Summary
ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。
Abstract
真核細胞では、タンパク質や脂質などの膜成分が膜内システム内の目的地に時空間的に輸送されます。これには、新たに合成されたタンパク質の細胞表面または細胞外への分泌輸送、細胞外または原形質膜成分の細胞内細胞輸送、および細胞内オルガネラ間の貨物のリサイクルまたは往復輸送などが含まれます。膜輸送イベントは、すべての真核細胞の発生、成長、および環境適応にとって重要であるため、厳しい規制下にあります。細胞外空間からのリガンドシグナルを知覚する細胞表面受容体キナーゼは、分泌輸送とエンドサイトーシス輸送の両方を受けます。ここでは、原形質膜に局在するロイシンリッチリピート受容体キナーゼERL1を使用して膜輸送イベントを研究するために一般的に使用されるアプローチについて説明します。アプローチには、植物材料の調製、薬理学的処理、および共焦点イメージングのセットアップが含まれます。ERL1の時空間制御を監視するために、本研究では、ERL1と多胞体マーカータンパク質RFP-Ara7との共局在解析、これら2つのタンパク質の時系列解析、および膜輸送阻害剤であるブレフェルジンAとワートマニンで処理したERL1-YFPのzスタック解析について説明します。
Introduction
膜輸送は、タンパク質、脂質、その他の生物学的産物を含む膜成分(貨物とも呼ばれる)を、真核細胞内の異なる細胞小器官間または原形質膜を横切って細胞外空間との間で分配する保存された細胞プロセスです1。このプロセスは、核膜、小胞体、ゴルジ体、液胞/リソソーム、原形質膜、および複数のエンドソームで構成される膜内システムと呼ばれる膜と細胞小器官の集まりによって促進されます1。膜内システムは、これらの細胞小器官間を往復する動的小胞を使用して、膜成分の修飾、パッケージング、および輸送を可能にします。膜輸送イベントは、細胞の発生、成長、および環境適応に不可欠であるため、厳格で複雑な規制下にあります2。現在、分子生物学、ケミカルバイオロジー、顕微鏡、質量分析における複数のアプローチが開発され、膜輸送の分野に適用されており、膜内システムの時空間調節の理解を大幅に進めています3,4。分子生物学は、目的のタンパク質の遺伝子発現を変更したり、目的のタンパク質を特定のタグで標識したりするなど、膜輸送に関与する推定プレーヤーの古典的な遺伝子操作に使用されます。ケミカルバイオロジーのツールには、特定のルート4,5の交通を特に妨害する分子の使用が含まれます。質量分析は、生化学的アプローチによって機械的に単離された細胞小器官の成分を同定するのに強力です3,4。しかし、膜の交通は動的で多様で複雑な生物学的プロセスです1。さまざまな条件下で生細胞における膜輸送プロセスを可視化するには、光学顕微鏡法が不可欠なツールです。イベントの効率、動力学、および多様性を測定する際の課題を克服するために、高度な顕微鏡技術が継続的に進歩しています4。ここでは、化学/薬理生物学、分子生物学、および顕微鏡法で広く採用されている方法論に焦点を当て、自然に単純化され実験的にアクセス可能なシステムである気孔発生プロセスにおける膜輸送イベントを研究します。
気孔は、植物の空中表面上の微細孔であり、内部細胞と環境との間のガス交換を容易にするために開閉する6,7,8。したがって、気孔は光合成と蒸散に不可欠であり、植物の生存と成長に不可欠な2つのイベントです。気孔の発達は、環境の合図によって動的に調整され、植物の周囲への適応を最適化します9。2002年の研究にさかのぼり、受容体タンパク質Too Many Mouths(TMM)の同定は、モデル植物シロイヌナズナ10における気孔発生の分子メカニズムを調査する新しい時代への扉を開きました。わずか数十年後、古典的なシグナル伝達経路が同定されました。上流から下流まで、この経路には、表皮パターニング因子(EFP)ファミリーの分泌ペプチドリガンド群、EREETA(ER)ファミリーのいくつかの細胞表面ロイシンリッチリピート(LRR)受容体キナーゼ、LRR受容体タンパク質TMM、MAPKカスケード、およびスピーチレス(SPCH)、MUTE、FAMA、およびSCREAM(SCRM)11,12,13,14を含むいくつかのbHLH転写因子が含まれます 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26。以前の研究では、受容体キナーゼの1つであるER-LIKE 1(ERL1)が、EPF知覚時に活発な細胞内挙動を示すことが示されています20。ERL2はまた、原形質膜といくつかの細胞内オルガネラとの間の動的に輸送する27。膜輸送ステップを遮断すると、異常な気孔パターニングが生じ、葉表面28上に気孔クラスターが生じる。これらの結果は、膜交通が気孔の発達に不可欠な役割を果たしていることを示唆しています。本研究では、タンパク質間細胞内共局在解析と膜輸送阻害剤を用いた薬理学的治療を組み合わせて、ERL1動態を時空間的に調べるためのプロトコルについて述べる。
