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Biology

स्टोमेटा वंश कोशिकाओं में झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए छवि-आधारित तरीके

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65257
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biology, Rutgers University, 2Pharmacology and Toxicology Department, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर काइनेज की झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए यहां कई आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीके पेश किए गए हैं। यह पांडुलिपि पौधे सामग्री की तैयारी, औषधीय उपचार और कॉन्फोकल इमेजिंग सेटअप सहित विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

यूकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रोटीन और लिपिड सहित झिल्ली घटकों को एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम के भीतर उनके गंतव्य तक पहुंचाया जाता है। इसमें कोशिका की सतह या कोशिका के बाहर नए संश्लेषित प्रोटीन का स्रावी परिवहन, कोशिका में बाह्य कार्गो या प्लाज्मा झिल्ली घटकों का एंडोसाइटिक परिवहन और उपकोशिकीय जीवों के बीच कार्गो का पुनर्चक्रण या शटलिंग परिवहन आदि शामिल हैं। झिल्ली तस्करी की घटनाएं सभी यूकेरियोटिक कोशिकाओं के विकास, विकास और पर्यावरणीय अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार, कड़े विनियमन के अधीन हैं। सेल-सतह रिसेप्टर किनेसेस, जो बाह्य अंतरिक्ष से लिगैंड संकेतों का अनुभव करते हैं, स्रावी और एंडोसाइटिक परिवहन दोनों से गुजरते हैं। प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत ल्यूसीन-समृद्ध-रिपीट रिसेप्टर काइनेज, ईआरएल 1 का उपयोग करके झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण यहां वर्णित हैं। दृष्टिकोण में पौधे सामग्री की तैयारी, औषधीय उपचार और कॉन्फोकल इमेजिंग सेटअप शामिल हैं। ईआरएल 1 के स्थानिक विनियमन की निगरानी के लिए, यह अध्ययन ईआरएल 1 और एक बहु-वेसिकुलर बॉडी मार्कर प्रोटीन, आरएफपी-आरा 7, इन दो प्रोटीनों के समय श्रृंखला विश्लेषण और ईआरएल 1-वाईएफपी के जेड-स्टैक विश्लेषण के बीच सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का वर्णन करता है।

Introduction

झिल्ली यातायात एक संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया है जो प्रोटीन, लिपिड और अन्य जैविक उत्पादों सहित झिल्ली घटकों (जिसे कार्गो के रूप में भी जाना जाता है) को एक यूकेरियोटिक कोशिका के भीतर या प्लाज्मा झिल्ली के पार विभिन्न जीवों के बीच वितरित करताहै। इस प्रक्रिया को एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम नामक झिल्ली और ऑर्गेनेल के संग्रह द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है, जिसमें परमाणु झिल्ली, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, गोल्गी तंत्र, रिक्तिका / लाइसोसोम, प्लाज्मा झिल्ली और कई एंडोसोम1 होते हैं। एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम गतिशील पुटिकाओं का उपयोग करके झिल्ली घटकों के संशोधन, पैकेजिंग और परिवहन को सक्षम बनाता है जो इन ऑर्गेनेल के बीच शटल करते हैं। झिल्ली तस्करी की घटनाएं कोशिका विकास, विकास और पर्यावरणीय अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं और इस प्रकार, कठोर और जटिल विनियमन2 के तहत हैं। वर्तमान में, आणविक जीव विज्ञान, रासायनिक जीव विज्ञान, माइक्रोस्कोपी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और झिल्ली तस्करी के क्षेत्र में लागू किए गए हैं और एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम 3,4 के स्थानिक विनियमन की समझ को बहुत उन्नत किया है। आणविक जीव विज्ञान का उपयोग झिल्ली तस्करी में शामिल कथित खिलाड़ियों के शास्त्रीय आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए किया जाता है, जैसे कि रुचि के प्रोटीन की जीन अभिव्यक्ति को बदलना या कुछ टैग के साथ रुचि के प्रोटीन को लेबल करना। रासायनिक जीव विज्ञान में उपकरणों में अणुओं का उपयोग शामिल है जो विशेष रूप से कुछ मार्गों 4,5 के यातायात में हस्तक्षेप करते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक ऑर्गेनेल में घटकों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली है जिसे जैव रासायनिक दृष्टिकोण 3,4 द्वारा यांत्रिक रूप से अलग किया गया है। हालांकि, झिल्ली यातायात एक गतिशील, विविध और जटिल जैविक प्रक्रियाहै। विभिन्न परिस्थितियों में जीवित कोशिकाओं में झिल्ली तस्करी प्रक्रिया की कल्पना करने के लिए, प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक आवश्यक उपकरण है। घटनाओं की दक्षता, कैनेटीक्स और विविधता को मापने में चुनौतियों को दूर करने के लिए उन्नत माइक्रोस्कोप तकनीकों में निरंतर प्रगति की गई है। फार्माकोलॉजिकल जीव विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान और माइक्रोस्कोपी में व्यापक रूप से अपनाई गई पद्धतियों पर ध्यान केंद्रित किया गया है ताकि प्राकृतिक रूप से सरलीकृत और प्रयोगात्मक रूप से सुलभ प्रणाली, स्टोमेटा विकास प्रक्रिया में झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन किया जा सके।

