bu süreç, nükleer zar, endoplazmik retikulum, Golgi aygıtı, vakuol/lizozomlar, plazma zarı ve çoklu endozomlardan oluşan endomembran sistemi adı verilen bir zar ve organeller topluluğu tarafından kolaylaştırılır1. Endomembran sistemi, bu organeller arasında mekik dokuyan dinamik veziküller kullanarak membran bileşenlerinin değiştirilmesini, paketlenmesini ve taşınmasını sağlar. Membran kaçakçılığı olayları, hücre gelişimi, büyümesi ve çevresel adaptasyonu için çok önemlidir ve bu nedenle sıkı ve karmaşık düzenlemeleretabidir 2. Şu anda, moleküler biyoloji, kimyasal biyoloji, mikroskopi ve kütle spektrometresinde çoklu yaklaşımlar geliştirilmiş ve membran kaçakçılığı alanına uygulanmıştır ve endomembran sisteminin uzay-zamansal regülasyonunun anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletmiştir 3,4. Moleküler biyoloji, ilgilenilen proteinin gen ekspresyonunun değiştirilmesi veya ilgilenilen proteinin belirli etiketlerle etiketlenmesi gibi, membran kaçakçılığına dahil olan varsayılan oyuncuların klasik genetik manipülasyonları için kullanılır. Kimyasal biyolojideki araçlar, belirli yolların trafiğine özel olarak müdahale eden moleküllerin kullanımını içerir 4,5. Kütle spektrometresi, biyokimyasal yaklaşımlarla mekanik olarak izole edilmiş bir organeldeki bileşenleri tanımlamak için güçlüdür 3,4. Bununla birlikte, membran trafiği dinamik, çeşitli ve karmaşık bir biyolojik süreçtir1. Canlı hücrelerde membran kaçakçılığı sürecini çeşitli koşullar altında görselleştirmek için ışık mikroskobu önemli bir araçtır. Olayların verimliliğini, kinetiğini ve çeşitliliğini ölçmedeki zorlukların üstesinden gelmek için gelişmiş mikroskop tekniklerinde sürekli ilerleme kaydedilmiştir4. Burada, bu çalışma, doğal olarak basitleştirilmiş ve deneysel olarak erişilebilir bir sistem olan stoma gelişim sürecinde membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için kimyasal/farmakolojik biyoloji, moleküler biyoloji ve mikroskopide yaygın olarak benimsenen metodolojilere odaklanmaktadır.
Stomalar, iç hücreler ve çevre arasındaki gaz alışverişini kolaylaştırmak için açılıp kapanan bitki hava yüzeylerindeki mikro gözeneklerdir 6,7,8. Bu nedenle stomalar, bitkinin hayatta kalması ve büyümesi için çok önemli olan iki olay olan fotosentez ve terleme için gereklidir. Stoma gelişimi, bitkinin çevreye adaptasyonunu optimize etmek için çevresel ipuçlarıyla dinamik olarak ayarlanır9. 2002 yılındaki çalışmalara dayanan reseptör proteini Too Many Mouths'un (TMM) tanımlanması, model bitki Arabidopsis thaliana10'da stoma gelişiminin moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir çağın kapısını açtı. Sadece birkaç on yıl sonra, klasik bir sinyal yolu tanımlandı. Yukarı akıştan aşağı akışa kadar, bu yol, epidermal modelleme faktörleri (EFP) ailesinde bir grup salgı peptit ligandı, EREECTA (ER) ailesinde birkaç hücre yüzeyi lösin açısından zengin tekrar (LRR) reseptör kinazları, LRR reseptör proteini TMM, bir MAPK kaskad ve SUSKUN (SPCH), DILSIZ, FAMA ve SCREAM (SCRM) dahil olmak üzere birkaç bHLH transkripsiyon faktörü içerir11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Önceki çalışmalar, reseptör kinazlardan biri olan ER-LIKE 1'in (ERL1), EPF algısı20 üzerine aktif hücre altı davranışlar gösterdiğini göstermektedir. ERL2 ayrıca plazma zarı ile bazı hücre içi organeller arasında dinamik olarak trafik yapar27. Membran kaçakçılığı adımlarının bloke edilmesi, anormal stoma desenlenmesine neden olarak yaprak yüzeyinde stoma kümelerine neden olur28. Bu sonuçlar, membran trafiğinin stoma gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, bazı membran kaçakçılığı inhibitörleri kullanılarak farmakolojik tedavi ile birlikte protein-protein hücre altı ko-lokalizasyon analizi kullanılarak ERL1 dinamiklerini uzay-zamansal olarak araştırmak için bir protokolü açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Çözeltilerin hazırlanması
- 15 mL ağartıcıyı 35 mL damıtılmış su ve 50 μL Triton X-100 ile karıştırarak tohum sterilizasyon solüsyonu hazırlayın.