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Protocol
1.溶液の調製
- 15 mLの漂白剤を35 mLの蒸留水および50 μLのTriton X-100と混合して、種子滅菌溶液を調製します。
- BFA粉末をエタノールに溶解して最終濃度10 mM(ストック)にしてブレフェルジンA(BFA)溶液を調製します。Wm粉末をDMSOに溶解してワートマニン(Wm)溶液を最終濃度10mM(ストック)に調製する。
2.種をまく
- 必要なトランスジェニック植物のそれぞれから10〜50個の種子を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに分注します。各チューブに1 mLの種子殺菌液を加え、シェーカーで10分間チューブを静かに反転させて完全に混合します。
- 種子殺菌液を捨て、1 mLのオートクレーブ滅菌蒸留水で種子を5回洗浄します。
- 各チューブに300 μLのオートクレーブ滅菌蒸留水を加え、1%(w / v)スクロースと0.75%(w / v)寒天を含む半強度MS培地に種子を播種します。必要に応じて、対応する抗生物質を培地に補給します。
- プレートを逆さまにして4°Cの暗所で2日間保持し、発芽を同期させます。
- 2日後、プレートを22°Cで16時間の明暗サイクル(80 μmol/m2/s1)で成長室に移します。 これは発芽後の最初の日(1 dpg)と見なされます。
- さらなる成長のために10 dpgで苗を土壌に移植します。
3. 二色F1トランスジェニック植物の調製
- ERL1-YFPを有するホモ接合トランスジェニック植物(植物A)とRFP標識マーカータンパク質RFP-Ara7を有するホモ接合トランスジェニック植物(植物B)20を、22°Cで16時間の明/8時間の暗サイクル(80 μmol/m2/s1)の生育室で開花するまで並べて育てます。
- 植物Aから若い花序を選択してください遺伝的交配のために花序にちょうど開こうとしている1つの花を保ちます。古い花とシリケをすべて取り除きます。さらに、将来の混乱を避けるために、若い花と花の分裂組織を慎重に取り除きます。
- 鋭いピンセットを使用して、がく片、花びら、雄しべを取り除き、未開封の花をそっと解剖します。雌しべを花序に残すだけです。
- 植物Bの開いた花から成熟した雄しべを取り、花粉粒を植物Aの解剖された雌しべの柱頭に沈着させます。
- この手動で交配した花に、その父、母、および遺伝的交配の日付を示すことによってラベルを付けます。花を成熟させ、珪藻が黄色/茶色に変わったら(交配後~20日後)F1種子を収穫します。YFP信号とRFP信号の両方を持つ成功したF1プラントを確認します。
4.薬理学的治療
- BFA処理では、生後7日齢の苗の子葉を取り除き、残りの苗を模擬溶液(0.3%エタノール)または30μM BFA溶液のいずれかに浸し、1分間真空にし、サンプルを30分間浸漬してからイメージングします。
- 麦汁マニン処理では、7日齢の苗の子葉を取り除き、残りの苗を0.25%DMSO溶液または25 mMの麦汁マニンに浸し、1分間真空をかけ、サンプルを30分間浸してからイメージングします。
- サンプルの真空処理では、1.5 mLの微量遠心管に500 μLの対応する薬液を加え、解剖した苗を溶液に浸します。10 mLのシリンジをマイクロ遠心チューブにしっかりと取り付け、1分間真空にします(図1)。シリンジを取り外し、サンプルを必要な時間溶液に保持します。イメージングの準備のために苗をそっと取り出します。
図1:シンプルな真空装置。 真空処理のために、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに10 mLのシリンジが取り付けられています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5. イメージングのためのサンプル調製