स्टोमेटा पौधे की हवाई सतहों पर सूक्ष्म छिद्र होते हैं जो आंतरिक कोशिकाओं और पर्यावरण 6,7,8 के बीच गैस विनिमय की सुविधा के लिए खुलते और बंद होते हैं। इसलिए, प्रकाश संश्लेषण और वाष्पोत्सर्जन के लिए स्टोमेटा आवश्यक हैं, दो घटनाएं जो पौधे के अस्तित्व और विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्टोमेटा विकास को पर्यावरण संकेतों द्वारा गतिशील रूप से समायोजित किया जाता है ताकि परिवेश 9 के लिए पौधे के अनुकूलन को अनुकूलित किया जासके। 2002 में किए गए अध्ययनों में, रिसेप्टर प्रोटीन टू मैनी माउथ्स (टीएमएम) की पहचान ने मॉडल प्लांट एराबिडोप्सिस थैलियाना10 में स्टोमेटा विकास के आणविक तंत्र की जांच के एक नए युग के लिए दरवाजा खोल दिया। कुछ ही दशकों के बाद, एक शास्त्रीय सिग्नलिंग मार्ग की पहचान की गई है। अपस्ट्रीम से डाउनस्ट्रीम तक, इस मार्ग में एपिडर्मल पैटर्निंग फैक्टर्स (ईएफपी) परिवार में स्रावी पेप्टाइड लिगेंड का एक समूह, ईआरईसीटीए (ईआर) परिवार में कई सेल-सतह ल्यूसीन-रिच-रिपीट (एलआरआर) रिसेप्टर किनेसेस, एलआरआर रिसेप्टर प्रोटीन टीएमएम, एक एमएपीकैस्केड, और कई बीएचएलएच ट्रांसक्रिप्शन कारक शामिल हैं, जिनमें निशब्द (एसपीसीएच), म्यूट, एफएएमए, और स्क्रीम (एससीआरएम) 11,12,13,14 शामिल हैं। 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. पिछला काम इंगित करता है कि रिसेप्टर किनेसेस में से एक, ईआर-लाइक 1 (ईआरएल 1), ईपीएफ धारणा20 पर सक्रिय उपकोशिकीय व्यवहार प्रदर्शित करता है। ईआरएल 2 भी गतिशील रूप से प्लाज्मा झिल्ली और कुछ इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल27 के बीच यातायात करता है। झिल्ली तस्करी चरणों को अवरुद्ध करने से असामान्य स्टोमेटा पैटर्निंग होती है, जिसके परिणामस्वरूप पत्तीकी सतह पर स्टोमेटा क्लस्टर होते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि झिल्ली यातायात रंध्र के विकास में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। यह अध्ययन कुछ झिल्ली तस्करी अवरोधकों का उपयोग करके औषधीय उपचार के साथ संयुक्त प्रोटीन-प्रोटीन उपकोशिकीय सह-स्थानीयकरण विश्लेषण का उपयोग करके ईआरएल 1 गतिशीलता की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

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Protocol

1. समाधान की तैयारी

  1. 35 मिलीलीटर आसुत जल के साथ 15 मिलीलीटर ब्लीच और ट्राइटन एक्स -100 के 50 μL को मिलाकर बीज नसबंदी समाधान तैयार करें।
  2. इथेनॉल में बीएफए पाउडर को 10 एमएम (स्टॉक) की अंतिम एकाग्रता में घोलकर ब्रेफेल्डिन ए (बीएफए) समाधान तैयार करें। डीएमएसओ में डब्ल्यूएम पाउडर को 10 एमएम (स्टॉक) की अंतिम एकाग्रता में घोलकर वोर्टमैनिन (डब्ल्यूएम) समाधान तैयार करें।

2. बीज बोना

  1. आवश्यक ट्रांसजेनिक पौधों में से प्रत्येक से 10-50 बीजों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें। प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर बीज नसबंदी घोल जोड़ें, और एक शेकर पर 10 मिनट के लिए ट्यूब को धीरे से घुमाकर अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. बीज नसबंदी समाधान को त्याग दें, और बीज को 1 मिलीलीटर आटोक्लेव आसुत जल से पांच बार धो लें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 300 μL आटोक्लेव आसुत जल जोड़ें, और 1% (w / v) सुक्रोज और 0.75% (w / v) आगर युक्त आधी ताकत वाले एमएस मीडिया पर बीज बोएं। आवश्यकतानुसार संबंधित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ माध्यम को पूरक करें।
  4. अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए 2 दिनों के लिए अंधेरे में प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा रखें।
  5. 2 दिनों के बाद, प्लेट को 22 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे चक्र (80 μmol / m2/s1) के साथ एक विकास कक्ष में स्थानांतरित करें। इसे अंकुरण (1 डीपीजी) के बाद पहला दिन माना जाता है।
  6. आगे की वृद्धि के लिए 10 डीपीजी पर मिट्टी में रोपाई करें।

