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Biology

Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Vários métodos comumente usados são introduzidos aqui para estudar os eventos de tráfego de membrana de uma quinase do receptor de membrana plasmática. Este manuscrito descreve protocolos detalhados, incluindo a preparação do material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais.

Abstract

Em células eucarióticas, os componentes da membrana, incluindo proteínas e lipídios, são transportados espaço-temporalmente para seu destino dentro do sistema endomembrana. Isso inclui o transporte secretor de proteínas recém-sintetizadas para a superfície celular ou para o exterior da célula, o transporte endocítico de cargas extracelulares ou componentes da membrana plasmática para dentro da célula, e a reciclagem ou transporte de cargas entre as organelas subcelulares, etc. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental de todas as células eucarióticas e, portanto, estão sob regulamentação rigorosa. As quinases dos receptores de superfície celular, que percebem os sinais dos ligantes do espaço extracelular, sofrem transporte secretor e endocítico. Abordagens comumente usadas para estudar os eventos de tráfego de membrana usando uma quinase do receptor de leucina rica em repetição localizada na membrana plasmática, ERL1, são descritas aqui. As abordagens incluem preparação de material vegetal, tratamento farmacológico e configuração de imagens confocais. Para monitorar a regulação espaço-temporal do ERL1, este estudo descreve a análise de co-localização entre ERL1 e uma proteína marcador de corpo multivesicular, RFP-Ara7, a análise de séries temporais dessas duas proteínas e a análise z-stack de ERL1-YFP tratadas com os inibidores de tráfego de membrana brefeldina A e wortmannina.

Introduction

O tráfego de membranas é um processo celular conservado que distribui componentes da membrana (também conhecidos como cargas), incluindo proteínas, lipídios e outros produtos biológicos, entre diferentes organelas dentro de uma célula eucariótica ou através da membrana plasmática de e para o espaço extracelular1. Esse processo é facilitado por uma coleção de membranas e organelas denominada sistema endomembrana, que consiste na membrana nuclear, no retículo endoplasmático, no aparelho de Golgi, no vacúolo/lisossomos, na membrana plasmática e em múltiplos endossomos1. O sistema de endomembrana permite a modificação, empacotamento e transporte de componentes da membrana usando vesículas dinâmicas que transitam entre essas organelas. Os eventos de tráfico de membranas são cruciais para o desenvolvimento, crescimento e adaptação ambiental das células e, portanto, estão sob regulação rigorosa e complexa2. Atualmente, múltiplas abordagens em biologia molecular, biologia química, microscopia e espectrometria de massas têm sido desenvolvidas e aplicadas ao campo do tráfego de membranas e têm avançado muito o entendimento da regulação espaço-temporal do sistema endomembrana3,4. A biologia molecular é usada para manipulações genéticas clássicas dos possíveis atores envolvidos no tráfico de membranas, como alterar a expressão gênica da proteína de interesse ou rotular a proteína de interesse com certas etiquetas. Ferramentas em biologia química incluem o uso de moléculas que interferem especificamente no tráfego de determinadas rotas 4,5. A espectrometria de massas é poderosa para identificar os componentes de uma organela que foi isolada mecanicamente por abordagens bioquímicas 3,4. No entanto, o tráfego de membranas é um processo biológico dinâmico, diversificado e complexo1. Para visualizar o processo de tráfego de membranas em células vivas sob várias condições, a microscopia de luz é uma ferramenta essencial. Progressos contínuos têm sido feitos em técnicas avançadas de microscópio para superar os desafios na medição da eficiência, cinética e diversidade dos eventos4. Aqui, este estudo se concentra nas metodologias amplamente adotadas em biologia química/farmacológica, biologia molecular e microscopia para estudar eventos de tráfego de membranas em um sistema naturalmente simplificado e experimentalmente acessível, o processo de desenvolvimento estomático.

