Summary
Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.
Abstract
In eukaryotischen Zellen werden Membrankomponenten, darunter Proteine und Lipide, innerhalb des Endomembransystems räumlich und zeitlich an ihren Bestimmungsort transportiert. Dazu gehören der sekretorische Transport von neu synthetisierten Proteinen an die Zelloberfläche oder die Außenseite der Zelle, der endozytäre Transport von extrazellulären Ladungen oder Plasmamembrankomponenten in die Zelle und das Recycling oder der Shuttletransport von Ladungen zwischen den subzellulären Organellen usw. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Entwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt aller eukaryotischen Zellen und unterliegen daher einer strengen Regulierung. Zelloberflächenrezeptorkinasen, die Ligandensignale aus dem extrazellulären Raum wahrnehmen, durchlaufen sowohl sekretorischen als auch endozytären Transport. Häufig verwendete Ansätze zur Untersuchung der Membrantransportereignisse unter Verwendung einer Plasmamembran-lokalisierten Leucin-Rich-Repeat-Rezeptorkinase, ERL1, werden hier beschrieben. Zu den Ansätzen gehören die Vorbereitung des Pflanzenmaterials, die pharmakologische Behandlung und die konfokale Bildgebung. Um die räumlich-zeitliche Regulation von ERL1 zu überwachen, beschreibt diese Arbeit die Kolokalisationsanalyse zwischen ERL1 und einem multivesikulären Körpermarkerprotein, RFP-Ara7, die Zeitreihenanalyse dieser beiden Proteine und die Z-Stapel-Analyse von ERL1-YFP, die mit den Membrantransportinhibitoren Brefeldin A und Wortmannin behandelt wurde.
Introduction
Der Membrantransport ist ein konservierter zellulärer Prozess, der Membrankomponenten (auch bekannt als Frachten), einschließlich Proteine, Lipide und andere biologische Produkte, zwischen verschiedenen Organellen innerhalb einer eukaryotischen Zelle oder über die Plasmamembran zum und vom extrazellulären Raum verteilt1. Dieser Prozess wird durch eine Ansammlung von Membranen und Organellen erleichtert, die als Endomembransystem bezeichnet werden und aus der Kernmembran, dem endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi-Apparat, den Vakuolen/Lysosomen, der Plasmamembran und mehreren Endosomen bestehen1. Das Endomembransystem ermöglicht die Modifikation, Verpackung und den Transport von Membrankomponenten mithilfe dynamischer Vesikel, die zwischen diesen Organellen pendeln. Membrantransportereignisse sind entscheidend für die Zellentwicklung, das Wachstum und die Anpassung an die Umwelt und unterliegen daher einer strengen und komplexen Regulierung2. Derzeit wurden mehrere Ansätze in der Molekularbiologie, der chemischen Biologie, der Mikroskopie und der Massenspektrometrie entwickelt und auf das Gebiet des Membrantransports angewendet und haben das Verständnis der raumzeitlichen Regulation des Endomembransystems erheblich vorangebracht 3,4. Die Molekularbiologie wird für klassische genetische Manipulationen der mutmaßlichen Akteure verwendet, die am Membrantransport beteiligt sind, wie z. B. die Veränderung der Genexpression des interessierenden Proteins oder die Markierung des interessierenden Proteins mit bestimmten Markierungen. Zu den Werkzeugen in der chemischen Biologie gehört die Verwendung von Molekülen, die spezifisch in den Verkehr bestimmter Routen eingreifen 4,5. Die Massenspektrometrie ist leistungsfähig für die Identifizierung der Komponenten in einer Organelle, die durch biochemische Ansätze mechanisch isoliert wurde 3,4. Der Membranverkehr ist jedoch ein dynamischer, vielfältiger und komplexer biologischer Prozess1. Um den Prozess des Membrantransports in lebenden Zellen unter verschiedenen Bedingungen sichtbar zu machen, ist die Lichtmikroskopie ein wesentliches Werkzeug. Kontinuierliche Fortschritte wurden bei fortschrittlichen Mikroskoptechniken erzielt, um die Herausforderungen bei der Messung der Effizienz, Kinetik und Vielfalt der Ereignisse zu bewältigen4. Hier konzentriert sich diese Studie auf die weit verbreiteten Methoden in der chemischen/pharmakologischen Biologie, Molekularbiologie und Mikroskopie, um Membrantransportereignisse in einem natürlich vereinfachten und experimentell zugänglichen System, dem stomatären Entwicklungsprozess, zu untersuchen.