3. दोहरे रंग के एफ 1 ट्रांसजेनिक पौधों की तैयारी

  1. ईआरएल 1-वाईएफपी (प्लांट ए) वाले होमोजीगस ट्रांसजेनिक पौधों और आरएफपी-लेबल मार्कर प्रोटीन आरएफपी-आरा 7 (प्लांट बी) 20 वाले होमोजीगस ट्रांसजेनिक पौधों को 22 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश/8 घंटे अंधेरे चक्र (80 μmol/m2/s1) के साथ विकास कक्ष में फूल आने तक साथ-साथ विकसित करें।
  2. पौधे ए से एक युवा पुष्पक्रम चुनें। एक फूल रखें जो आनुवंशिक क्रॉस के लिए पुष्पक्रम पर खुलने वाला है। सभी पुराने फूलों और सिलिक्स को हटा दें। इसके अतिरिक्त, भविष्य के भ्रम से बचने के लिए छोटे फूलों और पुष्प मेरिस्टेम को ध्यान से हटा दें।
  3. तेज चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके सेपल, पंखुड़ियों और स्टैमेन को हटाकर धीरे से खुले फूल को विच्छेदित करें। केवल पुष्पक्रम पर पिस्टिल छोड़ दें।
  4. पौधे बी पर एक खुले फूल से एक परिपक्व स्टेमेन लें, और पराग कणों को पौधे ए पर विच्छेदित पिस्टिल के कलंक पर जमा करें।
  5. इस मैन्युअल रूप से पार किए गए फूल को उसके पिता, माता और आनुवंशिक क्रॉस की तारीख को इंगित करके लेबल करें। फूल को परिपक्व होने दें, और एफ 1 बीज की कटाई करें जब सिलिक पीला / भूरा हो जाए (क्रॉस के बाद ~ 20 दिन)। एक सफल एफ 1 संयंत्र की जांच करें जिसमें वाईएफपी और आरएफपी सिग्नल दोनों हैं।

4. औषधीय उपचार

  1. बीएफए उपचार के लिए, 7-दिन पुराने रोपाई के कोटिलेडॉन को हटा दें, बाकी रोपाई को या तो मॉक समाधान (0.3% इथेनॉल) या 30 μM BFA समाधान में डुबोएं, 1 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें, और इमेजिंग से पहले नमूने को 30 मिनट के लिए डुबोकर रखें।
  2. वोर्टमैनिन उपचार के लिए, 7-दिन पुराने रोपाई के कोटिलेडोन को हटा दें, बाकी रोपाई को या तो 0.25% डीएमएसओ समाधान या 25 एमएम वोर्टमैनिन में डुबो दें, 1 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें, और इमेजिंग से पहले नमूने को 30 मिनट के लिए डुबोकर रखें।
  3. नमूनों के वैक्यूम उपचार के लिए, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, संबंधित दवा समाधान के 500 μL जोड़ें, और विच्छेदित रोपाई को समाधान में डुबोएं। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 एमएल सिरिंज को कसकर संलग्न करें, और 1 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें (चित्रा 1)। सिरिंज को हटा दें, और आवश्यक समय के लिए समाधान में नमूना रखें। इमेजिंग तैयारी के लिए धीरे-धीरे रोपाई को बाहर निकालें।

Figure 1
चित्र 1: सरल वैक्यूम डिवाइस। वैक्यूम उपचार के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से 10 एमएल सिरिंज जुड़ी होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

  1. एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके उपचारित नमूने से असली पत्ती को विच्छेदित करें। धीरे से असली पत्ती को कांच की स्लाइड पर पानी की एक बूंद में डालें, और अक्षीय पक्ष को ऊपर रखें। किसी भी बुलबुले को फंसाने से बचते हुए धीरे-धीरे असली पत्ती को कवरस्लिप से कवर करें।

6. कॉन्फोकल इमेजिंग

नोट: इस काम में नमूनों के प्रतिदीप्ति संकेत की छवि के लिए एक लीका एसपी 8 उल्टे स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था।