Estomatas são microporos na superfície aérea das plantas que se abrem e fecham para facilitar as trocas gasosas entre as células internas e o ambiente 6,7,8. Assim, os estômatos são essenciais para a fotossíntese e transpiração, dois eventos cruciais para a sobrevivência e crescimento das plantas. O desenvolvimento estomático é ajustado dinamicamente por pistas ambientais para otimizar a adaptação da planta ao entorno9. Remontando a estudos realizados em 2002, a identificação da proteína receptora Too Many Mouths (TMM) abriu as portas para uma nova era de investigação dos mecanismos moleculares do desenvolvimento estomático na planta-modelo Arabidopsis thaliana10. Após apenas algumas décadas, uma via de sinalização clássica foi identificada. De montante para jusante, essa via inclui um grupo de ligantes peptídicos secretores na família dos fatores de padronização epidérmica (EFP), várias quinases de receptores de repetição rica em leucina (LRR) de superfície celular da família EREECTA (ER), a proteína TMM do receptor LRR, uma cascata MAPK e vários fatores de transcrição bHLH, incluindo SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA, e SCREAM (SCRM)11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Trabalhos anteriores indicam que uma das quinases receptoras, ER-LIKE 1 (ERL1), demonstra comportamentos subcelulares ativos sobre a percepção do PFE20. O ERL2 também trafega dinamicamente entre a membrana plasmática e algumas organelas intracelulares27. O bloqueio das etapas de tráfego da membrana causa padrões estomáticos anormais, resultando em aglomerados estomáticos na superfície foliar28. Estes resultados sugerem que o tráfego de membranas desempenha um papel essencial no desenvolvimento estomático. Este estudo descreve um protocolo para investigar espaço-temporalmente a dinâmica do ERL1 usando análise de co-localização subcelular proteína-proteína combinada com tratamento farmacológico usando alguns inibidores do tráfego de membrana.

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Protocol

1. Preparação das soluções

  1. Preparar a solução de esterilização de sementes misturando 15 mL de água sanitária com 35 mL de água destilada e 50 μL de Triton X-100.
  2. Preparar a solução de brefeldina A (BFA) dissolvendo o pó de BFA em etanol até uma concentração final de 10 mM (stock). Preparar a solução de wortmannin (Wm) dissolvendo o pó de Wm em DMSO até uma concentração final de 10 mM (stock).

2. Semeando as sementes

  1. Alíquota 10-50 sementes de cada uma das plantas transgênicas necessárias em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 1 mL de solução de esterilização de sementes em cada tubo e misture bem invertendo o tubo suavemente por 10 min em um agitador.
  2. Eliminar a solução de esterilização das sementes e lavá-las cinco vezes com 1 mL de água destilada autoclavada.
  3. Adicionar 300 μL de água destilada autoclavada em cada tubo e semear as sementes em meio MS de meia força contendo 1% (p/v) de sacarose e 0,75% (p/v) de ágar. Suplemente o meio com os antibióticos correspondentes, conforme necessário.
  4. Manter a placa de cabeça para baixo a 4 °C no escuro por 2 dias para sincronizar a germinação.
  5. Após 2 dias, transferir a placa para uma sala de crescimento com um ciclo claro/8 h escuro de 16 h (80 μmol/m2/s1) a 22 °C. Este é considerado o primeiro dia pós-germinação (1 dpg).
  6. Transplantar as mudas para o solo a 10 dpg para posterior crescimento.

3. Preparação de plantas transgênicas F1 bicolores

  1. Cultivar plantas transgênicas homozigotas com ERL1-YFP (planta A) e plantas transgênicas homozigotas com uma proteína marcada com RFP RFP-Ara7 (planta B)20 lado a lado até florescer em uma sala de crescimento com um ciclo de 16 h claro/8 h escuro (80 μmol/m2/s1) a 22 °C.
  2. Escolha uma inflorescência jovem da planta A. Mantenha uma flor que está prestes a se abrir na inflorescência para cruzamentos genéticos. Retire todas as flores e siliques mais velhas. Além disso, remova cuidadosamente as flores mais jovens e os meristemas florais para evitar confusão futura.
  3. Disseque suavemente a flor fechada removendo as sépalas, pétalas e estames usando um par de pinças afiadas. Deixe apenas o pistilo sobre a inflorescência.
  4. Pegue um estame maduro de uma flor aberta na planta B e deposite os grãos de pólen no estigma do pistilo dissecado na planta A.
  5. Rotule esta flor cruzada manualmente, indicando seu pai, mãe e a data do cruzamento genético. Deixe a flor amadurecer e colha as sementes F1 quando a silique ficar amarela/marrom (~20 dias após a cruz). Verifique se há uma planta de F1 bem-sucedida que tenha sinais YFP e RFP.