Spaltöffnungen sind Mikroporen auf pflanzlichen Luftoberflächen, die sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch zwischen den inneren Zellen und der Umgebung zu erleichtern 6,7,8. Daher sind Spaltöffnungen essentiell für die Photosynthese und Transpiration, zwei Ereignisse, die für das Überleben und Wachstum von Pflanzen entscheidend sind. Die Stomaentwicklung wird dynamisch durch Umwelteinflüsse angepasst, um die Anpassung der Pflanze an die Umgebung zu optimieren9. Die Identifizierung des Rezeptorproteins Too Many Mouths (TMM) aus dem Jahr 2002 eröffnete eine neue Ära der Erforschung der molekularen Mechanismen der Stomataentwicklung in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana10. Bereits nach wenigen Jahrzehnten wurde ein klassischer Signalweg identifiziert. Von Upstream zu Downstream umfasst dieser Signalweg eine Gruppe von sekretorischen Peptidliganden aus der Familie der epidermalen Musterungsfaktoren (EFP), mehrere Zelloberflächen-Leucin-Rich-Repeat (LRR)-Rezeptorkinasen in der EREECTA (ER)-Familie, das LRR-Rezeptorprotein TMM, eine MAPK-Kaskade und mehrere bHLH-Transkriptionsfaktoren, darunter SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA und SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass eine der Rezeptorkinasen, ER-LIKE 1 (ERL1), aktives subzelluläres Verhalten bei EPF-Wahrnehmung zeigt20. ERL2 transportiert auch dynamisch zwischen der Plasmamembran und einigen intrazellulären Organellen27. Die Blockierung der Membrantransportschritte führt zu einer abnormen Stomatamusterbildung, die zu Stomataclustern auf der Blattoberflächeführt 28. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Membranverkehr eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung der Spaltöffnungen spielt. Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur räumlichen und zeitlichen Untersuchung der ERL1-Dynamik mittels Protein-Protein-Subzellulär-Kolokalisationsanalyse in Kombination mit pharmakologischer Behandlung mit einigen Membrantransportinhibitoren.
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Protocol
1. Vorbereitung der Lösungen
- Bereiten Sie die Saatgutsterilisationslösung vor, indem Sie 15 ml Bleichmittel mit 35 ml destilliertem Wasser und 50 μl Triton X-100 mischen.
- Bereiten Sie Brefeldin A (BFA)-Lösung vor, indem Sie das BFA-Pulver in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen. Bereiten Sie die Wortmannin (Wm)-Lösung vor, indem Sie das Wm-Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 10 mM (Stamm) auflösen.
2. Aussaat der Samen
- Aliquotieren Sie 10-50 Samen von jeder der erforderlichen transgenen Pflanzen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 ml Saatgutsterilisationslösung in jedes Röhrchen und mischen Sie es gründlich, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Schüttler umdrehen.
- Entsorgen Sie die Samensterilisationslösung und waschen Sie die Samen fünfmal mit 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser.
- Geben Sie 300 μl autoklaviertes destilliertes Wasser in jedes Röhrchen und säen Sie die Samen auf halbstarken MS-Medien mit 1 % (w/v) Saccharose und 0,75 % (w/v) Agar. Ergänzen Sie das Medium bei Bedarf mit den entsprechenden Antibiotika.
- Bewahren Sie die Platte 2 Tage lang kopfüber bei 4 °C im Dunkeln auf, um die Keimung zu synchronisieren.