  1. बीम पथ सेटअप
    1. वाईएफपी उत्तेजना के लिए 514 एनएम लेजर का चयन करें। सिग्नल तीव्रता बढ़ाने के लिए एक उच्च लेजर शक्ति का उपयोग करें और इस प्रकार, उच्च छवि गुणवत्ता प्राप्त करें। हालांकि, 5% से ऊपर लेजर शक्तियां फोटोब्लीचिंग का खतरा चलाती हैं, और नमूने का स्वास्थ्य प्रभावित हो सकता है। यदि नमूना संकेत बहुत मंद नहीं है, तो कम लेजर तीव्रता से शुरू करें।
    2. पहचान के लिए पीएमटी/एचवाईडी चालू करें, और वाईएफपी फ्लोरोफोरे के स्पेक्ट्रम के आधार पर ऊपरी और निचले उत्सर्जन बैंड थ्रेसहोल्ड को परिभाषित करें। वाईएफपी सिग्नल एकत्र करने के लिए 530-570 एनएम की एक डिटेक्शन विंडो सेट करें।
    3. दूसरे रंग के लिए अनुक्रमिक इमेजिंग: सेक बटन पर क्लिक करें, और एक नया चैनल जोड़ें। डिफ़ॉल्ट रूप से, पहले डिज़ाइन किया गया YFP बीम पथ Seq 1 होगा। सेक 2 में, आरएफपी उत्तेजना के लिए 561 एनएम लेजर का चयन करें, और आरएफपी सिग्नल एकत्र करने के लिए 570-630 एनएम की डिटेक्शन विंडो सेट करें।
  2. स्कैन शर्तें सेटअप (चित्रा 2)
    1. स्टोमेटा अग्रदूत कोशिकाओं के भीतर उपकोशिकीय झिल्ली यातायात गतिविधि की छवि बनाने के लिए, इमेजिंग के लिए सिस्टम पर 63x/1.2 W Corr लेंस चुनें।
    2. प्रारूप पिक्सेल में छवि आकार को संदर्भित करता है। 1,024 पिक्सेल x 1,024 पिक्सेल से प्रारंभ करें, और फिर प्रकाशन गुणवत्ता के अच्छे रिज़ॉल्यूशन के लिए ज़ूम कारक और उद्देश्य सेटिंग्स के आधार पर इसे ऑप्टिमाइज़ करें।
    3. गति स्कैनहेड की गति को संदर्भित करती है क्योंकि लेजर प्रत्येक पिक्सेल के ऊपर से गुजरता है। यद्यपि धीमी स्कैन गति के परिणामस्वरूप अक्सर बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, लेकिन वे तेजी से बदलती झिल्ली तस्करी की घटनाओं को कुशलता पूर्वक पकड़ नहीं सकते हैं। 400 हर्ट्ज की गति से शुरू करें, और नमूने की विशिष्ट स्थिति के आधार पर इसे अनुकूलित करें।
    4. ज़ूम फैक्टर का उपयोग उद्देश्य लेंस को बदले बिना रुचि के क्षेत्र पर ज़ूम इन करने के लिए किया जाता है। 1 के ज़ूम फैक्टर से शुरू करें, और प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर इसे अनुकूलित करें।
    5. लाइन औसत एक औसत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक एक्स-लाइन को स्कैन किए जाने की संख्या को संदर्भित करता है। एक बड़ी लाइन औसत परिणामी छवि में शोर को कम करता है, लेकिन यह लेजर प्रकाश के स्कैनिंग समय और एक्सपोजर समय को भी बढ़ाता है। झिल्ली तस्करी की घटनाओं की छवि बनाने के लिए, उच्च लाइन औसत का उपयोग न करें। 2x लाइन औसत से शुरू करें, और आवश्यकतानुसार अनुकूलित करें।
  3. एक समय श्रृंखला एकत्र करना
    नोट: झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करते समय, उपकोशिकीय एंडोसोम के तेजी से आंदोलन को रिकॉर्ड करने के लिए अक्सर एक समय श्रृंखला की आवश्यकता होती है।
    1. अधिग्रहण मोड में, समय श्रृंखला सुविधा सक्षम करने के लिए xyt स्कैन मोड का चयन करें।
    2. समय अंतराल के तहत समय बिंदुओं के बीच प्रतीक्षा अवधि तय करें। वैकल्पिक रूप से, छवियों को एक के बाद एक तुरंत लेने के लिए मिनिमाइज पर क्लिक करें। निम्नलिखित समय श्रृंखला प्रयोग में 7 s समय अंतराल का उपयोग किया गया था।
    3. अवधि का चयन करें, और प्रयोग चलाने के लिए कुल समय दर्ज करें। वैकल्पिक रूप से, फ़्रेम्स (चित्रा 3) का चयन करके एकत्र किए जाने वाले फ़्रेम की संख्या को परिभाषित करें।
  4. पूरे सेल के भीतर झिल्ली तस्करी की घटना के बारे में त्रि-आयामी जानकारी एकत्र करने के लिए, जेड-स्टैक स्कैन मोड का उपयोग करें। जेड-स्टैक छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण अक्सर विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है।
    1. अधिग्रहण मोड में xyz स्कैन मोड का चयन करें, और उसके बाद Z-स्टैक सुविधा पहुँच योग्य हो जाएगा।
    2. Z-वाइड विकल्प का चयन करें। स्कैन मोड के तहत, स्टार्ट और एंड बटन का उपयोग करके जेड-स्टैक की शीर्ष छवि और नीचे की छवि को परिभाषित करें।
    3. z-step आकार पर क्लिक करके z-step की मोटाई परिभाषित करें। वैकल्पिक रूप से, परिभाषित करें कि जेड-स्टैक की पूरी श्रृंखला को कवर करने के लिए कितनी छवियां लेनी हैं। नमूनों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, z-step आकार (चित्रा 4) को परिभाषित करें।
  5. छवि संसाधन
    1. जेड-स्टैक छवियों का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर (http://www.leica-microsystems.com) द्वारा उत्पन्न होता है। प्राथमिक प्रक्रिया टैब में, पहले दूर-बाईं ओर ओपन प्रोजेक्ट्स टैब के तहत रुचि रखने वाली जेड-स्टैक फ़ाइल चुनें। फिर, प्रोसेस टूल्स नामक मध्य टैब पर स्विच करें, प्रोजेक्शन फ़ंक्शन का चयन करें, विधि के ड्रॉपडाउन पैनल में अधिकतम चुनें, और लागू करें बटन पर क्लिक करें। ओपन प्रोजेक्ट्स टैब के तहत एक जेड-स्टैक प्रोजेक्शन छवि उत्पन्न की जाएगी।
    2. समय श्रृंखला छवियों का वीडियो फिजी (https://imagej.net/Fiji) द्वारा उत्पन्न किया गया है। फ़ाइल टैब में, सभी समय श्रृंखला छवियों को सही क्रम में खोलने के लिए ओपन फ़ंक्शन का उपयोग करें। छवि टैब में, स्टैक फ़ंक्शन ढूंढें, और वीडियो उत्पन्न करने के लिए स्टैक करने के लिए छवियां चुनें। वांछित फ्रेम दर ( वीडियो 1 के लिए 5 फ्रेम / एस) के साथ फ़ाइल को .avi प्रारूप में सहेजें।

