Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Основанные на изображениях методы изучения событий мембранного транспорта в клетках устьичной линии

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Здесь представлено несколько широко используемых методов для изучения событий мембранного транспорта рецепторной киназы плазматической мембраны. В этой рукописи подробно описаны протоколы, включающие подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации.

Abstract

В эукариотических клетках мембранные компоненты, включая белки и липиды, пространственно-временные транспортируются к месту назначения в пределах эндомембранной системы. Это включает в себя секреторный транспорт вновь синтезированных белков на поверхность клетки или снаружи клетки, эндоцитарный транспорт внеклеточных грузов или компонентов плазматической мембраны в клетку, а также рециркуляцию или перемещение грузов между субклеточными органеллами и т. д. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации к окружающей среде всех эукариотических клеток и, таким образом, находится под строгим регулированием. Рецепторные киназы клеточной поверхности, воспринимающие сигналы лигандов из внеклеточного пространства, подвергаются как секреторному, так и эндоцитарному транспорту. Здесь описаны широко используемые подходы к изучению событий мембранного транспорта с использованием рецепторной киназы ERL1, локализованной на плазматической мембране. Подходы включают подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации. Для мониторинга пространственно-временной регуляции ERL1 в данном исследовании описывается анализ колокализации между ERL1 и мультивезикулярным белком-маркером тельца, RFP-Ara7, анализ временных рядов этих двух белков и анализ z-стека ERL1-YFP, обработанного ингибиторами мембранного транспорта брефельдином А и вортманнином.

Introduction

Мембранный трафик представляет собой консервативный клеточный процесс, при котором компоненты мембраны (также известные как грузы), включая белки, липиды и другие биологические продукты, распределяются между различными органеллами внутри эукариотической клетки или через плазматическую мембрану во внеклеточноепространство и из него. Этому процессу способствует совокупность мембран и органелл, называемая эндомембранной системой, которая состоит из ядерной мембраны, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, вакуоли/лизосом, плазматической мембраны и множественных эндосом1. Эндомембранная система позволяет модифицировать, упаковывать и транспортировать мембранные компоненты с помощью динамических везикул, которые перемещаются между этими органеллами. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации клеток к окружающей среде и, таким образом, находится под строгим исложным регулированием. В настоящее время разработано и применено множество подходов в молекулярной биологии, химической биологии, микроскопии и масс-спектрометрии, которые значительно продвинули понимание пространственно-временной регуляции эндомембранной системы 3,4. Молекулярная биология используется для классических генетических манипуляций с предполагаемыми игроками, участвующими в мембранном транспорте, таких как изменение экспрессии генов интересующего белка или маркировка интересующего белка определенными метками. Инструменты химической биологии включают использование молекул, которые специфически вмешиваются в движение определенных маршрутов 4,5. Масс-спектрометрия эффективна для идентификации компонентов в органелле, которая была механически выделена биохимическими подходами 3,4. Тем не менее, мембранный трафик является динамичным, разнообразным и сложным биологическимпроцессом1. Для визуализации процесса мембранного транспорта в живых клетках в различных условиях важным инструментом является световая микроскопия. Для преодоления трудностей, связанных с измерением эффективности, кинетики и разнообразия событий, был достигнут непрерывный прогресс в области передовых методов микроскопирования4. В данном исследовании основное внимание уделяется широко распространенным методологиям химической/фармакологической биологии, молекулярной биологии и микроскопии для изучения событий мембранного транспорта в естественно упрощенной и экспериментально доступной системе — процессе развития устьиц.