- BFA tozunu etanol içinde 10 mM'lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek brefeldin A (BFA) çözeltisini hazırlayın. Wm tozunu DMSO içinde 10 mM'lik (stok) nihai konsantrasyona çözerek wortmannin (Wm) çözeltisini hazırlayın.
2. Tohumların ekilmesi
- Gerekli transgenik bitkilerin her birinden 10-50 tohumu 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine alın. Her tüpe 1 mL tohum sterilizasyon solüsyonu ekleyin ve tüpü bir çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.
- Tohum sterilizasyon solüsyonunu atın ve tohumları beş kez 1 mL otoklavlanmış damıtılmış su ile yıkayın.
- Her tüpe 300 μL otoklavlanmış damıtılmış su ekleyin ve tohumları %1 (a/h) sükroz ve %0,75 (a/h) agar içeren yarı kuvvetli MS ortamına ekin. Ortamı gerektiği gibi karşılık gelen antibiyotiklerle destekleyin.
- Çimlenmeyi senkronize etmek için plakayı 4 °C'de karanlıkta 2 °C'de baş aşağı tutun.
- 2 gün sonra, plakayı 22 °C'de 16 saat ışık/8 saat karanlık döngü (80 μmol/m2/s1) olan bir büyüme odasına aktarın. Bu, çimlenmeden sonraki ilk gün olarak kabul edilir (1 dpg).
- Daha fazla büyüme için fideleri 10 dpg'de toprağa nakledin.
3. Çift renkli F1 transgenik bitkilerin hazırlanması
- ERL1-YFP (bitki A) taşıyan homozigot transgenik bitkileri ve RFP etiketli bir işaretleyici protein RFP-Ara7 (bitki B) 20 taşıyan homozigot transgenik bitkileri, 22 ° C'de 16 saat ışık/8 saat karanlık döngüye (80 μmol / m2 / s1) sahip bir büyüme odasında çiçeklenene kadar yan yana büyütün.
- A bitkisinden genç bir çiçeklenme seçin Genetik haçlar için çiçeklenme üzerinde açılmak üzere olan bir çiçeği tutun. Tüm eski çiçekleri ve silisleri çıkarın. Ek olarak, gelecekteki karışıklığı önlemek için genç çiçekleri ve çiçek meristemlerini dikkatlice çıkarın.
- Bir çift keskin cımbız kullanarak çanak yaprakları, yaprakları ve ercikleri çıkararak açılmamış çiçeği nazikçe inceleyin. Pistili sadece çiçeklenme üzerinde bırakın.
- B bitkisinde açılmış bir çiçekten olgun bir ercik alın ve polen tanelerini A bitkisindeki disseke pistilin stigmasına bırakın.
- Bu elle çaprazlanmış çiçeği babasını, annesini ve genetik çaprazlama tarihini belirterek etiketleyin. Çiçeğin olgunlaşmasına izin verin ve silique sarı/kahverengiye döndüğünde (çaprazlamadan ~20 gün sonra) F1 tohumlarını hasat edin. Hem YFP hem de RFP sinyallerine sahip başarılı bir F1 tesisi olup olmadığını kontrol edin.
4. Farmakolojik tedavi
- BFA işlemi için, 7 günlük fidelerin kotiledonlarını çıkarın, fidelerin geri kalanını sahte bir çözeltiye (%0.3 etanol) veya 30 μM BFA çözeltisine daldırın, 1 dakika vakum uygulayın ve numuneyi 30 dakika daldırın görüntülemeden önce.