4. Tratamento farmacológico

  1. Para o tratamento com BFA, remova os cotilédones de plântulas com 7 dias de idade, mergulhe o restante das mudas em uma solução simulada (etanol 0,3%) ou solução de BFA 30 μM, aplique vácuo por 1 min e mantenha a amostra imersa por 30 min antes da obtenção de imagens.
  2. Para o tratamento com wortmannina, remova os cotilédones de plântulas com 7 dias de idade, mergulhe o restante das mudas em solução de DMSO 0,25% ou wortmannin 25 mM, aplique vácuo por 1 min e mantenha a amostra imersa por 30 min antes da obtenção de imagens.
  3. Para o tratamento a vácuo das amostras, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 500 μL da solução do fármaco correspondente e imergir as plântulas dissecadas na solução. Fixar firmemente uma seringa de 10 mL no tubo da microcentrífuga e aplicar vácuo por 1 min (Figura 1). Retire a seringa e mantenha a amostra na solução durante o tempo necessário. Retire delicadamente as mudas para o preparo das imagens.

Figure 1
Figura 1: Dispositivo de vácuo simples. Uma seringa de 10 mL é conectada a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para o tratamento a vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Preparação da amostra para aquisição de imagens

  1. Dissecar a folha verdadeira da amostra tratada usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque suavemente a folha verdadeira em uma gota de água em uma lâmina de vidro e mantenha o lado abaxial para cima. Cubra lentamente a folha verdadeira com uma lamínula, evitando prender bolhas.

6. Imagem confocal

NOTA: Um microscópio confocal de varredura invertido Leica SP8 foi usado para obter imagens do sinal de fluorescência das amostras neste trabalho.