- Nach 2 Tagen wird die Platte in einen Wachstumsraum mit einem 16 h Licht/8 h Dunkelzyklus (80 μmol/m2/s1) bei 22 °C überführt. Dies gilt als der erste Tag nach der Keimung (1 dpg).
- Verpflanze die Sämlinge mit 10 dpg in die Erde, um weiter wachsen zu können.
3. Herstellung von zweifarbigen transgenen F1-Pflanzen
- In einem Wachstumsraum mit einem Zyklus von 16 h Licht / 8 h (80 μmol/m2/s1) bei 22 °C werden homozygote transgene Pflanzen, die ein RFP-markiertes Markerprotein RFP-Ara7 (Pflanze B)20 tragen, und homozygote transgene Pflanzen, die ein RFP-markiertes Markerprotein RFP-Ara7 (Pflanze B)20 tragen, bis zur Blüte nebeneinander gezüchtet.
- Wähle einen jungen Blütenstand von Pflanze A. Behalte eine Blüte, die sich gerade auf dem Blütenstand öffnet, für genetische Kreuzungen. Entferne alle älteren Blüten und Siliques. Entfernen Sie außerdem vorsichtig die jüngeren Blüten und Blütenmeristeme, um zukünftige Verwechslungen zu vermeiden.
- Zerlege die ungeöffnete Blüte vorsichtig, indem du die Kelchblätter, Blütenblätter und Staubblätter mit einer scharfen Pinzette entfernst. Lassen Sie den Stempel nur am Blütenstand.
- Nimm ein reifes Staubblatt von einer geöffneten Blüte auf Pflanze B und lege die Pollenkörner auf die Narbe des präparierten Stempels von Pflanze A.
- Beschriften Sie diese manuell gekreuzte Blume, indem Sie ihren Vater, ihre Mutter und das Datum der genetischen Kreuzung angeben. Lassen Sie die Blüte reifen und ernten Sie die F1-Samen, wenn die Kieselsäure gelb/braun wird (~20 Tage nach der Kreuzung). Prüfen Sie, ob es sich um eine erfolgreiche F1-Anlage handelt, die sowohl YFP- als auch RFP-Signale enthält.
4. Pharmakologische Behandlung
- Für die BFA-Behandlung werden die Keimblätter von 7 Tage alten Keimlingen entfernt, der Rest der Keimlinge entweder in eine Scheinlösung (0,3 % Ethanol) oder eine 30 μM BFA-Lösung getaucht, 1 Minute lang Vakuum angelegt und die Probe vor der Bildgebung 30 Minuten lang eingetaucht.
- Für die Wortmannin-Behandlung entfernen Sie die Keimblätter von 7 Tage alten Sämlingen, tauchen Sie den Rest der Keimlinge entweder in 0,25%ige DMSO-Lösung oder 25 mM Wortmannin, legen Sie 1 Minute lang Vakuum an und lassen Sie die Probe 30 Minuten lang eingetaucht, bevor Sie sie bebildern.
- Für die Vakuumbehandlung von Proben werden in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 500 μl der entsprechenden Arzneimittellösung hinzugefügt und die präparierten Keimlinge in die Lösung getaucht. Befestigen Sie eine 10-ml-Spritze fest am Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie 1 Minute lang Vakuum an (Abbildung 1). Entfernen Sie die Spritze und bewahren Sie die Probe für die erforderliche Zeit in der Lösung auf. Nimm die Sämlinge vorsichtig heraus, um sie bildgebend vorzubereiten.
Abbildung 1: Einfaches Vakuumgerät. Für die Vakuumbehandlung wird eine 10-ml-Spritze an ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen angeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
5. Probenvorbereitung für die Bildgebung
- Sezieren Sie das echte Blatt der behandelten Probe mit einer scharfen Rasierklinge. Lege das echte Blatt vorsichtig in einen Wassertropfen auf einen Objektträger und halte die abaxiale Seite nach oben. Decken Sie das echte Blatt langsam mit einem Deckglas ab und vermeiden Sie es, Blasen einzufangen.