- Wortmannin tedavisi için, 7 günlük fidelerin kotiledonlarını çıkarın, fidelerin geri kalanını %0.25 DMSO çözeltisine veya 25 mM wortmannine daldırın, 1 dakika vakum uygulayın ve görüntülemeden önce numuneyi 30 dakika daldırın.
- Numunelerin vakumla işlenmesi için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, karşılık gelen ilaç çözeltisinden 500 μL ekleyin ve diseke edilen fideleri çözeltiye daldırın. Mikrosantrifüj tüpüne 10 mL'lik bir şırıngayı sıkıca takın ve 1 dakika vakum uygulayın (Şekil 1). Şırıngayı çıkarın ve numuneyi gereken süre boyunca çözelti içinde tutun. Görüntüleme hazırlığı için fideleri yavaşça çıkarın.
Şekil 1: Basit vakum cihazı. Vakum işlemi için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mL'lik bir şırınga bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Görüntüleme için numune hazırlama
- Keskin bir tıraş bıçağı kullanarak işlenmiş numuneden gerçek yaprağı inceleyin. Gerçek yaprağı yavaşça bir cam slayt üzerindeki bir damla suya koyun ve abaksiyal tarafı yukarı kaldırın. Herhangi bir kabarcık yakalamaktan kaçınırken gerçek yaprağı bir lamel ile yavaşça örtün.
6. Konfokal görüntüleme
NOT: Bu çalışmada numunelerin floresan sinyalini görüntülemek için bir Leica SP8 ters taramalı konfokal mikroskop kullanılmıştır.
- Işın yolu kurulumu
- YFP uyarımı için 514 nm'lik bir lazer seçin. Sinyal yoğunluğunu artırmak ve böylece yüksek görüntü kalitesi elde etmek için yüksek lazer gücü kullanın. Bununla birlikte, %5'in üzerindeki lazer güçleri foto ağartma riski taşır ve numunenin sağlığı etkilenebilir. Numune sinyali çok loş değilse, düşük lazer yoğunluğunda başlayın.
- Algılama için PMT/HyD'yi açın ve YFP florofor spektrumuna göre üst ve alt emisyon bandı eşiklerini tanımlayın. YFP sinyalini toplamak için 530-570 nm'lik bir algılama penceresi ayarlayın.
- İkinci renk için sıralı görüntüleme: Sıra düğmesine tıklayın ve yeni bir kanal ekleyin. Varsayılan olarak, önceden tasarlanmış YFP ışın yolu Sıra 1 olacaktır. Sıra 2'de, RFP uyarımı için 561 nm'lik bir lazer seçin ve RFP sinyalini toplamak için 570-630 nm'lik bir algılama penceresi ayarlayın.
- Tarama koşulları ayarı (Şekil 2)
- Stoma öncü hücrelerindeki hücre altı membran trafik aktivitesini görüntülemek için, görüntüleme için sistemde 63x/1.2 W Corr lens seçin.
- Biçim, piksel cinsinden görüntü boyutunu ifade eder. 1.024 piksel x 1.024 piksel ile başlayın ve ardından bunu yakınlaştırma faktörüne ve yayın kalitesinde iyi bir çözünürlük için objektif ayarlarına göre optimize edin.
- Hız, lazer her pikselin üzerinden geçerken tarama kafasının hızını ifade eder. Düşük tarama hızları genellikle daha iyi bir sinyal-gürültü oranıyla sonuçlansa da, hızla değişen membran kaçakçılığı olaylarını verimli bir şekilde yakalayamayabilirler. 400 Hz'lik bir hızla başlayın ve bunu örneklerin özel durumuna göre optimize edin.
- Yakınlaştırma faktörü, objektif lensi değiştirmeden ilgilenilen bir bölgeyi yakınlaştırmak için kullanılır. 1 yakınlaştırma faktörü ile başlayın ve bunu denemenin özel ihtiyaçlarına göre optimize edin.
- Satır ortalaması, ortalama bir sonuç elde etmek için her bir X satırının kaç kez taranacağını ifade eder. Daha büyük bir çizgi ortalaması, ortaya çıkan görüntüdeki gürültüyü azaltır, ancak aynı zamanda tarama süresini ve lazer ışığına maruz kalma süresini de artırır. Membran kaçakçılığı olaylarını görüntülemek için yüksek satır ortalaması kullanmayın. 2x çizgi ortalaması ile başlayın ve gerektiği gibi optimize edin.