  1. Configuração do caminho do feixe
    1. Selecione um laser de 514 nm para excitação YFP. Utilize um alto poder de laser para aumentar a intensidade do sinal e, assim, obter alta qualidade de imagem. No entanto, potências do laser acima de 5% correm o risco de fotoclareamento, e a saúde da amostra pode ser afetada. Se o sinal da amostra não for muito fraco, comece com baixa intensidade de laser.
    2. Ative o PMT/HyD para detecção e defina os limites superior e inferior da banda de emissão com base no espectro do fluoróforo YFP. Defina uma janela de detecção de 530-570 nm para coletar o sinal YFP.
    3. Imagem sequencial para a segunda cor: Clique no botão Seq e adicione um novo canal. Por padrão, o caminho do feixe YFP projetado anteriormente será Seq 1. Em Seq 2, selecione um laser de 561 nm para a excitação de RFP e defina uma janela de detecção de 570-630 nm para coletar o sinal de RFP.
  2. Configuração das condições de varredura (Figura 2)
    1. Para obter imagens da atividade de tráfego da membrana subcelular dentro das células precursoras estomáticas, escolha uma lente Corr de 63x/1,2 W no sistema de aquisição de imagens.
    2. O formato refere-se ao tamanho da imagem em pixels. Comece com 1.024 pixels x 1.024 pixels e, em seguida, otimize isso com base no fator de zoom e nas configurações de objetivo para uma boa resolução da qualidade da publicação.
    3. A velocidade refere-se à velocidade do canseiro à medida que o laser passa sobre cada pixel. Embora as velocidades de varredura lentas geralmente resultem em uma melhor relação sinal-ruído, elas podem não capturar com eficiência os eventos de tráfego de membrana que mudam rapidamente. Comece com uma velocidade de 400 Hz e otimize-a com base na situação específica das amostras.
    4. O fator de zoom é usado para ampliar uma região de interesse sem alterar a lente objetiva. Comece com um fator de zoom de 1 e otimize-o com base nas necessidades específicas do experimento.
    5. A média da linha refere-se ao número de vezes que cada linha X será digitalizada para obter um resultado médio. Uma média de linha maior reduz o ruído na imagem resultante, mas também aumenta o tempo de digitalização e o tempo de exposição à luz laser. Para criar imagens de eventos de tráfego de membrana, não use uma média de linha alta. Comece com uma média de 2x linhas e otimize conforme necessário.
  3. Coletando uma série temporal
    NOTA: Ao estudar eventos de tráfego de membrana, uma série temporal é frequentemente necessária para registrar o movimento rápido dos endossomos subcelulares.
    1. No Modo de Aquisição, selecione o modo de varredura xyt para habilitar o utilitário de série temporal.
    2. Decida um período de espera entre os pontos de tempo em Intervalo de tempo. Alternativamente , clique em Minimizar para tirar as imagens imediatamente uma após a outra. Um intervalo de tempo de 7 s foi usado no experimento de série temporal seguinte.
    3. Selecione Duração e insira o tempo total de execução do experimento. Como alternativa, defina o número de quadros a serem coletados selecionando Quadros (Figura 3).
  4. Para coletar as informações tridimensionais sobre o evento de tráfego de membrana dentro de toda a célula, use o modo de varredura Z-stack. A projeção de intensidade máxima das imagens Z-stack é frequentemente usada para a análise.
    1. Selecione o modo de verificação xyz no Modo de aquisição e, em seguida, o utilitário Z-Stack ficará acessível.
    2. Selecione a opção Z-wide. No Modo de varredura, defina a imagem superior e a imagem inferior da pilha Z usando os botões Início e Fim.
    3. Defina a espessura do z-step clicando no tamanho z-step. Alternativamente, defina quantas imagens tirar para cobrir toda a faixa da pilha Z. Para garantir a consistência entre as amostras, defina o tamanho do passo z (Figura 4).
  5. Processamento de imagens
    1. A projeção de intensidade máxima das imagens z-stack é gerada pelo software confocal (http://www.leica-microsystems.com). Na guia Processo principal, primeiro escolha o arquivo z-stack interessado na guia Abrir projetos no lado esquerdo. Em seguida, alterne para a guia do meio chamada Ferramentas de Processo, selecione a função Projeção , escolha Máximo no painel suspenso de Método e clique no botão Aplicar . Uma imagem de projeção z-stack será gerada na guia Abrir projetos.
    2. O vídeo das imagens da série temporal é gerado por Fiji (https://imagej.net/Fiji). Na guia Arquivo , use a função Abrir para abrir todas as imagens de séries temporais na ordem correta. Na guia Imagem , localize a função Pilha e escolha Imagens a serem empilhadas para gerar um vídeo. Salve o arquivo no formato .avi com a taxa de quadros desejada (5 quadros/s para o Vídeo 1).

Figure 2
Figura 2: O painel do modo de varredura da dimensão XY. O painel do modo de digitalização é usado para configurar as condições de digitalização da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O utilitário de série temporal no modo de varredura xyt. O utilitário de série temporal é usado para configurar as condições de imagem para coletar consecutivamente uma série de imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: O utilitário z-stack no modo de varredura xyz. O utilitário z-stack é usado para configurar as condições de imagem para coletar uma série de imagens no eixo z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Um estudo anterior indicou que ERL1 é um receptor quinase ativo que sofre eventos dinâmicos de tráfego de membrana20. ERL1 é uma quinase transmembrana do receptor LRR na membrana plasmática. O ERL1 recém-sintetizado no retículo endoplasmático é processado nos corpos de Golgi e posteriormente transportado para a membrana plasmática. As moléculas de ERL1 na membrana plasmática podem perceber ligantes de FPE usando seu domínio LRR extracelular18. Após a ativação pelos FPEs inibitórios, incluindo o EPF1, o ERL1 é internalizado nos endossomos, transportado para os corpos multivesiculares (MVB) e, em seguida, transportado para os vacúolos para degradação para encerrar o sinal20. Em contraste, o ligante antagonista EPFL9, que promove a formação estomática14, retém ERL1 no retículo endoplasmático. Alternativamente, o ERL1 localizado na membrana plasmática pode reciclar entre os endossomos e a membrana plasmática20.