Figure 2
चित्र 2: XY आयाम का स्कैन मोड पैनल। स्कैन मोड पैनल का उपयोग छवि स्कैन स्थितियों को सेट करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: xyt स्कैन मोड के अंतर्गत समय श्रृंखला उपयोगिता। समय श्रृंखला उपयोगिता का उपयोग इमेजिंग स्थितियों को लगातार छवियों की एक श्रृंखला एकत्र करने के लिए सेट करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: xyz स्कैन मोड के तहत z-स्टैक उपयोगिता। जेड-स्टैक उपयोगिता का उपयोग जेड-अक्ष पर छवियों की एक श्रृंखला एकत्र करने के लिए इमेजिंग स्थितियों को स्थापित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

एक पिछले अध्ययन ने संकेत दिया कि ईआरएल 1 एक सक्रिय रिसेप्टर काइनेज है जो गतिशील झिल्ली तस्करीकी घटनाओं से गुजरता है। ईआरएल 1 प्लाज्मा झिल्ली पर एक ट्रांसमेम्ब्रेन एलआरआर-रिसेप्टर काइनेज है। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में नए संश्लेषित ईआरएल 1 को गोल्गी निकायों में संसाधित किया जाता है और आगे प्लाज्मा झिल्ली में ले जाया जाता है। प्लाज्मा झिल्ली पर ईआरएल 1 अणु अपने बाह्य एलआरआर डोमेन18 का उपयोग करके ईपीएफ लिगेंड को समझ सकते हैं। ईपीएफ 1 सहित निरोधात्मक ईपीएफ द्वारा सक्रियण पर, ईआरएल 1 को एंडोसोम में आंतरिक रूप दिया जाता है, मल्टी-वेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) में ले जाया जाता है, और फिर सिग्नल20 को समाप्त करने के लिए गिरावट के लिए रिक्तिका में ले जाया जाता है। इसके विपरीत, विरोधी ईपीएफएल 9 लिगैंड, जो स्टोमेटा गठन14 को बढ़ावा देता है, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में ईआरएल 1 को बरकरार रखता है। वैकल्पिक रूप से, प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत ईआरएल 1 एंडोसोम और प्लाज्मा झिल्ली20 के बीच रीसायकल कर सकता है।

यहां, ईआरएल 1 प्रमोटर वाले ट्रांसजेनिक पौधे: : ईआरएल 1-वाईएफपी को ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए 7 दिनों के लिए उगाया गया था। जब सिर्फ उभर रहा था, तो असली पत्ती को इमेजिंग के लिए विच्छेदित किया गया था, क्योंकि ईआरएल 1 केवल युवा पत्तियों20 में स्टोमेटा वंश कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। जैसा कि अपेक्षित था, बिखरी हुई कोशिकाओं को वाईएफपी सिग्नल द्वारा हाइलाइट किया गया था, जहां ईआरएल 1-वाईएफपी ने प्लाज्मा झिल्ली को लेबल किया था (चित्रा 5)। इसके अलावा, कई पुंटेट सिग्नल भी देखे गए, यह सुझाव देते हुए कि ईआरएल 1 को एंडोसोम के लिए भी स्थानीयकृत किया गया था।