- Zaman serileri toplama
NOT: Membran kaçakçılığı olaylarını incelerken, hücre altı endozomların hızlı hareketini kaydetmek için genellikle bir zaman serisine ihtiyaç vardır.- Edinme Modunda, zaman serisi yardımcı programını etkinleştirmek için xyt tarama modunu seçin.
- Zaman Aralığı altındaki zaman noktaları arasında bir bekleme süresine karar verin. Alternatif olarak, görüntüleri birbiri ardına hemen çekmek için Küçült'e tıklayın. Aşağıdaki zaman serisi deneyinde 7 s'lik bir zaman aralığı kullanılmıştır.
- Süre'yi seçin ve denemenin çalıştırılacağı toplam süreyi girin. Alternatif olarak, Çerçeveler'i seçerek toplanacak çerçeve sayısını tanımlayın (Şekil 3).
- Tüm hücre içinde membran kaçakçılığı olayıyla ilgili üç boyutlu bilgileri toplamak için Z-yığını tarama modunu kullanın. Z yığını görüntülerinin maksimum yoğunluk projeksiyonu genellikle analiz için kullanılır.
- Edinme Modunda xyz tarama modunu seçin, ardından Z-Stack yardımcı programı erişilebilir hale gelecektir.
- Z çapında seçeneğini belirleyin. Tarama Modu altında, Başlat ve Bitir düğmelerini kullanarak Z yığınının üst görüntüsünü ve alt görüntüsünü tanımlayın.
- Z adımının kalınlığını z adım boyutuna tıklayarak tanımlayın. Alternatif olarak, Z yığınının tüm aralığını kapsamak için kaç görüntü çekileceğini tanımlayın. Numuneler arasında tutarlılığı sağlamak için z adım boyutunu tanımlayın (Şekil 4).
- Görüntü işleme
- Z-yığını görüntülerinin maksimum yoğunluk projeksiyonu, konfokal yazılım (http://www.leica-microsystems.com) tarafından oluşturulur. Birincil İşlem sekmesinde, önce en sol taraftaki Projeleri Aç sekmesinin altındaki ilgili z-stack dosyasını seçin. Ardından, İşlem Araçları adlı orta sekmeye geçin, Projeksiyon işlevini seçin, Yöntem açılır panelinde Maksimum'u seçin ve Uygula düğmesine tıklayın. Açık Projeler sekmesi altında bir z-stack projeksiyon görüntüsü oluşturulacaktır.
- Zaman serisi görüntülerinin videosu Fiji (https://imagej.net/Fiji) tarafından oluşturulmuştur. Dosya sekmesinde, tüm zaman serisi görüntülerini doğru sırada açmak için Aç işlevini kullanın. Görüntü sekmesinde Yığın işlevini bulun ve bir video oluşturmak için Yığılacak görüntüler'i seçin. Dosyayı istediğiniz kare hızıyla ( Video 1 için 5 kare/sn) .avi formatında kaydedin.
Şekil 2: XY boyutunun tarama modu paneli. Tarama modu paneli, görüntü tarama koşullarını ayarlamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: xyt tarama modu altındaki zaman serisi yardımcı programı. Zaman serisi yardımcı programı, bir dizi görüntüyü art arda toplamak için görüntüleme koşullarını ayarlamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: xyz tarama modu altındaki z-stack yardımcı programı. z-stack yardımcı programı, z ekseninde bir dizi görüntü toplamak için görüntüleme koşullarını ayarlamak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki bir çalışma, ERL1'in dinamik membran kaçakçılığı olaylarına maruz kalan aktif bir reseptör kinazolduğunu göstermiştir 20. ERL1, plazma membranı üzerinde bir transmembran LRR reseptör kinazdır. Endoplazmik retikulumda yeni sentezlenen ERL1, Golgi cisimciklerinde işlenir ve daha sonra plazma zarına taşınır. Plazma zarındaki ERL1 molekülleri, hücre dışı LRR alanlarını18 kullanarak EPF ligandlarını algılayabilir. EPF1 dahil olmak üzere inhibitör EPF'ler tarafından aktivasyon üzerine, ERL1 endozomlara içselleştirilir, çoklu veziküler cisimlere (MVB) taşınır ve daha sonra sinyali20 sonlandırmak için bozunma için vakuollere taşınır. Buna karşılık, stoma oluşumunudestekleyen antagonistik EPFL9 ligandı 14, endoplazmik retikulumda ERL1'i tutar. Alternatif olarak, plazma zarı lokalize ERL1, endozomlar ve plazma zarı20 arasında geri dönüşüm yapabilir.