- 鋭いかみそりの刃を使用して、処理されたサンプルから本物の葉を解剖します。スライドガラスの上の水滴に本物の葉をそっと入れ、軸側を上に保ちます。泡を閉じ込めないようにしながら、本物の葉をカバーガラスでゆっくりと覆います。
6. 共焦点イメージング
注:この研究では、ライカSP8倒立走査型共焦点顕微鏡を使用して、サンプルの蛍光信号を画像化しました。
- ビームパスの設定
- YFP励起には514nmレーザーを選択してください。高いレーザー出力を使用して信号強度を高め、高画質を実現します。ただし、5%を超えるレーザー出力は光退色のリスクがあり、サンプルの健康に影響を与える可能性があります。サンプル信号が暗すぎない場合は、低いレーザー強度から始めます。
- 検出のためにPMT/HyDをオンにし、YFP蛍光色素のスペクトルに基づいて発光バンドの上限と下限の閾値を定義します。YFP信号を収集するために、530〜570nmの検出ウィンドウを設定します。
- 2番目の色のシーケンシャルイメージング:Seqボタンをクリックして、新しいチャンネルを追加します。デフォルトでは、以前に設計されたYFPビームパスはシーケンス1になります。シーケンス2では、RFP励起に561 nmレーザーを選択し、RFP信号を収集するために570〜630 nmの検出ウィンドウを設定します。
- スキャン条件の設定(図2)
- 気孔前駆細胞内の細胞内膜交通活動をイメージングするには、イメージング用のシステム上の63x/1.2 W Corrレンズを選択します。
- 形式は、ピクセル単位の画像サイズを参照します。1,024 ピクセル x 1,024 ピクセルから始めて、ズーム倍率と目標設定に基づいてこれを最適化して、パブリケーション品質の解像度を高めます。
- 速度とは、レーザーが各ピクセルを通過するときのスキャンヘッドの速度を指します。スキャン速度が遅いと信号対雑音比が向上することがよくありますが、急速に変化する膜輸送イベントを効率的にキャプチャできない場合があります。400 Hzの速度から始めて、サンプルの特定の状況に基づいてこれを最適化します。
- ズーム係数は、対物レンズを変更せずに関心領域を拡大するために使用されます。ズーム倍率 1 から始めて、実験の特定のニーズに基づいてこれを最適化します。
- 線の平均とは、平均結果を得るために各X線をスキャンする回数を指します。線の平均を大きくすると、結果の画像のノイズが減少しますが、スキャン時間とレーザー光への露光時間も長くなります。膜輸送イベントを画像化するには、高いライン平均を使用しないでください。2倍のライン平均から始めて、必要に応じて最適化します。
- 時系列の収集
注:膜輸送イベントを研究する場合、細胞内エンドソームの急速な動きを記録するために時系列が必要になることがよくあります。- [集録モード]で、xytスキャンモードを選択して時系列ユーティリティを有効にします。
- [時間間隔] で、時点間の待機期間を決定します。または、[最小化]をクリックして、画像を次々にすぐに撮影します。7秒の時間間隔を次の時系列実験で使用しました。
- [期間] を選択し、実験を実行する合計時間を入力します。または、[フレーム]を選択して、収集するフレーム数を定義します(図3)。
- セル全体の膜輸送イベントに関する3次元情報を収集するには、Zスタックスキャンモードを使用します。Zスタック画像の最大強度投影は、多くの場合、分析に使用されます。
- アクイジションモードでxyzスキャンモードを選択すると、Z-Stackユーティリティにアクセスできるようになります。
- [Z 幅] オプションを選択します。[スキャン モード]で、[開始]ボタンと[終了]ボタンを使用して、Z スタックの上部の画像と下部の画像を定義します。
- Z ステップの太さを定義するには、Z ステップのサイズをクリックします。または、Z スタックの全範囲をカバーするために撮影する画像の数を定義します。サンプル間の一貫性を確保するには、zステップのサイズを定義します(図4)。
- 画像処理
- zスタック画像の最大強度投影は、共焦点ソフトウェア(http://www.leica-microsystems.com)によって生成されます。プライマリ [プロセス] タブで、まず、左端の [プロジェクトを開く] タブの下にある目的の z-stack ファイルを選択します。次に、[プロセスツール]という名前の中央のタブに切り替え、[投影]機能を選択し、[メソッド]のドロップダウンパネルで[最大]を選択して、[適用]ボタンをクリックします。Z スタック投影イメージが [開いているプロジェクト] タブの下に生成されます。