Aqui, plantas transgênicas portadoras do promotor ERL1::ERL1-YFP foram cultivadas por 7 dias seguindo o protocolo mencionado acima. Quando recém-emergida, a folha verdadeira foi dissecada para exames de imagem, pois ERL1 é expresso apenas em células de linhagem estomática em folhasjovens20. Como esperado, as células dispersas foram destacadas pelo sinal YFP, onde ERL1-YFP marcou a membrana plasmática (Figura 5). Além disso, múltiplos sinais puntiformes também foram observados, sugerindo que o ERL1 também estava localizado nos endossomos.

Várias organelas em células vegetais apresentam-se como sinais fluorescentes puntiformes quando observadas ao microscópio de luz, como a rede trans-Golgi e os MVBs. Quando a linhagem do marcador MVB contendo RFP-Ara7 foi geneticamente cruzada com a linha transgênica ERL1-YFP , ambas as proteínas do marcador foram observadas usando a abordagem de imagem sequencial como descrito acima. Como mostrado na Figura 6, RFP-Ara7 destacou múltiplos sinais puntiformes em quase todas as células, indicando os MVBs nessas células (Figura 6B). Ao se fundir com o sinal ERL1-YFP, a maioria do punctate positivo para ERL1-YFP sobrepôs-se ao punctate marcado com RFP-Ara7. Este resultado sugere que algumas das moléculas de ERL1-YFP são transportadas para os MVBs.

Para monitorar a dinâmica desses endossomos de movimento rápido, imagens de séries temporais das folhas verdadeiras de 7 dias de idade com ERL1-YFP e RFP-Ara7 foram coletadas (Figura 7). Foram aplicados intervalos de tempo de 7 s para 203 s, e as 30 imagens coletadas foram utilizadas para gerar um vídeo na Imagem J (Vídeo 1). O vídeo mostrou que os endossomos marcados com ERL1-YFP se moviam junto com RFP-Ara7 dentro das células da linhagem estomatal, confirmando assim que ERL1-YFP estava localizado nas MVBs.

Para examinar as rotas de tráfico de ERL1 usando uma abordagem farmacológica, o efeito de duas drogas de tráfico de membrana comumente usadas, brefeldina A (BFA) e wortmannin (Wm), foram analisadas. O BFA, ao inibir os fatores de troca guanina-nucleotídeos do fator ADP-ribosilação, incluindo o GNOM, pode bloquear a reciclagem endossômica e a endocitose de proteínas de membrana29. Após 30 min de exposição à solução de BFA, ERL1-YFP foi detectado em alguns grandes compartimentos conhecidos como corpos de BFA (Figura 8B, C). Isso indica que o tráfico de ERL1 pode ser bloqueado pelo BFA, sugerindo que o ERL1 sofre reciclagem ou endocitose. Wm pode inibir fosfatidilinositol-3 e fosfatidilinositol-4 quinases e, assim, causar a fusão de MVBs5. Quando tratados com Wm por 30 min, foram observadas algumas estruturas anelares destacadas por ERL1-YFP, que são tipicamente chamadas de corpos Wm (Figura 8C). Este resultado indica que ERL1-YFP é transportado para MVBs, sugerindo que ERL1 segue a rota para vacúolos para degradação.