Устьица представляют собой микропоры на надземных поверхностях растений, которые открываются и закрываются для облегчения газообмена между внутренними клетками и окружающей средой 6,7,8. Следовательно, устьица необходимы для фотосинтеза и транспирации, двух событий, которые имеют решающее значение для выживания и роста растений. Развитие устьиц динамически регулируется сигналами окружающей среды для оптимизации адаптации растения к окружающей среде9. Начиная с исследований 2002 года, идентификация рецепторного белка Too Many Mouths (TMM) открыла дверь в новую эру исследования молекулярных механизмов развития устьиц у модельного растения Arabidopsis thaliana10. Всего через несколько десятилетий был идентифицирован классический сигнальный путь. Этот путь включает в себя группу секреторных пептидных лигандов в семействе факторов формирования эпидермальных паттернов (EFP), несколько киназ рецепторов лейцин-богатых повторами (LRR) на клеточной поверхности в семействе EREECTA (ER), рецепторный белок LRR TMM, каскад MAPK и несколько транскрипционных факторов bHLH, включая SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA и SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Предыдущая работа показала, что одна из рецепторных киназ, ER-LIKE 1 (ERL1), демонстрирует активное субклеточное поведение при восприятии EPF20. ERL2 также динамически перемещается между плазматической мембраной и некоторыми внутриклеточными органеллами27. Блокирование этапов мембранного транспорта вызывает аномальный устьичный рисунок, в результате чего на поверхности листа образуются устьичные скопления28. Эти результаты свидетельствуют о том, что мембранный трафик играет важную роль в развитии устьиц. В данном исследовании описывается протокол пространственно-временного исследования динамики ERL1 с использованием анализа белок-белковой субклеточной колокализации в сочетании с фармакологическим лечением с использованием некоторых ингибиторов мембранного трафика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте раствор для стерилизации семян, смешав 15 мл отбеливателя с 35 мл дистиллированной воды и 50 мкл Triton X-100.
  2. Приготовьте раствор брефельдина А (БФА), растворив порошок БЖК в этаноле до конечной концентрации 10 мМ (исходное сырье). Приготовьте раствор вортманнина (Wm), растворив порошок Wm в DMSO до конечной концентрации 10 мМ (запас).

2. Посев семян

  1. Аликвотируют 10-50 семян от каждого из необходимых трансгенных растений в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл раствора для стерилизации семян в каждую пробирку и тщательно перемешайте, осторожно переворачивая пробирку в течение 10 минут на шейкере.
  2. Раствор для стерилизации семян выбросить, а семена промыть 1 мл автоклавной дистиллированной воды пять раз.
  3. Добавьте 300 мкл автоклавной дистиллированной воды в каждую пробирку и посейте семена на субстрате средней плотности половинной крепости, содержащей 1% (по массе) сахарозы и 0,75% (по массе) агара. При необходимости дополняйте среду соответствующими антибиотиками.
  4. Держите пластину вверх дном при температуре 4 °C в темноте в течение 2 дней, чтобы синхронизировать прорастание.
  5. Через 2 дня переложите планшет в комнату для выращивания с циклом 16 ч светлый/8 ч темный (80 мкмоль/м2/с1) при22 °C. Это считается первым днем после появления всходов (1 dpg).
  6. Пересадите рассаду в почву на 10 дпг для дальнейшего роста.

3. Подготовка двухцветных трансгенных растений F1

  1. Выращивайте гомозиготные трансгенные растения с ERL1-YFP (растение A) и гомозиготные трансгенные растения с меченным RFP маркерным белком RFP-Ara7 (растение B)20 бок о бок до цветения в помещении для выращивания с циклом 16 ч свет/8 ч темнота (80 мкмоль/м2/с1) при22 °C.
  2. Выберите молодое соцветие из растения А. Оставьте один цветок, который вот-вот раскроется на соцветии для генетических скрещиваний. Удалите все старые цветки и соцветия. Кроме того, осторожно удалите молодые цветки и цветочные меристемы, чтобы избежать путаницы в будущем.
  3. Аккуратно препарируйте нераскрывшийся цветок, удалив чашелистики, лепестки и тычинки с помощью острого пинцета. Пестик оставляйте только на соцветии.
  4. Возьмите зрелую тычинку из раскрывшегося цветка на растении Б и отложите пыльцевые зерна на рыльце рассеченного пестика на растении А.
  5. Обозначьте этот цветок, скрещенный вручную, указав его отца, мать и дату генетического скрещивания. Дайте цветку созреть и соберите семена F1, когда кремнезем станет желто-коричневым (~20 дней после скрещивания). Проверьте, есть ли успешная установка F1, у которой есть сигналы YFP и RFP.