- 時系列画像のビデオはフィジー(https://imagej.net/Fiji)によって生成されます。[ファイル] タブで、[開く] 関数を使用して、すべての時系列画像を正しい順序で開きます。[画像]タブで、[スタック]関数を見つけ、[スタックする画像]を選択してビデオを生成します。希望のフレームレート(ビデオ1の場合は5フレーム/秒)で.avi形式でファイルを保存します。
図2:XY寸法のスキャンモードパネル。 スキャンモードパネルは、イメージスキャン条件を設定するために使用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:xytスキャンモードでの時系列ユーティリティ。 時系列ユーティリティは、一連の画像を連続して収集するためのイメージング条件を設定するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:xyzスキャンモードでのzスタックユーティリティ。 z-stackユーティリティは、z軸上の一連の画像を収集するためのイメージング条件を設定するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
以前の研究では、ERL1は動的な膜輸送イベントを受ける活性受容体キナーゼであることが示されました20。ERL1は、原形質膜上の膜貫通LRR受容体キナーゼです。小胞体で新たに合成されたERL1はゴルジ体で処理され、さらに原形質膜に輸送されます。原形質膜上のERL1分子は、それらの細胞外LRRドメイン18を用いてEPFリガンドを知覚することができる。EPF1を含む阻害性EPFによって活性化されると、ERL1はエンドソーム内に内在化され、多小胞体(MVB)に輸送され、次いで分解のために液胞に輸送されてシグナル20を終結させる。対照的に、気孔形成を促進する拮抗的なEPFL9リガンド14は、小胞体にERL1を保持します。あるいは、原形質膜に局在するERL1は、エンドソームと原形質膜20との間でリサイクルすることができる。
ここでは、ERL1プロ モーター::ERL1-YFP を有するトランスジェニック植物を、上記のプロトコールに従って7日間生育させた。 ERL1 は若い葉の気孔系統細胞でのみ発現しているため、出現したばかりのときは、真葉をイメージングのために解剖しました20。予想通り、散在細胞はYFPシグナルによって強調表示され、ERL1-YFPは原形質膜を標識しました(図5)。さらに、複数の点状シグナルも観察され、ERL1もエンドソームに局在していることが示唆されました。
植物細胞内のいくつかの細胞小器官は、トランスゴルジネットワークやMVBなど、光学顕微鏡で観察すると点状の蛍光シグナルとして存在します。 RFP-Ara7 を有するMVBマーカー株を ERL1-YFP トランスジェニック株と遺伝的に交配した場合、上記のように逐次イメージングアプローチを用いて両方のマーカータンパク質が観察された。 図6に示すように、RFP-Ara7は、ほぼすべての細胞で複数の点状シグナルを強調し、これらの細胞のMVBを示しています(図6B)。ERL1-YFPシグナルと合流すると、ほとんどのERL1-YFP陽性点状物がRFP-Ara7標識点状物と重複した。この結果は、ERL1-YFP分子の一部がMVBに輸送されていることを示唆しています。
これらの動きの速いエンドソームの動態をモニターするために、 ERL1-YFP と RFP-Ara7 を持つ7日齢の本葉の時系列画像が収集されました(図7)。7秒の時間間隔を203秒に適用し、収集した30枚の画像を使用して、画像J(ビデオ1)のビデオを生成しました。ビデオは、ERL1-YFP標識エンドソームが気孔系譜細胞内でRFP-Ara7と一緒に移動したことを示し、ERL1-YFPがMVBに局在していることを確認しました。