6. Konfokale Bildgebung
HINWEIS: In dieser Arbeit wurde ein inverses konfokales Scanning-Mikroskop Leica SP8 verwendet, um das Fluoreszenzsignal der Proben abzubilden.
- Einrichtung des Strahlwegs
- Wählen Sie einen 514-nm-Laser für die YFP-Anregung. Verwenden Sie eine hohe Laserleistung, um die Signalintensität zu erhöhen und so eine hohe Bildqualität zu erzielen. Bei Laserleistungen über 5 % besteht jedoch die Gefahr eines Photobleichens, und die Gesundheit der Probe kann beeinträchtigt werden. Wenn das Probensignal nicht zu schwach ist, beginnen Sie mit niedriger Laserintensität.
- Schalten Sie PMT/HyD für die Detektion ein und definieren Sie die oberen und unteren Emissionsbandschwellen basierend auf dem Spektrum für den YFP-Fluorophor. Stellen Sie ein Detektionsfenster von 530-570 nm ein, um das YFP-Signal zu erfassen.
- Sequenzielle Bildgebung für die zweite Farbe: Klicken Sie auf die Schaltfläche Seq und fügen Sie einen neuen Kanal hinzu. Standardmäßig ist der zuvor entworfene YFP-Strahlengang Seq 1. Wählen Sie in Seq 2 einen 561-nm-Laser für die RFP-Anregung aus und stellen Sie ein Detektionsfenster von 570-630 nm ein, um das RFP-Signal zu erfassen.
- Einrichten der Scanbedingungen (Abbildung 2)
- Um die Aktivität des subzellulären Membranverkehrs in den Stomata-Vorläuferzellen abzubilden, wählen Sie eine 63x/1,2-W-Corr-Linse auf dem System für die Bildgebung.
- Das Format bezieht sich auf die Bildgröße in Pixeln. Beginnen Sie mit 1.024 x 1.024 Pixeln und optimieren Sie diese dann anhand des Zoomfaktors und der Objektiveinstellungen für eine gute Auflösung der Publikationsqualität.
- Die Geschwindigkeit bezieht sich auf die Geschwindigkeit des Scankopfes, wenn der Laser über jedes Pixel fährt. Obwohl langsame Scangeschwindigkeiten oft zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis führen, können sie die sich schnell ändernden Membranverkehrsereignisse möglicherweise nicht effizient erfassen. Beginnen Sie mit einer Geschwindigkeit von 400 Hz und optimieren Sie diese basierend auf der spezifischen Situation der Proben.
- Der Zoomfaktor wird verwendet, um einen Interessenbereich zu vergrößern, ohne das Objektiv zu wechseln. Beginnen Sie mit einem Zoomfaktor von 1 und optimieren Sie diesen basierend auf den spezifischen Anforderungen des Experiments.
- Der Zeilendurchschnitt bezieht sich darauf, wie oft jede X-Linie gescannt wird, um ein durchschnittliches Ergebnis zu erhalten. Ein größerer Linienmittelwert reduziert das Rauschen im resultierenden Bild, erhöht aber auch die Scanzeit und die Belichtungszeit für das Laserlicht. Verwenden Sie zum Abbilden von Membrantransportereignissen keinen hohen Liniendurchschnitt. Beginnen Sie mit einem 2-fachen Liniendurchschnitt und optimieren Sie nach Bedarf.
- Erfassen einer Zeitreihe
HINWEIS: Bei der Untersuchung von Membrantransportereignissen wird häufig eine Zeitreihe benötigt, um die schnelle Bewegung der subzellulären Endosomen aufzuzeichnen.- Wählen Sie im Erfassungsmodus den xyt-Scanmodus aus, um das Zeitreihendienstprogramm zu aktivieren.
- Legen Sie unter Zeitintervall eine Wartezeit zwischen den Zeitpunkten fest. Alternativ können Sie auch auf Minimieren klicken, um die Bilder sofort nacheinander aufzunehmen. Im folgenden Zeitreihenexperiment wurde ein Zeitintervall von 7 s verwendet.