4. Фармакологическое лечение

  1. Для обработки BFA удалите семядоли 7-дневных проростков, погрузите остальные проростки либо в макетный раствор (0,3% этанол), либо в 30 мкМ раствор BFA, приложите вакуум на 1 минуту и держите образец погруженным в течение 30 минут перед визуализацией.
  2. Для обработки вортманнином удалите семядоли 7-дневных проростков, погрузите остальные проростки либо в 0,25% раствор ДМСО, либо в 25 мМ вортманнина, приложите вакуум на 1 мин и держите образец погруженным в течение 30 мин перед визуализацией.
  3. Для вакуумной обработки образцов в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл добавляют 500 мкл соответствующего раствора препарата, и погружают в раствор рассеченные проростки. Плотно приложите шприц объемом 10 мл к пробирке микроцентрифуги и приложите вакуум на 1 мин (рис. 1). Извлеките шприц, и подержите пробу в растворе необходимое время. Аккуратно вынимаем рассаду для подготовки к визуализации.

Figure 1
Рисунок 1: Простое вакуумное устройство. Шприц объемом 10 мл прикрепляется к пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл для вакуумной обработки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Подготовка образца для визуализации

  1. Отделите истинный лист от обработанного образца с помощью острого бритвенного лезвия. Аккуратно положите настоящий лист в каплю воды на предметное стекло и держите абаксиальной стороной вверх. Медленно накройте настоящий лист покровным листом, избегая скопления пузырьков.

6. Конфокальная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертированный сканирующий конфокальный микроскоп Leica SP8 был использован для визуализации сигнала флуоресценции образцов в этой работе.

  1. Настройка траектории луча
    1. Выберите лазер с длиной волны 514 нм для возбуждения YFP. Используйте высокую мощность лазера для увеличения интенсивности сигнала и, таким образом, получения высокого качества изображения. Однако мощность лазера выше 5% сопряжена с риском фотообесцвечивания, что может повлиять на здоровье образца. Если сигнал образца не слишком тусклый, начните с низкой интенсивности лазера.
    2. Включите PMT/HyD для обнаружения и определите пороговые значения верхней и нижней полос излучения на основе спектра для флуорофора YFP. Установите окно обнаружения 530-570 нм для сбора сигнала YFP.
    3. Последовательное изображение для второго цвета: Нажмите на кнопку Seq и добавьте новый канал. По умолчанию ранее спроектированная траектория луча YFP будет иметь значение Seq 1. В Seq 2 выберите лазер с длиной волны 561 нм для возбуждения RFP и установите окно обнаружения 570-630 нм для сбора сигнала RFP.
  2. Настройка условий сканирования (рис. 2)
    1. Чтобы получить изображение активности субклеточной мембраны в устьичных клетках-предшественниках, выберите линзу Corr 63x/1,2 Вт на системе визуализации.
    2. Формат относится к размеру изображения в пикселях. Начните с 1 024 x 1 024 пикселей, а затем оптимизируйте его на основе коэффициента масштабирования и настроек объектива для хорошего разрешения и качества публикации.
    3. Скорость относится к скорости сканирующей головки при прохождении лазером над каждым пикселем. Несмотря на то, что низкая скорость сканирования часто приводит к лучшему соотношению сигнал/шум, она может не эффективно фиксировать быстро меняющиеся события транспортировки мембраны. Начните с частоты 400 Гц и оптимизируйте ее в зависимости от конкретной ситуации образцов.
    4. Коэффициент масштабирования используется для увеличения интересующей области без изменения объектива. Начните с коэффициента масштабирования, равного 1, и оптимизируйте его в соответствии с конкретными потребностями эксперимента.
    5. Линейное среднее значение относится к количеству раз, когда каждая X-линия будет отсканирована для получения среднего результата. Большее среднее значение уменьшает шум в результирующем изображении, но также увеличивает время сканирования и время воздействия лазерного света. Для получения изображения событий мембранного трафика не используйте среднее значение с высокой линией. Начните с 2-кратного линейного среднего значения и оптимизируйте его по мере необходимости.
  3. Сбор временных рядов
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении событий мембранного транспорта часто требуется временной ряд для регистрации быстрого движения субклеточных эндосом.
    1. В режиме сбора данных выберите режим сканирования xyt, чтобы включить утилиту временных рядов.
    2. Определите период ожидания между точками времени в разделе Интервал времени. Кроме того, нажмите « Свернуть », чтобы сделать снимки сразу за другим. Интервал времени 7 с был использован в следующем эксперименте с временными рядами.
    3. Выберите Длительность и введите общее время выполнения эксперимента. Кроме того, можно определить количество кадров, которые необходимо собрать, выбрав Frames (рис. 3).
  4. Для сбора трехмерной информации о событии мембранного транспорта во всей ячейке используйте режим сканирования Z-стека. Для анализа часто используется проекция максимальной интенсивности изображений Z-стека.
    1. Выберите режим сканирования xyz в Acquisition Mode, и тогда утилита Z-Stack станет доступной.
    2. Выберите параметр Z-wide. В режиме сканирования определите верхнее и нижнее изображения Z-стека с помощью кнопок « Начало » и «Конец ».
    3. Определите толщину шага z, щелкнув по размеру шага z. Кроме того, можно определить, сколько изображений нужно сделать, чтобы охватить весь диапазон Z-стека. Чтобы обеспечить согласованность между образцами, определите размер z-шага (рис. 4).
  5. Обработка изображений
    1. Проекция максимальной интенсивности изображений z-стека генерируется конфокальным программным обеспечением (http://www.leica-microsystems.com). На основной вкладке «Процесс » сначала выберите нужный файл z-стека на вкладке «Открытые проекты » в левой части экрана. Затем переключитесь на среднюю вкладку под названием « Инструменты обработки», выберите функцию « Проекция », выберите « Максимум » в выпадающем списке «Метод» и нажмите кнопку «Применить ». Проекционное изображение z-стека будет сгенерировано на вкладке Open Projects.
    2. Видео с изображениями временных рядов создано Фиджи (https://imagej.net/Fiji). На вкладке «Файл » используйте функцию « Открыть », чтобы открыть все изображения временных рядов в правильном порядке. На вкладке « Изображение » найдите функцию « Стек » и выберите «Изображения для наложения », чтобы создать видео. Сохраните файл в формате .avi с желаемой частотой кадров (5 кадров/с для Видео 1).