薬理学的アプローチを用いてERL1輸送経路を調べるために、一般的に使用される2つの膜輸送薬物、ブレフェルジンA(BFA)とワートマニン(Wm)の効果を分析しました。BFAは、GNOMを含むグアニンヌクレオチド交換因子のADPリボシル化因子を阻害することにより、膜タンパク質のエンドソームリサイクルおよびエンドサイトーシスを遮断することができる29。BFA溶液に30分間曝露した後、ERL1-YFPは、BFAボディとして知られるいくつかの大きなコンパートメントで検出されました(図8B、C)。これは、ERL1の輸送がBFAによってブロックできることを示しており、ERL1がリサイクルまたはエンドサイトーシスを受けていることを示唆しています。Wmは、ホスファチジルイノシトール-3およびホスファチジルイノシトール-4キナーゼを阻害することができ、したがって、MVBs5の融合を引き起こす。Wmで30分間処理すると、ERL1-YFPによって強調されたいくつかのリング状の構造が観察され、これらは通常Wm体と呼ばれます(図8C)。この結果は、ERL1-YFPがMVBに輸送されることを示しており、ERL1が分解のために液胞への経路をたどっていることを示唆しています。
図5:ERL1-YFPの単一平面画像 。 (A)蛍光画像、(B)明視野画像、および(C)マージ画像は、ERL1-YFPが気孔系譜細胞内の原形質膜およびいくつかの移動性の高い点状物を標識していることを示しています。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ERL1-YFPとRFP-Ara7の連続画像 。 (A)ERL1-YFPおよび(B)RFP-Ara7はどちらも細胞内の点状シグナルを標識する。(C)マージされた画像と(D)挿入画像の白い点状は、2つのタンパク質が気孔系譜細胞内のMVB上に共局在していることを示しています。白矢印は、ERL1-YFPおよびRFP-Ara7の両方によって標識されたエンドソームを示す。赤い矢印はRFP-Ara7で標識されたエンドソームを示す。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ERL1-YFPとRFP-Ara7の時系列画像。 画像は7秒の時間間隔で撮影されました。各画像の時点は、左上隅に示されています。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ERL1-YFPのZスタック画像。 (A、B)(A)モックまたは(B)BFAで処理したERL1-YFP植物のZスタック画像。右上隅の数字は、Z スタック内の画像の位置を上から下に示します。スケールバー:10 μm。 (C)右上に示すように、モックまたはBFA溶液とモックまたはWm溶液で処理したERL1-YFPのzスタック画像の投影。矢印は薬剤に起因するERL1-YFPの凝集体を示す。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:ERL1-YFPとRFP-Ara7の時系列画像のビデオ。 ERL1-YFPとRFP-Ara7の時系列画像をフィジーを使用して5フレーム/秒の速度でビデオにスタックします。 この ビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
膜内システムは、真核細胞の細胞質を異なる区画に分離し、これらの細胞小器官の特殊な生物学的機能を可能にします。貨物タンパク質と高分子を適切なタイミングで最終目的地に送達するために、多数の小胞がこれらの細胞小器官間を往復するように誘導されます。高度に制御された膜輸送イベントは、細胞の生存率、発生、および成長において基本的な役割を果たします。この重要で複雑なプロセスを規制するメカニズムはまだよくわかっていません。
ここでは、膜タンパク質の細胞内局在の観察、異なる蛍光タンパク質でタグ付けされた2つの膜タンパク質間の共局在の解析、時系列画像を用いた膜タンパク質の動的運動のモニタリング、細胞全体をカバーするzスタックイメージングによる膜タンパク質に関する3次元情報の収集など、いくつかのアプローチについて述べました。ここで説明する膜輸送イベントに加えて、これらのアプローチは他の生物学的プロセスにも簡単に適用できます。例えば、時系列イメージングは、発生過程をモニタするために長期間(数日間)にわたって行うことができる30。zスタックイメージングは、細胞30内のタンパク質の存在量を定量化するために行うことができる。さらに、これらのイメージングアプローチは、さまざまな薬物、ホルモン、さらには環境キューを含む薬理学的アプリケーションと完全に組み合わせることができ、これらのイメージングアプローチが生きた生物学的サンプルに容易に適用できることを示しています。サンプル処理の柔軟性に加えて、ここで説明する方法は、共焦点顕微鏡を除いて経済的に手頃な価格のデバイスのみを必要とし、技術的スキルの担当者の軽いトレーニングのみを必要とするため、これらの方法を広く採用できます。