- Wählen Sie Dauer aus, und geben Sie die Gesamtzeit für die Ausführung des Experiments ein. Alternativ können Sie die Anzahl der zu erfassenden Frames definieren, indem Sie Frames auswählen (Abbildung 3).
- Um die dreidimensionalen Informationen über das Membrantransportereignis innerhalb der gesamten Zelle zu sammeln, verwenden Sie den Z-Stapel-Scan-Modus. Für die Analyse wird häufig die Projektion mit maximaler Intensität der Z-Stapelbilder verwendet.
- Wählen Sie den xyz-Scanmodus im Erfassungsmodus aus, und dann wird auf das Dienstprogramm Z-Stapel zugegriffen.
- Wählen Sie die Option Z-breit aus. Definieren Sie im Scan-Modus das obere und das untere Bild des Z-Stapels mit den Schaltflächen " Anfang " und " Ende" .
- Definieren Sie die Dicke des z-Schritts, indem Sie auf z-Schrittgröße klicken. Alternativ können Sie festlegen, wie viele Bilder aufgenommen werden sollen, um den gesamten Bereich des Z-Stapels abzudecken. Um die Konsistenz zwischen den Proben sicherzustellen, definieren Sie die z-Schrittweite (Abbildung 4).
- Bildverarbeitung
- Die maximale Intensitätsprojektion der Z-Stack-Bilder wird von der konfokalen Software (http://www.leica-microsystems.com) erzeugt. Wählen Sie auf der primären Registerkarte "Prozess " zunächst die gewünschte Z-Stack-Datei unter der Registerkarte " Projekte öffnen" ganz links aus. Wechseln Sie dann zur mittleren Registerkarte mit dem Namen Prozesswerkzeuge, wählen Sie die Projektionsfunktion , wählen Sie Maximum im Dropdown-Bereich von Methode und klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden . Ein Z-Stapel-Projektionsbild wird auf der Registerkarte "Projekte öffnen" generiert.
- Das Video der Zeitreihenbilder stammt von Fidschi (https://imagej.net/Fiji). Verwenden Sie auf der Registerkarte Datei die Funktion Öffnen , um alle Zeitreihenbilder in der richtigen Reihenfolge zu öffnen. Suchen Sie auf der Registerkarte Bild die Funktion Stapeln , und wählen Sie Zu stapelnde Bilder aus , um ein Video zu generieren. Speichern Sie die Datei im .avi-Format mit der gewünschten Bildrate (5 Bilder/s für Video 1).
Abbildung 2: Der Scan-Modus-Bereich der XY-Bemaßung. Das Bedienfeld "Scanmodus" wird verwendet, um die Bedingungen für das Scannen von Bildern einzurichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Das Zeitreihendienstprogramm im xyt-Scan-Modus. Das Zeitreihendienstprogramm wird verwendet, um die Bildverarbeitungsbedingungen einzurichten, um eine Reihe von Bildern nacheinander zu erfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Das Z-Stack-Dienstprogramm im xyz-Scan-Modus. Das Z-Stapel-Dienstprogramm wird verwendet, um die Bildgebungsbedingungen einzurichten, um eine Reihe von Bildern auf der Z-Achse zu erfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
Eine frühere Studie deutete darauf hin, dass ERL1 eine aktive Rezeptorkinase ist, die dynamische Membrantransportereignisse durchläuft20. ERL1 ist eine Transmembran-LRR-Rezeptorkinase auf der Plasmamembran. Neu synthetisiertes ERL1 im endoplasmatischen Retikulum wird in den Golgi-Körpern prozessiert und weiter zur Plasmamembran transportiert. Die ERL1-Moleküle auf der Plasmamembran können EPF-Liganden mit Hilfe ihrer extrazellulären LRR-Domäne18 wahrnehmen. Nach der Aktivierung durch die inhibitorischen EPFs, einschließlich EPF1, wird ERL1 in Endosomen internalisiert, zu den multivesikulären Körpern (MVB) transportiert und dann zur Degradation in die Vakuolen transportiert, um das Signal20 zu beenden. Im Gegensatz dazu hält der antagonistische EPFL9-Ligand, der die Stomatabildung14 fördert, ERL1 im endoplasmatischen Retikulum zurück. Alternativ kann das Plasmamembran-lokalisierte ERL1 zwischen Endosomen und der Plasmamembran20 recyceln.