Burada, ERL1 promotörü::ERL1-YFP taşıyan transgenik bitkiler, yukarıda belirtilen protokolü takiben 7 gün boyunca büyütüldü. Yeni ortaya çıktığında, ERL1 sadece genç yapraklarda stoma soy hücrelerinde ifade edildiğinden, gerçek yaprak görüntüleme için diseke edildi20. Beklendiği gibi, dağınık hücreler, ERL1-YFP'nin plazma zarını etiketlediği YFP sinyali ile vurgulandı (Şekil 5). Ek olarak, ERL1'in endozomlara lokalize olduğunu düşündüren çoklu noktasal sinyaller de gözlendi.
Bitki hücrelerindeki çeşitli organeller, trans-Golgi ağı ve MVB'ler gibi bir ışık mikroskobu altında gözlemlendiğinde noktasal floresan sinyalleri olarak bulunur. RFP-Ara7'yi taşıyan MVB belirteç çizgisi, ERL1-YFP transgenik çizgisi ile genetik olarak çaprazlandığında, her iki belirteç proteini de yukarıda tarif edildiği gibi ardışık görüntüleme yaklaşımı kullanılarak gözlendi. Şekil 6'da gösterildiği gibi, RFP-Ara7 hemen hemen tüm hücrelerde çoklu noktasal sinyalleri vurgulayarak bu hücrelerdeki MVB'leri gösterir (Şekil 6B). ERL1-YFP sinyali ile birleşirken, ERL1-YFP-pozitif noktanın çoğu, RFP-Ara7 etiketli noktalama ile örtüşüyordu. Bu sonuç, bazı ERL1-YFP moleküllerinin MVB'lere taşındığını göstermektedir.
Bu hızlı hareket eden endozomların dinamiklerini izlemek için, ERL1-YFP ve RFP-Ara7 taşıyan 7 günlük gerçek yaprakların zaman serisi görüntüleri toplandı (Şekil 7). 203 sn için 7 sn zaman aralıkları uygulandı ve toplanan 30 görüntü Görüntü J'de bir video oluşturmak için kullanıldı (Video 1). Video, ERL1-YFP etiketli endozomların stoma soy hücreleri içinde RFP-Ara7 ile birlikte hareket ettiğini gösterdi ve böylece ERL1-YFP'nin MVB'lere lokalize olduğunu doğruladı.
ERL1 kaçakçılık rotalarını farmakolojik bir yaklaşımla incelemek için, yaygın olarak kullanılan iki membran kaçakçılığı ilacı olan brefeldin A (BFA) ve wortmannin (Wm) uyuşturucunun etkisi analiz edildi. BFA, GNOM dahil olmak üzere ADP-ribozilasyon faktörü guanin-nükleotid değişim faktörlerini inhibe ederek, membran proteinlerinin endozomal geri dönüşümünü ve endositozunu bloke edebilir29. BFA çözeltisine 30 dakika maruz kaldıktan sonra, BFA cisimcikleri olarak bilinen bazı büyük bölmelerde ERL1-YFP tespit edildi (Şekil 8B, C). Bu, ERL1 kaçakçılığının BFA tarafından engellenebileceğini gösterir, bu da ERL1'in geri dönüşüm veya endositoza maruz kaldığını düşündürür. Wm, fosfatidilinositol-3 ve fosfatidilinositol-4 kinazları inhibe edebilir ve böylece MVB'lerin5'in füzyonuna neden olabilir. 30 dakika boyunca Wm ile muamele edildiğinde, tipik olarak Wm cisimleri olarak adlandırılan ERL1-YFP ile vurgulanan bazı halka benzeri yapılar gözlenmiştir (Şekil 8C). Bu sonuç, ERL1-YFP'nin MVB'lere taşındığını gösterir, böylece ERL1'in bozunma için vakuollere giden yolu izlediğini düşündürür.