プロトコルのいくつかの重要なステップでは注意が必要です。第一に、膜輸送薬物の最適濃度は、材料および処理によって異なる。以前の研究では、30μM BFAは、メリステモイド20のゴルジ装置の崩壊を引き起こすことなく、特徴的なBFA体形成を引き起こすことができる低濃度であることが示唆されています。同様に、25μM Wmは、メリステモイドに深刻な損傷を与えることなくWm体形成を与えることができる、低いが有効な濃度である。新しい材料(異なる植物種、植物の異なる部分など)が処理されるとき、それに応じて薬物の濃度を最適化する必要があります。第2に、処理中にサンプルの生理学的状態を最大限に維持するために、苗はイメージングステップまで部分的に無傷に保たれる(子葉を除去するのみ)。スライドの準備のために真の葉を解剖し、その後サンプルを画像化します。各サンプルは個別に処理する必要があり、スライドはイメージング用に新しく作成する必要があります。最後に、zスタックイメージングと時系列イメージングの両方で、サンプルの繰り返しレーザースキャンが必要です。サンプルの光退色と光毒性のリスクを最小限に抑えるために、低いレーザー出力を強くお勧めします。
膜輸送事象の高効率は、細胞の特定の発生条件および環境条件に応答した輸送経路およびそれらの動態の多様性によって保証される1。記載された方法は時空間分解能が限られているため、真核細胞内の膜交通の詳細な知識を得るために、より洗練された光学顕微鏡技術が出現しています。例えば、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在顕微鏡(PALM)などの超解像顕微鏡は、蛍光タグ付きタンパク質の空間分解能を大幅に向上させます31,32が、固定サンプルしか分析できません。スピニングディスク顕微鏡は、スキャン速度を大幅に加速し、サンプル33の光退色を低減しますが、この方法を使用して存在量の少ないタンパク質のダイナミクスを記録することは困難です。ライトシート顕微鏡は、高速で穏やかな3Dイメージングを提供します34,35;また、2光子顕微鏡法は、より深い組織からの蛍光シグナルの検出を可能にします35,36が、分解能がわずかに低下するなどの犠牲を払っています。さらに、ケミカルバイオロジーは、特定の人身売買ルートを妨害するより具体的な薬物を特定しました。限界はあるものの、これらの技術は、他の新しい高度な技術とともに、私たちの知識を大幅に向上させ、細胞膜輸送システムのメカニズムに光を当てます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団(IOS-2217757)(X.Q.)およびアーカンソー医科大学(UAMS)ブロンソン財団賞(H.Z.)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL syringes | VWR | BD309695 | Vacuum samples |
| Brefeldin A (BFA) | Sigma | B7651 | membrane trafficking drug |
| Confocal Microscope | Leica | Lecia SP8 TCS with LAS-X software package | Imaging |
| Dissecting Forceps | VWR | 82027-402 | Genetic cross |
| Fiji | NIH | https://imagej.net/Fiji | Image processing |
| Leica LAS AF software | Leica | http://www.leica-microsystems.com | Image processing |
| transgenic seeds of ERL1-YFP | Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020). | ||
| transgenic seeds of RFP-Ara7 | Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011). | ||
| Wortmannin (Wm) | Sigma | W1628 | membrane trafficking drug |
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