Hier wurden transgene Pflanzen mit ERL1-Promotor: :ERL1-YFP 7 Tage lang nach dem oben genannten Protokoll gezüchtet. Als das echte Blatt gerade erst auftauchte, wurde es für die Bildgebung präpariert, da ERL1 nur in stomatalen Abstammungszellen in jungen Blättern exprimiertwird 20. Wie erwartet, wurden die verstreuten Zellen durch das YFP-Signal hervorgehoben, wobei ERL1-YFP die Plasmamembran markierte (Abbildung 5). Darüber hinaus wurden auch mehrere punktförmige Signale beobachtet, was darauf hindeutet, dass ERL1 auch in den Endosomen lokalisiert war.
Mehrere Organellen in Pflanzenzellen zeigen sich als punktförmige Fluoreszenzsignale, wenn sie unter dem Lichtmikroskop betrachtet werden, wie z. B. das trans-Golgi-Netzwerk und die MVBs. Wenn die MVB-Markerlinie mit RFP-Ara7 genetisch mit der transgenen ERL1-YFP-Linie gekreuzt wurde, wurden beide Markerproteine mit dem oben beschriebenen sequenziellen Bildgebungsansatz beobachtet. Wie in Abbildung 6 gezeigt, markierte RFP-Ara7 mehrere punktförmige Signale in fast allen Zellen, was auf die MVBs in diesen Zellen hinwies (Abbildung 6B). Bei der Verschmelzung mit dem ERL1-YFP-Signal überlappte der größte Teil des ERL1-YFP-positiven Punktes mit dem RFP-Ara7-markierten Punktat. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass einige der ERL1-YFP-Moleküle zu den MVBs transportiert werden.
Um die Dynamik dieser sich schnell bewegenden Endosomen zu verfolgen, wurden Zeitreihenbilder der 7 Tage alten echten Blätter mit ERL1-YFP und RFP-Ara7 gesammelt (Abbildung 7). Für 203 s wurden Zeitintervalle von 7 s angewendet, und die gesammelten 30 Bilder wurden verwendet, um ein Video in Bild J (Video 1) zu erzeugen. Das Video zeigte, dass sich ERL1-YFP-markierte Endosomen zusammen mit RFP-Ara7 innerhalb der stomatalen Stammzellen bewegten, was bestätigte, dass ERL1-YFP in den MVBs lokalisiert war.
Um die ERL1-Transportrouten mit einem pharmakologischen Ansatz zu untersuchen, wurde die Wirkung von zwei häufig verwendeten Membrantransportmedikamenten, Brefeldin A (BFA) und Wortmannin (Wm), analysiert. BFA kann durch Hemmung des ADP-Ribosylierungsfaktors Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, einschließlich GNOM, das endosomale Recycling und die Endozytose von Membranproteinen blockieren29. Nach 30-minütiger Exposition gegenüber der BFA-Lösung wurde ERL1-YFP in einigen großen Kompartimenten, die als BFA-Körper bekannt sind, nachgewiesen (Abbildung 8B, C). Dies deutet darauf hin, dass der ERL1-Transport durch BFA blockiert werden kann, was darauf hindeutet, dass ERL1 recycelt oder endozytosiert wird. Wm kann die Phosphatidylinositol-3- und Phosphatidylinositol-4-Kinasen hemmen und bewirkt so die Fusion von MVBs5. Bei einer Behandlung mit Wm für 30 Minuten wurden einige ringförmige Strukturen beobachtet, die durch ERL1-YFP hervorgehoben werden und typischerweise als Wm-Körper bezeichnet werden (Abbildung 8C). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass ERL1-YFP zu MVBs transportiert wird, was darauf hindeutet, dass ERL1 dem Weg zu Vakuolen zum Abbau folgt.