Figure 2
Рисунок 2: Панель режима сканирования измерения XY. Панель режима сканирования используется для настройки условий сканирования изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Утилита временных рядов в режиме xyt-сканирования. Утилита временных рядов используется для настройки условий создания изображений для последовательного сбора серии изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Утилита z-stack в режиме сканирования xyz. Утилита z-stack используется для настройки условий визуализации для сбора серии изображений по оси z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Предыдущее исследование показало, что ERL1 является активной рецепторной киназой, которая претерпевает динамические события мембранного транспорта20. ERL1 представляет собой трансмембранную LRR-рецепторную киназу на плазматической мембране. Вновь синтезированный ERL1 в эндоплазматическом ретикулуме перерабатывается в тельцах Гольджи и далее транспортируется к плазматической мембране. Молекулы ERL1 на плазматической мембране могут воспринимать EPF-лиганды, используя свой внеклеточный домен LRR18. После активации ингибирующими EPF, включая EPF1, ERL1 интернализируется в эндосомы, транспортируется к мультивезикулярным тельцам (MVB), а затем транспортируется в вакуоли для деградации с целью прекращения сигнала20. Напротив, антагонистический лиганд EPFL9, способствующий образованию устьиц14, удерживает ERL1 в эндоплазматическом ретикулуме. В качестве альтернативы локализованный плазматической мембраной ERL1 может циркулировать между эндосомами и плазматической мембраной20.

Здесь трансгенные растения, несущие промотор ERL1: :ERL1-YFP, выращивались в течение 7 дней в соответствии с вышеупомянутым протоколом. Когда он только появился, истинный лист был препарирован для визуализации, так как ERL1 экспрессируется только в клетках устьичной линии в молодых листьях20. Как и ожидалось, рассеянные клетки были выделены сигналом YFP, где ERL1-YFP метил плазматическую мембрану (рис. 5). Кроме того, наблюдались множественные точечные сигналы, что позволяет предположить, что ERL1 также локализован в эндосомах.