Şekil 5: ERL1-YFP'nin tek düzlem görüntüsü. (A) Floresan görüntüsü, (B) parlak alan görüntüsü ve (C) birleştirilmiş görüntü, ERL1-YFP'nin plazma zarını ve stoma soy hücreleri içindeki bazı oldukça hareketli punktatları etiketlediğini göstermektedir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ERL1-YFP ve RFP-Ara7'nin sıralı görüntüleri. (A) ERL1-YFP ve (B) RFP-Ara7'nin her ikisi de hücre içindeki noktalama sinyallerini etiketler. (C) birleştirilmiş görüntüdeki ve (D) iç görüntüdeki beyaz nokta, iki proteinin stoma soy hücreleri içindeki MVB'ler üzerinde birlikte lokalize olduğunu gösterir. Beyaz oklar, hem ERL1-YFP hem de RFP-Ara7 tarafından etiketlenen endozomları gösterir. Kırmızı oklar, RFP-Ara7 tarafından etiketlenen endozomları gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: ERL1-YFP ve RFP-Ara7'nin zaman serisi görüntüleri. Görüntüler 7 sn zaman aralığı ile çekilmiştir. Her görüntünün zaman noktası sol üst köşede gösterilir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: ERL1-YFP'nin Z-yığın görüntüleri. (A, B) (A) sahte veya (B) BFA ile işlenmiş ERL1-YFP tesislerinin Z-yığını görüntüleri. Sağ üst köşedeki sayılar, görüntünün z yığınındaki konumunu yukarıdan aşağıya doğru gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. (C) Sağ üst köşede gösterildiği gibi, sahte veya BFA çözeltisi ve sahte veya Wm çözeltisi ile işlenmiş ERL1-YFP'nin z-yığını görüntülerinin projeksiyonu. Oklar, ilaçların neden olduğu ERL1-YFP'nin agregasyon gövdelerini gösterir. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: ERL1-YFP ve RFP-Ara7'nin zaman serisi görüntülerinin videosu. ERL1-YFP ve RFP-Ara7'nin zaman serisi görüntüleri, Fiji kullanılarak 5 kare/sn hızında bir videoya yığılır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endomembran sistemi, ökaryotik bir hücrenin sitoplazmasını farklı bölmelere ayırır ve bu da bu organellerin özel biyolojik işlevini sağlar. Kargo proteinlerini ve makromolekülleri nihai varış yerlerine doğru zamanda ulaştırmak için, çok sayıda vezikül bu organeller arasında mekik dokumak üzere yönlendirilir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş membran kaçakçılığı olayları, hücrelerin canlılığında, gelişmesinde ve büyümesinde temel roller oynar. Bu önemli ve karmaşık süreci düzenleyen mekanizma hala tam olarak anlaşılamamıştır.
Burada, membran proteinlerinin hücre altı lokalizasyonunu gözlemlemek, farklı floresan proteinleri ile etiketlenmiş iki membran proteini arasındaki birlikte lokalizasyonu analiz etmek, zaman serisi görüntüleri kullanarak bir membran proteininin dinamik hareketini izlemek ve tüm hücreyi kapsayan z-yığını görüntüleme gerçekleştirerek bir membran proteini hakkında 3D bilgi toplamak için çeşitli yaklaşımlar açıklanmıştır. Burada açıklanan membran kaçakçılığı olaylarının yanı sıra, bu yaklaşımlar diğer biyolojik süreçlere de kolayca uygulanabilir. Örneğin, zaman serisi görüntüleme, gelişimsel bir süreci izlemek için uzun vadeli bir süre (birkaç gün) boyunca gerçekleştirilebilir30. Z-yığını görüntüleme, bir hücre30 içindeki bir proteinin bolluğunu ölçmek için gerçekleştirilebilir. Ek olarak, bu görüntüleme yaklaşımları, çeşitli ilaçlar, hormonlar ve hatta çevresel ipuçları dahil olmak üzere farmakolojik uygulamalarla mükemmel bir şekilde birleşebilir, bu da bu görüntüleme yaklaşımlarının canlı biyolojik örneklere kolayca uygulanabilir olduğunu gösterir. Numune tedavisindeki esnekliğin yanı sıra, burada açıklanan yöntemler, konfokal mikroskop dışında yalnızca ekonomik olarak uygun fiyatlı cihazlar ve personelin teknik beceriler konusunda yalnızca hafif bir eğitim gerektirmesini gerektirir, bu nedenle bu yöntemlerin yaygın olarak benimsenebileceği anlamına gelir.