पौधों की कोशिकाओं में कई ऑर्गेनेल एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखे जाने पर पुंकेट फ्लोरोसेंट सिग्नल के रूप में मौजूद होते हैं, जैसे कि ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क और एमवीबी। जब आरएफपी-आरा 7 वाले एमवीबी मार्कर लाइन को आनुवंशिक रूप से ईआरएल 1-वाईएफपी ट्रांसजेनिक लाइन के साथ पार किया गया था, तो दोनों मार्कर प्रोटीन को ऊपर वर्णित अनुक्रमिक इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके देखा गया था। जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है, आरएफपी-आरा 7 ने लगभग सभी कोशिकाओं में कई पंक्टेट संकेतों पर प्रकाश डाला, जो इन कोशिकाओं में एमवीबी को दर्शाता है (चित्रा 6 बी)। ईआरएल 1-वाईएफपी सिग्नल के साथ विलय करते समय, अधिकांश ईआरएल 1-वाईएफपी-पॉजिटिव पंक्टेट आरएफपी-आरा 7-लेबल वाले पंक्टेट के साथ अतिव्यापी हो गए। इस परिणाम से पता चलता है कि कुछ ईआरएल 1-वाईएफपी अणुओं को एमवीबी में ले जाया जाता है।

इन तेजी से बढ़ते एंडोसोम की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए, ईआरएल 1-वाईएफपी और आरएफपी-आरा 7 वाले 7 दिन पुराने सच्चे पत्तों की समय श्रृंखला छवियां एकत्र की गईं (चित्रा 7)। 7 सेकंड के समय अंतराल को 203 सेकंड के लिए लागू किया गया था, और एकत्र किए गए 30 छवियों का उपयोग छवि जे (वीडियो 1) में एक वीडियो उत्पन्न करने के लिए किया गया था। वीडियो से पता चला कि ईआरएल 1-वाईएफपी-लेबल एंडोसोम स्टोमेटा वंश कोशिकाओं के भीतर आरएफपी-आरा 7 के साथ एक साथ चले गए, इस प्रकार पुष्टि की गई कि ईआरएल 1-वाईएफपी एमवीबी के लिए स्थानीयकृत था।

एक औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग करके ईआरएल 1 तस्करी मार्गों की जांच करने के लिए, दो आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली झिल्ली तस्करी दवाओं, ब्रेफेल्डिन ए (बीएफए) और वोर्टमैनिन (डब्ल्यूएम) के प्रभाव का विश्लेषण किया गया था। बीएफए, जीएनओएम सहित एडीपी-राइबोसिलेशन कारक गुआनिन-न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारकों को बाधित करके, एंडोसोमल रीसाइक्लिंग औरझिल्ली प्रोटीन के एंडोसाइटोसिस को अवरुद्ध कर सकता है। बीएफए समाधान के संपर्क में आने के 30 मिनट के बाद, ईआरएल 1-वाईएफपी को कुछ बड़े डिब्बों में पाया गया था जिन्हें बीएफए निकायों (चित्रा 8 बी, सी) के रूप में जाना जाता है। यह इंगित करता है कि ईआरएल 1 तस्करी को बीएफए द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि ईआरएल 1 रीसाइक्लिंग या एंडोसाइटोसिस से गुजरता है। डब्ल्यूएम फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल -3 और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल -4 किनेसेस को रोक सकता है और इस प्रकार, एमवीबी5 के संलयन का कारण बनता है। जब 30 मिनट के लिए डब्ल्यूएम के साथ इलाज किया जाता है, तो ईआरएल 1-वाईएफपी द्वारा हाइलाइट की गई कुछ अंगूठी जैसी संरचनाएं देखी गईं, जिन्हें आमतौर पर डब्ल्यूएम बॉडी (चित्रा 8 सी) कहा जाता है। यह परिणाम इंगित करता है कि ईआरएल 1-वाईएफपी को एमवीबी में ले जाया जाता है, इस प्रकार यह सुझाव दिया जाता है कि ईआरएल 1 गिरावट के लिए रिक्तिका के मार्ग का अनुसरण करता है।