Abbildung 5: Einzelebenenbild von ERL1-YFP. (A) Das Fluoreszenzbild, (B) das Hellfeldbild und (C) das zusammengeführte Bild zeigen, dass ERL1-YFP die Plasmamembran und einige hochmobile Punkte innerhalb der Stomatazellen markiert. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Sequenzielle Aufnahmen von ERL1-YFP und RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP und (B) RFP-Ara7 markieren beide punktförmige Signale innerhalb der Zelle. Das weiße Punktat in (C) dem verschmolzenen Bild und (D) dem eingefügten Bild zeigt an, dass die beiden Proteine auf den MVBs innerhalb der Stomatazellen kolokalisieren. Die weißen Pfeile zeigen Endosomen an, die sowohl mit ERL1-YFP als auch mit RFP-Ara7 markiert sind. Die roten Pfeile zeigen Endosomen an, die mit RFP-Ara7 markiert sind. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Zeitreihenbilder von ERL1-YFP und RFP-Ara7. Die Bilder wurden mit einem Zeitintervall von 7 s aufgenommen. Der Zeitpunkt jedes Bildes wird in der oberen linken Ecke angezeigt. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Z-Stack-Bilder von ERL1-YFP. (A, B) Z-Stack-Bilder der ERL1-YFP-Pflanzen, die mit (A) Mock oder (B) BFA behandelt wurden. Die Zahlen in der oberen rechten Ecke geben die Position des Bildes im Z-Stapel von oben nach unten an. Maßstab: 10 μm. (C) Projektion der Z-Stapel-Bilder von ERL1-YFP, die mit Mock- oder BFA-Lösung und Mock- oder Wm-Lösung behandelt wurden, wie in der oberen rechten Ecke angegeben. Die Pfeile zeigen die Aggregationskörper von ERL1-YFP, die durch die Medikamente verursacht werden. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Video der Zeitreihenbilder von ERL1-YFP und RFP-Ara7. Die Zeitreihenbilder von ERL1-YFP und RFP-Ara7 werden mit Fidschi mit einer Geschwindigkeit von 5 Bildern/s zu einem Video gestapelt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Das Endomembransystem trennt das Zytoplasma einer eukaryotischen Zelle in verschiedene Kompartimente, was die spezialisierte biologische Funktion dieser Organellen ermöglicht. Um Frachtproteine und Makromoleküle zum richtigen Zeitpunkt an ihren endgültigen Bestimmungsort zu bringen, werden zahlreiche Vesikel zwischen diesen Organellen hin- und hergeleitet. Hochregulierte Membrantransportereignisse spielen eine grundlegende Rolle für die Lebensfähigkeit, Entwicklung und das Wachstum von Zellen. Der Mechanismus, der diesen wichtigen und komplizierten Prozess reguliert, ist noch wenig verstanden.
Hier wurden mehrere Ansätze beschrieben, um die subzelluläre Lokalisation von Membranproteinen zu beobachten, die Kolokalisation zwischen zwei Membranproteinen zu analysieren, die mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen markiert sind, die dynamische Bewegung eines Membranproteins anhand von Zeitreihenbildern zu überwachen und 3D-Informationen über ein Membranprotein zu sammeln, indem Z-Stapel-Bildgebung durchgeführt wird, die die gesamte Zelle abdeckt. Neben den hier beschriebenen Membrantransportereignissen lassen sich diese Ansätze auch auf andere biologische Prozesse übertragen. Zum Beispiel kann die Zeitreihenbildgebung über einen langfristigen Zeitraum (mehrere Tage) durchgeführt werden, um einen Entwicklungsprozess30 zu überwachen. Die Z-Stapel-Bildgebung kann durchgeführt werden, um die Häufigkeit eines Proteins innerhalb einer Zelle30 zu quantifizieren. Darüber hinaus können diese bildgebenden Verfahren perfekt mit pharmakologischen Anwendungen kombiniert werden, einschließlich verschiedener Medikamente, Hormone und sogar Umweltreize, was darauf hindeutet, dass diese bildgebenden Ansätze leicht auf lebende biologische Proben anwendbar sind. Neben der Flexibilität in der Probenbehandlung erfordern die hier beschriebenen Methoden nur wirtschaftlich erschwingliche Geräte, mit Ausnahme des konfokalen Mikroskops, und nur eine leichte Schulung des Personals in den technischen Fähigkeiten, so dass diese Methoden weit verbreitet sein können.