Protokolün birkaç kritik adımında dikkatli olunması gerekir. İlk olarak, membran kaçakçılığı ilaçlarının optimal konsantrasyonları, malzemeye ve tedaviye bağlı olarak değişir. Önceki bir çalışma, 30 μM BFA'nın, meristemoidlerde20 Golgi aygıtının çökmesine neden olmadan karakteristik BFA vücut oluşumunu tetikleyebilen düşük bir konsantrasyon olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, 25 μM Wm, meristemoidlere ciddi şekilde zarar vermeden Wm vücut oluşumunu sağlayabilen düşük ama etkili bir konsantrasyondur. Yeni bir materyal (farklı bitki türleri, bitkinin farklı kısımları vb.) işlendiğinde, ilaçların konsantrasyonlarının buna göre optimize edilmesi gerekir. İkincisi, tedavi sırasında numunelerin fizyolojik durumunu maksimum ölçüde korumak için, fideler görüntüleme adımına kadar kısmen bozulmadan tutulur (sadece kotiledonlar çıkarılır). Gerçek yapraklar slayt hazırlama için parçalara ayrılır ve numune daha sonra görüntülenir. Her numunenin ayrı ayrı işlenmesi ve lamın görüntüleme için yeni yapılması gerekir. Son olarak, hem z-yığını görüntüleme hem de zaman serisi görüntüleme, numunenin tekrar tekrar lazer taramasını gerektirir. Numunelerde fotoağartma ve fototoksisite riskini en aza indirmek için düşük lazer gücü şiddetle tavsiye edilir.
Membran kaçakçılığı olaylarının yüksek verimliliği, hücre1'in spesifik gelişimsel ve çevresel koşullarına yanıt olarak kaçakçılık yollarının ve kinetiklerinin çeşitliliği ile sağlanır. Açıklanan yöntemler sınırlı uzay-zamansal çözünürlüğe sahiptir, bu nedenle ökaryotik bir hücre içindeki zar trafiği hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için daha karmaşık ışık mikroskobu teknikleri ortaya çıkmaktadır. Örneğin, stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ve fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) dahil olmak üzere süper çözünürlüklü mikroskopi, floresan etiketli bir proteinin uzamsal çözünürlüğünü büyük ölçüde artırır31,32, ancak yalnızca sabit numuneler analiz edilebilir; Dönen disk mikroskobu, tarama hızını önemli ölçüde hızlandırır ve numunelerinfotoağartmasını azaltır 33, ancak bu yöntemi kullanarak düşük bolluğa sahip proteinlerin dinamiklerini kaydetmek zordur; ışık tabakası mikroskobu hızlı ve hassas 3D görüntüleme sağlar34,35; ve iki foton mikroskobu, daha derin dokulardan35,36 gelen floresan sinyallerinin tespit edilmesini sağlar, ancak biraz daha düşük çözünürlük pahasına, vb. Ek olarak, kimyasal biyoloji, belirli kaçakçılık yollarına müdahale eden daha spesifik ilaçlar tanımlamıştır. Sınırlamalara rağmen, bu teknikler ortaya çıkan diğer ileri tekniklerle birlikte bilgimizi büyük ölçüde geliştirecek ve hücre zarı kaçakçılığı sisteminin mekanizmalarına ışık tutacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (IOS-2217757) (X.Q.) ve Arkansas Üniversitesi Tıp Bilimleri (UAMS) Bronson Vakfı Ödülü (H.Z.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
References
- Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
- Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
- Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
- Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
- Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
- Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
- Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
- Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
- Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
- Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
- Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
- Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
- Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
- Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
- Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
- Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
- Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
- Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
- Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
- Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
- MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
- Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
- Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
- Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
- Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
- Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
- Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
- Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
- Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
- Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R.
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
- Nwaneshiudu, A., et al.
- Sanderson, J.