Figure 5
चित्र 5: ERL1-YFP की एकल विमान छवि। (A) प्रतिदीप्ति छवि, (B) उज्ज्वल-क्षेत्र छवि, और (C) विलय की गई छवि से पता चलता है कि ERL1-YFP प्लाज्मा झिल्ली को लेबल करता है और स्टोमेटा वंश कोशिकाओं के भीतर कुछ अत्यधिक गतिशील पंक्टेट करता है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: ERL1-YFP और RFP-Ara7 की अनुक्रमिक छवियां। (A) ERL1-YFP और (B) RFP-Ara7 दोनों सेल के भीतर संकेतों को लेबल करते हैं। (सी) विलय की गई छवि और (डी) इनसेट छवि में सफेद पंक्टेट इंगित करता है कि दो प्रोटीन स्टोमेटा वंश कोशिकाओं के भीतर एमवीबी पर सह-स्थानीयकृत हैं। सफेद तीर ईआरएल 1-वाईएफपी और आरएफपी-आरा 7 दोनों द्वारा लेबल किए गए एंडोसोम का संकेत देते हैं। लाल तीर आरएफपी-आरा 7 द्वारा लेबल किए गए एंडोसोम का संकेत देते हैं। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: ईआरएल 1-वाईएफपी और आरएफपी-आरा 7 की समय श्रृंखला छवियां। छवियों को 7 सेकंड के समय अंतराल के साथ लिया गया था। प्रत्येक छवि का समय बिंदु शीर्ष-बाएँ कोने में इंगित किया गया है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: ईआरएल 1-वाईएफपी की जेड-स्टैक छवियां (ए, बी) ईआरएल 1-वाईएफपी पौधों की जेड-स्टैक छवियां (ए) मॉक या (बी) बीएफए के साथ इलाज की जाती हैं। ऊपरी-दाएं कोने में संख्याएं जेड-स्टैक में ऊपर से नीचे तक छवि की स्थिति को इंगित करती हैं। स्केल बार: 10 μm. (C) ईआरएल 1-वाईएफपी की जेड-स्टैक छवियों का प्रक्षेपण मॉक या बीएफए समाधान और मॉक या डब्ल्यूएम समाधान के साथ इलाज किया जाता है, जैसा कि ऊपरी-दाएं कोने में दर्शाया गया है। तीर दवाओं के कारण ईआरएल 1-वाईएफपी के एकत्रीकरण निकायों को इंगित करते हैं। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: ईआरएल 1-वाईएफपी और आरएफपी-आरा 7 की समय श्रृंखला छवियों का वीडियो। ERL1-YFP और RFP-Ara7 की समय श्रृंखला छवियों को 5 फ्रेम / सेकंड की गति से फिजी का उपयोग करके एक वीडियो में ढेर किया जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

एंडोमेम्ब्रेन सिस्टम एक यूकेरियोटिक कोशिका के साइटोप्लाज्म को विभिन्न डिब्बों में अलग करता है, जो इन ऑर्गेनेल के विशेष जैविक कार्य को सक्षम बनाता है। कार्गो प्रोटीन और मैक्रोमोलेक्यूल्स को सही समय पर अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचाने के लिए, कई पुटिकाओं को इन ऑर्गेनेल के बीच शटल करने के लिए निर्देशित किया जाता है। अत्यधिक विनियमित झिल्ली तस्करी की घटनाएं कोशिकाओं की व्यवहार्यता, विकास और विकास में मौलिक भूमिका निभाती हैं। इस महत्वपूर्ण और जटिल प्रक्रिया को विनियमित करने वाला तंत्र अभी भी खराब समझा जाता है।

झिल्ली प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का अवलोकन करने, विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किए गए दो झिल्ली प्रोटीनों के बीच सह-स्थानीयकरण का विश्लेषण करने, समय-श्रृंखला छवियों का उपयोग करके झिल्ली प्रोटीन के गतिशील आंदोलन की निगरानी करने और पूरे सेल को कवर करने वाले जेड-स्टैक इमेजिंग करके झिल्ली प्रोटीन के बारे में 3 डी जानकारी एकत्र करने के लिए कई दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित झिल्ली तस्करी की घटनाओं के अलावा, इन दृष्टिकोणों को आसानी से अन्य जैविक प्रक्रियाओं पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विकास प्रक्रिया की निगरानी के लिए समय-श्रृंखला इमेजिंग को दीर्घकालिक अवधि (कई दिनों) में आयोजित किया जा सकताहै। जेड-स्टैक इमेजिंग को सेल30 के भीतर प्रोटीन की प्रचुरता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ये इमेजिंग दृष्टिकोण औषधीय अनुप्रयोगों के साथ पूरी तरह से गठबंधन कर सकते हैं, जिसमें विभिन्न दवाएं, हार्मोन और यहां तक कि पर्यावरणीय संकेत भी शामिल हैं, यह दर्शाता है कि ये इमेजिंग दृष्टिकोण जीवित जैविक नमूनों पर आसानी से लागू होते हैं। नमूना उपचार में लचीलेपन के अलावा, यहां वर्णित विधियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप को छोड़कर केवल आर्थिक रूप से सस्ती उपकरणों की आवश्यकता होती है, और तकनीकी कौशल में कर्मियों के केवल हल्के प्रशिक्षण, इस प्रकार इन तरीकों को व्यापक रूप से अपनाया जा सकता है।