In mehreren kritischen Schritten des Protokolls ist Vorsicht geboten. Erstens variieren die optimalen Konzentrationen der membrantransportierenden Drogen je nach Material und Behandlung. Eine frühere Studie deutet darauf hin, dass 30 μM BFA eine niedrige Konzentration ist, die eine charakteristische BFA-Körperbildung auslösen kann, ohne den Kollaps des Golgi-Apparats in Meristemoidenzu verursachen 20. Ebenso ist 25 μM Wm eine niedrige, aber effektive Konzentration, die die Wm-Körperbildung fördern kann, ohne die Meristemoide ernsthaft zu schädigen. Wenn ein neues Material (verschiedene Pflanzenarten, verschiedene Pflanzenteile usw.) behandelt wird, müssen die Konzentrationen der Arzneimittel entsprechend optimiert werden. Zweitens, um den physiologischen Zustand der Proben während der Behandlung maximal zu erhalten, werden die Keimlinge bis zum Bildgebungsschritt teilweise intakt gehalten (nur die Keimblätter werden entfernt). Echte Blätter werden für die Objektträgerpräparation präpariert und die Probe anschließend abgebildet. Jede Probe muss einzeln behandelt werden, und der Objektträger muss für die Bildgebung frisch angefertigt werden. Schließlich erfordern sowohl die Z-Stapel-Bildgebung als auch die Zeitreihen-Bildgebung ein wiederholtes Laserscannen der Probe. Um das Risiko von Photobleichen und Phototoxizität auf den Proben zu minimieren, wird eine niedrige Laserleistung dringend empfohlen.
Die hohe Effizienz von Membrantransportereignissen wird durch die Vielfalt der Transportrouten und ihrer Kinetik als Reaktion auf die spezifischen Entwicklungs- und Umweltbedingungen der Zelle gewährleistet1. Die beschriebenen Methoden haben eine begrenzte räumliche und zeitliche Auflösung, so dass immer ausgefeiltere lichtmikroskopische Techniken entwickelt werden, um detaillierte Kenntnisse über den Membranverkehr innerhalb einer eukaryotischen Zelle zu gewinnen. Zum Beispiel erhöht die hochauflösende Mikroskopie, einschließlich der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und der photoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie (PALM), die räumliche Auflösung eines fluoreszenzmarkierten Proteins erheblich31,32, obwohl nur fixierte Proben analysiert werden können; Die Spinning-Disk-Mikroskopie beschleunigt die Scangeschwindigkeit erheblich und reduziert das Photobleichen der Proben33, obwohl es schwierig ist, die Dynamik von Proteinen mit geringer Häufigkeit mit dieser Methode aufzuzeichnen; Die Lichtblattmikroskopie ermöglicht eine schnelle und schonende 3D-Bildgebung34,35; und die Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die Detektion von Fluoreszenzsignalen aus tieferen Geweben35, 36, wenn auch auf Kosten einer etwas geringeren Auflösung usw. Darüber hinaus hat die chemische Biologie spezifischere Drogen identifiziert, die bestimmte Transportrouten stören. Trotz der Einschränkungen werden diese Techniken zusammen mit anderen neuen fortschrittlichen Techniken unser Wissen erheblich verbessern und Licht auf die Mechanismen des Zellmembrantransportsystems werfen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) und dem Bronson Foundation Award (H.Z.) der University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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