Несколько органелл в растительных клетках представлены в виде точечных флуоресцентных сигналов при наблюдении под световым микроскопом, например, транс-сеть Гольджи и MVB. При генетическом скрещивании маркерной линии MVB, несущей RFP-Ara7 , с трансгенной линией ERL1-YFP , оба маркерных белка наблюдались с использованием метода последовательной визуализации, как описано выше. Как показано на рисунке 6, RFP-ARA7 выделил множественные точечные сигналы почти во всех ячейках, указывая на MVB в этих ячейках (рис. 6B). При слиянии с сигналом ERL1-YFP большая часть ERL1-YFP-положительной пунктаты перекрывалась с пунктатой, помеченной RFP-Ara7. Этот результат позволяет предположить, что некоторые молекулы ERL1-YFP транспортируются в MVB.

Для мониторинга динамики этих быстро движущихся эндосом были собраны изображения временных рядов 7-дневных настоящих листьев, несущих ERL1-YFP и RFP-Ara7 (рис. 7). Временные интервалы в 7 с применялись в течение 203 с, а собранные 30 изображений были использованы для генерации видео в Image J (Видео 1). Видео показало, что эндосомы, меченные ERL1-YFP, перемещаются вместе с RFP-Ara7 в клетках устьичной линии, тем самым подтверждая, что ERL1-YFP локализован в MVB.

Для изучения путей нелегального оборота ERL1 с использованием фармакологического подхода был проанализирован эффект двух широко используемых препаратов мембранного трафика: брефельдина А (BFA) и вортманнина (Wm). БФА, ингибируя фактор АДФ-рибозилирования гуанино-нуклеотидные обменные факторы, включая ГНОМ, может блокировать эндосомальную рециркуляцию и эндоцитоз мембранных белков29. После 30-минутного воздействия раствора БФА ERL1-YFP был обнаружен в некоторых крупных компартментах, известных как тельца БФА (рис. 8B, C). Это указывает на то, что транспорт ERL1 может быть заблокирован BFA, предполагая, что ERL1 подвергается рециркуляции или эндоцитозу. Wm может ингибировать фосфатидилинозитол-3 и фосфатидилинозитол-4 киназы и, таким образом, вызывает слияние MVB5. При обработке Wm в течение 30 мин наблюдались некоторые кольцеобразные структуры, выделенные ERL1-YFP, которые обычно называются Wm-тельцами (рис. 8C). Этот результат указывает на то, что ERL1-YFP транспортируется к MVB, что позволяет предположить, что ERL1 следует по пути к вакуолям для деградации.

Figure 5
Рисунок 5: Одноплоскостное изображение ERL1-YFP. (A) Флуоресцентное изображение, (B) изображение в светлом поле и (C) объединенное изображение показывают, что ERL1-YFP мечет плазматическую мембрану и некоторые высокоподвижные пунктатные клетки в клетках устьичной линии. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Последовательные изображения ERL1-YFP и RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP и (B) RFP-Ara7 помечают точечные сигналы в клетке. Белый пунктат на (C) на объединенном изображении и (D) на врезке указывает на то, что два белка совместно локализуются на MVB в клетках устьичной линии. Белыми стрелками обозначены эндосомы, помеченные как ERL1-YFP, так и RFP-Ara7. Красными стрелками обозначены эндосомы, помеченные RFP-Ara7. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Изображения временных рядов ERL1-YFP и RFP-Ara7. Снимки были сделаны с интервалом во времени 7 с. Момент времени каждого изображения указан в левом верхнем углу. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Изображения Z-стека ERL1-YFP. (A, B) Изображения Z-стека растений ERL1-YFP, обработанных (A) макетом или (B) BFA. Цифры в правом верхнем углу обозначают положение изображения в z-стеке сверху вниз. Масштабная линейка: 10 мкм. (C) Проекция изображений z-стека ERL1-YFP, обработанных макетом или раствором BFA и макетом или раствором Wm, как показано в правом верхнем углу. Стрелками обозначены агрегационные тела ERL1-YFP, вызванные препаратами. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Видео изображений временных рядов ERL1-YFP и RFP-Ara7. Изображения временных рядов ERL1-YFP и RFP-Ara7 складываются в видео с использованием Фиджи со скоростью 5 кадров/с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эндомембранная система разделяет цитоплазму эукариотической клетки на различные компартменты, что обеспечивает специализированную биологическую функцию этих органелл. Чтобы доставить белки и макромолекулы груза в конечный пункт назначения в нужное время, многочисленные везикулы перемещаются между этими органеллами. Строго регулируемые события мембранного транспорта играют фундаментальную роль в жизнеспособности, развитии и росте клеток. Механизм, регулирующий этот важнейший и сложный процесс, до сих пор мало изучен.