Figure 5
Figura 5: Imagem de plano único de ERL1-YFP. (A) A imagem de fluorescência, (B) a imagem de campo brilhante e (C) a imagem mesclada mostram que ERL1-YFP marca a membrana plasmática e alguns puntiformes altamente móveis dentro das células de linhagem estomática. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagens sequenciais de ERL1-YFP e RFP-Ara7. (A) ERL1-YFP e (B) RFP-Ara7 ambos rotulam sinais puntiformes dentro da célula. O punctate branco em (C) a imagem mesclada e (D) a imagem inserida indica que as duas proteínas co-localizam-se nos MVBs dentro das células da linhagem estomática. As setas brancas indicam endossomos marcados tanto por ERL1-YFP quanto por RFP-Ara7. As setas vermelhas indicam endossomos marcados por RFP-Ara7. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Imagens de séries temporais de ERL1-YFP e RFP-Ara7. As imagens foram realizadas com intervalo de tempo de 7 s. O ponto de tempo de cada imagem é indicado no canto superior esquerdo. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Imagens Z-stack de ERL1-YFP. (A, B) Imagens Z-stack das plantas ERL1-YFP tratadas com (A) mock ou (B) BFA. Os números no canto superior direito indicam a posição da imagem na pilha z de cima para baixo. Barra de escala: 10 μm. (C) Projeção das imagens z-stack de ERL1-YFP tratadas com solução mock ou BFA e mock ou solução Wm, conforme indicado no canto superior direito. As setas indicam os corpos de agregação de ERL1-YFP causados pelas drogas. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo das imagens de séries temporais de ERL1-YFP e RFP-Ara7. As imagens de séries temporais de ERL1-YFP e RFP-Ara7 são empilhadas em um vídeo usando Fiji a uma velocidade de 5 quadros / s. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

O sistema de endomembrana separa o citoplasma de uma célula eucariótica em diferentes compartimentos, o que possibilita a função biológica especializada dessas organelas. Para entregar proteínas de carga e macromoléculas ao seu destino final no momento certo, inúmeras vesículas são guiadas para transportar entre essas organelas. Eventos de tráfico de membrana altamente regulados desempenham papéis fundamentais na viabilidade, desenvolvimento e crescimento das células. O mecanismo que regula esse processo crucial e complicado ainda é pouco compreendido.

Várias abordagens foram descritas aqui para observar a localização subcelular de proteínas de membrana, analisar a co-localização entre duas proteínas de membrana marcadas com diferentes proteínas fluorescentes, monitorar o movimento dinâmico de uma proteína de membrana usando imagens de séries temporais e coletar informações 3D sobre uma proteína de membrana realizando imagens z-stack cobrindo toda a célula. Além dos eventos de tráfico de membranas aqui descritos, essas abordagens podem ser facilmente aplicadas a outros processos biológicos. Por exemplo, as imagens de séries temporais podem ser realizadas em um período de longo prazo (vários dias) para monitorar um processo de desenvolvimento30. A imagem z-stack pode ser realizada para quantificar a abundância de uma proteína dentro de uma célula30. Além disso, essas abordagens de imagem podem perfeitamente combinar-se com aplicações farmacológicas, incluindo vários medicamentos, hormônios e até mesmo pistas ambientais, indicando que essas abordagens de imagem são facilmente aplicáveis a amostras biológicas vivas. Além da flexibilidade no tratamento das amostras, os métodos aqui descritos requerem apenas dispositivos economicamente acessíveis, exceto o microscópio confocal, e apenas treinamento leve do pessoal nas habilidades técnicas, o que significa que esses métodos podem ser amplamente adotados.

É preciso cautela em várias etapas críticas do protocolo. Primeiro, as concentrações ideais das drogas de tráfico de membrana variam dependendo do material e do tratamento. Um estudo prévio sugere que 30 μM de AGB é uma baixa concentração que pode desencadear a formação de corpos característicos de AGB sem causar o colapso do aparelho de Golgi em meristemoides20. Da mesma forma, 25 μM Wm é uma concentração baixa, mas eficaz, que pode conferir a formação do corpo Wm sem danificar severamente os meristemoides. Quando um novo material (diferentes espécies vegetais, diferentes partes da planta, etc.) é tratado, as concentrações dos medicamentos precisam ser otimizadas de acordo. Segundo, para manter ao máximo a condição fisiológica das amostras durante o tratamento, as plântulas são mantidas parcialmente intactas (apenas removendo os cotilédones) até a etapa de imageamento. As folhas verdadeiras são dissecadas para a preparação da lâmina, e a amostra é fotografada posteriormente. Cada amostra precisa ser tratada individualmente, e a lâmina precisa ser feita na hora para geração de imagens. Por fim, tanto a imagem z-stack quanto a imagem de série temporal exigem varredura a laser repetida da amostra. Para minimizar o risco de fotobranqueamento e fototoxicidade nas amostras, recomenda-se fortemente uma baixa potência do laser.

A alta eficiência dos eventos de tráfico de membranas é garantida pela diversidade das rotas de tráfico e sua cinética em resposta às condições específicas de desenvolvimento e ambiente da célula1. Os métodos descritos têm resolução espaço-temporal limitada, de modo que técnicas mais sofisticadas de microscopia de luz estão surgindo para obter conhecimento detalhado do tráfego de membranas dentro de uma célula eucariótica. Por exemplo, a microscopia de super-resolução, incluindo a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e a microscopia de localização fotoativada (PALM), aumentam consideravelmente a resolução espacial de uma proteína marcada com fluorescência31,32, embora apenas amostras fixas possam ser analisadas; a microscopia de disco giratório acelera substancialmente a velocidade de varredura e reduz o fotobranqueamento das amostras33, embora seja desafiador registrar a dinâmica de proteínas com baixa abundância usando esse método; a microscopia de folha de luz fornece imagens 3D rápidas e suaves34,35; e a microscopia de dois fótons permite a detecção de sinais de fluorescência de tecidos mais profundos35,36, embora ao custo de resolução ligeiramente menor, etc. Além disso, a biologia química identificou drogas mais específicas interferindo em determinadas rotas de tráfico. Apesar das limitações, essas técnicas, juntamente com outras técnicas avançadas emergentes, melhorarão muito nosso conhecimento e lançarão luz sobre os mecanismos do sistema de tráfego de membrana celular.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) e pela University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan. Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).
  3. Lyu, Z., Genereux, J. C. Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes. ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).
  4. Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion. Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).
  5. Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation. Frontiers in Plant Science. 7, 756 (2016).
  6. Qi, X., Torii, K. U. Hormonal and environmental signals guiding stomatal development. BMC Biology. 16 (1), 21 (2018).
  7. Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues. Frontiers in Plant Science. 12, 751852 (2021).
  8. Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress. Frontiers in Plant Science. 12, 615114 (2021).
  9. Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).
  10. Yang, M., Sack, F. D. The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis. Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).
  11. Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule. Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).
  12. Hara, K., et al. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves. Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).
  13. Hunt, L., Gray, J. E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development. Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).
  14. Sugano, S. S., et al. Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis. Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).
  15. Kondo, T., et al. Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule. Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).
  16. Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development. New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).
  17. Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases. Science. 309 (5732), 290-293 (2005).
  18. Lin, G., et al. A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development. Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).
  19. Lee, J. S., et al. Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning. Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).
  20. Qi, X., et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, e58097 (2020).
  21. MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage. Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).
  22. Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata. Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).
  23. Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development. Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).
  24. Kanaoka, M. M., et al. SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation. Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).
  25. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).
  26. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).
  27. Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases. Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).
  28. Le, J., et al. Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development. Nature Communications. 5, 3090 (2014).
  29. Geldner, N., et al. The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth. Cell. 112 (2), 219-230 (2003).
  30. Qi, X., et al. Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling. Elife. 6, 24102 (2017).
  31. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  32. Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. Label-free super-resolution imaging techniques. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).
  33. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  34. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), (2019).
  35. Nwaneshiudu, A., et al. Introduction to confocal microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).
  36. Sanderson, J. Multi-photon microscopy. Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).

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Biologia Edição 195
Métodos Baseados em Imagem para Estudo de Eventos de Tráfego de Membranas em Células de Linhagem Estomática
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He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

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