प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण चरणों में सावधानी की आवश्यकता है। सबसे पहले, झिल्ली तस्करी दवाओं की इष्टतम सांद्रता सामग्री और उपचार के आधार पर भिन्न होती है। एक पिछले अध्ययन से पता चलता है कि 30 μM BFA एक कम सांद्रता है जो मेरिस्टेमोइड्स20 में गोल्गी तंत्र के पतन के बिना विशिष्ट बीएफए शरीर के गठन को ट्रिगर कर सकता है। इसी तरह, 25 μM Wm एक कम लेकिन प्रभावी एकाग्रता है जो मेरिस्टेमोइड्स को गंभीर रूप से नुकसान पहुंचाए बिना WM शरीर के गठन को प्रदान कर सकता है। जब एक नई सामग्री (विभिन्न पौधों की प्रजातियां, पौधे के विभिन्न हिस्से, आदि) का इलाज किया जाता है, तो दवाओं की सांद्रता को तदनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। दूसरा, उपचार के दौरान नमूनों की शारीरिक स्थिति को अधिकतम सीमा तक बनाए रखने के लिए, इमेजिंग चरण तक रोपाई को आंशिक रूप से बरकरार रखा जाता है (केवल कोटिलेडॉन को हटाना)। स्लाइड तैयारी के लिए सच्ची पत्तियों को विच्छेदित किया जाता है, और नमूना बाद में चित्रित किया जाता है। प्रत्येक नमूने को व्यक्तिगत रूप से इलाज करने की आवश्यकता होती है, और स्लाइड को इमेजिंग के लिए ताजा बनाने की आवश्यकता होती है। अंत में, जेड-स्टैक इमेजिंग और टाइम-सीरीज़ इमेजिंग दोनों को नमूने की बार-बार लेजर स्कैनिंग की आवश्यकता होती है। नमूनों पर फोटोब्लीचिंग और फोटोटॉक्सिसिटी के जोखिम को कम करने के लिए, कम लेजर शक्ति की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

झिल्ली तस्करी की घटनाओं की उच्च दक्षता सेल1 की विशिष्ट विकास और पर्यावरणीय स्थितियों के जवाब में तस्करी मार्गों और उनके कैनेटीक्स की विविधता द्वारा सुनिश्चित की जाती है। वर्णित विधियों में सीमित स्थानिक रिज़ॉल्यूशन है, इसलिए यूकेरियोटिक सेल के भीतर झिल्ली यातायात का विस्तृत ज्ञान प्राप्त करने के लिए अधिक परिष्कृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक ें उभर रही हैं। उदाहरण के लिए, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म) और फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम) सहित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, फ्लोरेसेंस-टैग किए गए प्रोटीन31,32 के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को बहुत बढ़ाती है, हालांकि केवल निश्चित नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है; स्पिनिंग-डिस्क माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग गति को काफी तेज करती हैऔर नमूनों के फोटोब्लीचिंग को कम करती है, हालांकि इस विधि का उपयोग करके कम प्रचुरता वाले प्रोटीन की गतिशीलता को रिकॉर्ड करना चुनौतीपूर्ण है; लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी तेज और कोमल 3 डी इमेजिंग34,35 प्रदान करता है; और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी गहरे ऊतकों35,36 से प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने में सक्षम बनाता है, हालांकि थोड़ा कम रिज़ॉल्यूशन आदि की लागत पर। इसके अलावा, रासायनिक जीव विज्ञान ने कुछ तस्करी मार्गों के साथ हस्तक्षेप करने वाली अधिक विशिष्ट दवाओं की पहचान की है। सीमाओं के बावजूद, अन्य उभरती हुई उन्नत तकनीकों के साथ ये तकनीकें हमारे ज्ञान में काफी सुधार करेंगी और कोशिका झिल्ली तस्करी प्रणाली के तंत्र पर प्रकाश डालेंगी।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (आईओएस -2217757) (एक्सक्यू) और यूनिवर्सिटी ऑफ अर्कांसस फॉर मेडिकल साइंसेज (यूएएमएस) ब्रोंसन फाउंडेशन अवार्ड (एचजेड) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL syringes VWR BD309695 Vacuum samples
Brefeldin A (BFA) Sigma B7651 membrane trafficking drug
Confocal Microscope Leica Lecia SP8 TCS with LAS-X software package Imaging
Dissecting Forceps VWR 82027-402 Genetic cross
Fiji NIH https://imagej.net/Fiji Image processing
Leica LAS AF software Leica http://www.leica-microsystems.com Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7 Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm) Sigma W1628 membrane trafficking drug

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References

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जीव विज्ञान अंक 195
स्टोमेटा वंश कोशिकाओं में झिल्ली तस्करी की घटनाओं का अध्ययन करने के लिए छवि-आधारित तरीके
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He, Q., Zhang, H., Qi, X.… More

He, Q., Zhang, H., Qi, X. Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells. J. Vis. Exp. (195), e65257, doi:10.3791/65257 (2023).

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