Здесь описано несколько подходов для наблюдения за субклеточной локализацией мембранных белков, анализа совместной локализации между двумя мембранными белками, помеченными различными флуоресцентными белками, мониторинга динамического движения мембранного белка с использованием изображений временных рядов и сбора 3D-информации о мембранном белке путем выполнения z-стековой визуализации, охватывающей всю клетку. Помимо описанных здесь случаев мембранного трафика, эти подходы могут быть легко применены и к другим биологическим процессам. Например, визуализация временных рядов может проводиться в течение длительного периода времени (несколько дней) для мониторинга процесса развития30. Визуализация z-стека может быть выполнена для количественной оценки содержания белка в клетке30. Кроме того, эти подходы к визуализации могут идеально сочетаться с фармакологическими приложениями, включая различные лекарства, гормоны и даже сигналы окружающей среды, что указывает на то, что эти методы визуализации легко применимы к живым биологическим образцам. Помимо гибкости в обработке образцов, описанные здесь методы требуют только экономически доступных приборов, за исключением конфокального микроскопа, и только легкого обучения персонала техническим навыкам, что означает, что эти методы могут быть широко распространены.

Необходимо соблюдать осторожность на нескольких критических этапах протокола. Во-первых, оптимальные концентрации мембранных препаратов варьируются в зависимости от материала и обработки. Предыдущее исследование показало, что 30 мкМ БФА является низкой концентрацией, которая может вызвать формирование характерных телец БФА, не вызывая коллапса аппарата Гольджи в меристемоидах20. Кроме того, 25 мкМ Втм – это низкая, но эффективная концентрация, которая может способствовать формированию тел Wm без серьезного повреждения меристемоидов. При обработке нового материала (различные виды растений, разные части растения и т. д.) концентрация препаратов должна быть соответствующим образом оптимизирована. Во-вторых, для максимального поддержания физиологического состояния образцов во время обработки проростки сохраняют частично нетронутыми (удаляя только семядоли) до этапа визуализации. Настоящие листья препарируют для подготовки предметного стекла, после чего образец визуализируют. Каждый образец должен быть обработан индивидуально, а предметное стекло должно быть изготовлено заново для визуализации. Наконец, как для визуализации z-стека, так и для визуализации временных рядов требуется повторное лазерное сканирование образца. Чтобы свести к минимуму риск фотообесцвечивания и фототоксичности на образцах, настоятельно рекомендуется использовать лазер низкой мощности.

Высокая эффективность мембранного транспорта обеспечивается разнообразием путей транспортировки и их кинетики в зависимости от конкретных условий развития и окружающей среды клетки1. Описанные методы имеют ограниченное пространственно-временное разрешение, поэтому появляются более сложные методы световой микроскопии для получения подробных знаний о мембранном движении внутри эукариотической клетки. Например, микроскопия сверхвысокого разрешения, включая стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию (STORM) и фотоактивированную локализационную микроскопию (PALM), значительно увеличивает пространственное разрешение флуоресцентно-меченого белка31,32, хотя можно анализировать только фиксированные образцы; Микроскопия с вращающимся диском существенно ускоряет скорость сканирования и снижает фотообесцвечивание образцов33, хотя с помощью этого метода сложно регистрировать динамику белков с низкой распространенностью; светолистовая микроскопия обеспечивает быструю и щадящую 3D-визуализацию34,35; а двухфотонная микроскопия позволяет обнаруживать флуоресцентные сигналы из более глубоких тканей35,36, хотя и за счет несколько более низкого разрешения и т.д. Кроме того, химическая биология выявила более специфические наркотики, препятствующие определенным путям незаконного оборота. Несмотря на ограничения, эти методы вместе с другими новыми передовыми методами значительно улучшат наши знания и прольют свет на механизмы системы транспортировки клеточных мембран.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-2217757) (X.Q.) и Университетом медицинских наук Арканзаса (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

Tags

Биология выпуск 195
Основанные на изображениях методы изучения событий мембранного транспорта в клетках устьичной линии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter