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Summary
本文描述了一种适用于测定动物源性药物中三甲胺（TMA）的顶空气相色谱-串联四极杆质谱（HS-GC-MS/MS）方法。该方案包括样品预处理、顶空处理、分析条件、方法验证以及动物源性药物中TMA的测定。
Abstract
动物源性药物具有鲜明的特点和显著的疗效，但大多有明显的鱼腥味，导致临床患者的依从性较差。三甲胺（TMA）是动物源性药物中关键的鱼腥味成分之一。由于加入碱液后快速的酸碱反应导致顶空小瓶压力增加，导致TMA从顶空小瓶中逸出，阻碍了动物源性药物鱼腥味的研究进展，因此使用现有的检测方法很难准确识别TMA。在这项研究中，我们提出了一种受控检测方法，该方法引入了石蜡层作为酸和碱液之间的隔离层。通过恒温炉加热使石蜡层缓慢液化，可以有效控制TMA的产量。该方法表现出令人满意的线性、精密的实验和回收率，重现性好，灵敏度高。为动物源性药物除臭提供技术支持。
Introduction
利用动物器官和/或其副产品衍生的产品（此处称为动物源性药物）来治疗人类疾病正受到越来越多的关注。在治疗癌症、心血管疾病、肝硬化、乳腺炎等疾病中发挥重要作用，具有疗效强、用量小、临床疗效显著、特异性强等优点。但动物源性药物一般有明显的鱼腥味，影响患者依从性很大，对儿童尤其不利1,2。腥味主要来源于药物中所含的蛋白质、氨基酸、脂肪等物质，经脂肪酸氧化、氨基酸降解等方式分解，产生多种具有鱼腥味的物质2、3、4。其中，三甲胺（TMA）是一种具有鱼腥味的挥发性气体，广泛存在于腐烂或腐烂的动物源性食品中5。
到目前为止，气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、离子色谱、分光光度法、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）和传感器法已被普遍用于检测环境、食物和尿液中的TMA6,7,8,9。鉴于气相色谱柱和进样系统的低污染，以及高灵敏度、重现性和低检测限（0.1-1 mg/kg），顶空气相色谱-质谱（HS-GC-MS）法是食品和生物分析的首选方法8。目前，只有中国建立了食品中TMA的国家标准，HS-GC-MS是GB5009.179-2016标准10中的第一种方法。因此，选择上述HS-GC-MS方法检测动物源性药物中的TMA。在早期阶段，我们的研究小组发现食品中TMA的HS-GC-MS检测标准可以检测几种动物源性药物中的鱼腥味。结合研究结果11,12，可以证明TMA是动物源性药物中鱼腥味的常见关键物质。但发现实验结果重现性差，存在TMA逃逸、稳定性差等问题，无法通过该方法验证。这可能是由于碱液被注入顶空小瓶中，快速的酸碱反应导致小瓶中的压力增加，因此TMA从注射孔中逸出，从而阻止了TMA的稳定和准确检测。因此，本研究提出了一种改进的顶空气相色谱-串联四极杆质谱（HS-GC-MS/MS）检测方法来解决这一问题。
该方案通过在固体石蜡（一种良好的固液相变材料）的帮助下分离预处理中的酸碱反应物来改进样品预处理。随着石蜡随着恒温炉温度的升高而缓慢液化，TMA也在密封的顶空小瓶中缓慢释放，避免了剧烈而快速的酸碱反应引起的压力增加，保证了TMA检测的稳定准确。此外，GC-MS/MS中的顶空进样结合多种反应监测（MRM）模式有效地抑制了基质化学干扰，保证了结果的可靠性。方法验证结果表明，改进检测方法的线性、精密度和回收率均能满足要求，重现性好，灵敏度高。
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Protocol
有关Pheretima，Periplaneta americana和Hirudo的药材的信息，请参见表1。成都中医药大学徐润春教授将他们鉴定为Pheretima aspergillum（E.Perrier），Periplaneta americana L.和Whitmania pigra Whitman的干燥尸体。
1. 标本提取
- 用草药研磨机（见材料表）粉碎Pheretima，Periplaneta americana和Hirudo，通过2号（筛孔径：0.8毫米）和4号（筛孔径：0.25毫米）标准药物筛筛选药粉，并在两个筛子之间收集粉末以获得所需的样品粉末。
注意： Pheretima 在粉碎后蓬松，因此其粉末不需要过筛。 - 在50 mL塑料离心管中取1 g粉末（精确到0.001 g），加入20 mL 5%三氯乙酸（TCA）溶液（见 材料表），并用高速分散均质器在1,000 rmin-1 下匀浆1分钟。
- 匀浆后，在室温下以1,717× g 离心5分钟，在玻璃漏斗中加入少许吸收棉，并将上清液过滤到50mL容量瓶中。
- 用 15 mL 和 10 mL 的 5% TCA 溶液重复上述提取过程两次。合并滤液，用5%TCA溶液稀释至50mL。
2. 试剂制备
- 准备20%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用去离子水将体积固定在100 mL容量瓶中。
- 准备 5% TCA 溶液：称取 25 g TCA，并使用去离子水将体积固定在 500 mL 容量瓶中。
3. TMA标准储备液制备
- 制备TMA标准储备溶液：称取0.0162g盐酸盐TMA标准样品，溶于5%TCA溶液中，将体积固定至100 mL，等于100 μg/mLTMA标准储备液的浓度。将其储存在4°C。
- 制备TMA标准用液：取一定体积的TMA标准储备液，用5%TCA溶液逐步稀释至浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的TMA标准溶液。
4. 样品顶空处理
- 在 20 mL 顶空小瓶中准确称取 2 mL 氢氧化钠溶液和 0.5 g 固体石蜡（熔点：58-60 °C）（参见 材料表）。
- 将顶空小瓶置于70°C的烤箱中约30分钟。固体石蜡完全熔化。
- 将其取出，让它冷却至室温，使石蜡凝固。固化的石蜡将密封氢氧化钠。
- 取 2 mL 每种样品提取溶液，将其放在石蜡层顶部，按下盖子并密封。
- 将密封的顶空小瓶放在机器上（参见 材料表）进行测量。
5. HS-GC-MS/MS 分析条件的设置
- 有关顶空条件和GC-MS条件，请参见 表2 。
- 有关离子信息，请参见 表3 。
6. 标准曲线图
- 参照步骤4.1-4.3中的顶空处理样品，制备含有碱液和石蜡密封层的顶空小瓶。
- 将 2 mL 的 0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL 和 10 μg/mL TMA 标准溶液吸入 20 mL 顶空小瓶中，密封盖子，并在机器上测量。
7. 精密度测试
- 参照步骤4.1-4.3中的顶空处理样品，制备含有碱液和石蜡密封层的顶空小瓶。
- 将 2 mL 的 0.1 μg/mL TMA 标准溶液吸入 20 mL 顶空小瓶中并密封盖子。按照制造商的说明在机器中进行六次平行测试（请参阅 材料表）。
8. 回收率实验
- 取一批 Pheretima，Periplaneta Americana 和 Hirudo （S02，S05，S07; 表 1）作为回收率实验的代表药物。
- 取几批样品粉末（S02，S05，S07），并在50°C的烤箱中烘烤72小时，直到没有检测到TMA。
- 参考第4-6节中的样品制备方法，以检测烘焙药粉中TMA的含量。
- 取1 g焙烧粉（精确至0.001 g），放入50 mL塑料离心管中，加入50 μLTMA标准溶液。
注意：TMA标准溶液的浓度为100μg/mL，1000μg/ mL和10000μg/ mL。 - 加入 20 mL 的 5% TCA 溶液，并在 1000 rmin-1 下匀浆 1 分钟。
- 均质化后，以1717× g 离心5分钟，在玻璃漏斗中加入少许吸收棉，并将上清液过滤到50mL容量瓶中。
- 用 15 mL 和 10 mL 的 5% TCA 溶液重复上述提取过程两次;合并滤液，用5%TCA溶液稀释至50mL。
9. 检测限 （LOD） 和定量限 （LOQ） 的测定
- 当信噪比 （S/N） = 3 时，通过相应的浓度确定 LOD。
- 当信噪比=10时，通过相应的浓度确定LOQ。
10. 样品TMA含量的测定
- 分别取Pheretima，Periplaneta americana和Hirudo的细粉约1g，按上述方法提取样品，并在机器上测定。
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Representative Results
该协议的预处理原理和操作原理图分别如图 1 和 图2所示。TMA的峰时间为2.3 min，峰形尖锐，不受其他杂质干扰（图3）。测定0.1-10 μg/mL TMA标准溶液的线性范围，以TMA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归方程为y = 2522482x + 24255，相关系数（R2）= 0.9998，表现出良好的线性关系。LOD和LOQ的计算分别信噪比= 3和信噪比= 10。LOD为0.03毫克/千克，LOQ为0.11毫克/千克。为研究该方法的精密度，6次平行测定TMA（0.1 μg/mL）含量，相对标准偏差（RSD）为5.84%，证明了该方法的良好精密度。选取一组来自 Pheretima、 Periplaneta americana和 Hirudo 的样品作为回收实验的代表样品（分别为S02、S05、S07）;干燥还原中药材TMA进行加标回收率试验，平均回收率分别为84.49%、94.66%和85.67%，准确度满足分析要求（表4）。在 Pheretima，Periplaneta Americana 和 Hirudo的9个批次中检测到TMA，浓度范围为13.23-271.63 mg/kg（表5）。该方案方法具有良好的方法验证结果，并且还检测了动物源性药物中具有明显鱼腥味的TMA含量。
图1：碱液-石蜡萃取液反应原理示意图 。 （1） 准确称取 2 mL 顶空小瓶中的 2 mL 氢氧化钠溶液。（2）向顶空小瓶中加入0.5g固体石蜡。（3）加热使固体石蜡熔化，固体石蜡与氢氧化钠溶液分层，漂浮在氢氧化钠溶液上方。（4）冷却后，石蜡凝固并牢固地密封在氢氧化钠溶液上。（5）取2 mL样品提取液，放在石蜡层上，压盖，密封。（6）将密封的顶空小瓶放在机器上进行测量。恒温炉的加热使石蜡层熔化，石蜡层上下的酸碱反应物在密封环境中反应生成TMA。样品的顶空处理大致在第1至6节中进行。 请点击此处查看此图的大图。
图2：样品预处理操作示意图 。 （A）密封碱液：协议中的步骤4.1-4.3。（B）样品提取：协议中的第1节和第4.4步。（C）TMA检测：协议中的步骤4.5和第5节。 请点击此处查看此图的大图。
图3：TMA的总离子色谱图。1 μg/mL TMA 标准溶液的频谱图。请点击此处查看此图的大图。
| 批 | 起源 | |
| 佩列蒂玛 | S01 | 四川省乐山市 |
| 佩列蒂玛 | S02 | 广东省滇白市 |
| 佩列蒂玛 | S03 | 广东省茂名市 |
| 美洲周行星 | S04 | 四川省凉山彝族自治州西昌市 |
| 美洲周行星 | S05 | 云南省大理州米都县 |
| 美洲周行星 | S06 | 安徽省亳州市 |
| 水蛭 | S07 | 山东省济宁市微山县 |
| 水蛭 | S08 | 江苏省昆山市 |
| 水蛭 | S09 | 山东省济南市莱芜区 |
表1：动物源性药物信息。
| 顶空条件 | |
| 恒温炉温度 | 80 °C |
| 样品 b 恒温时间 | 30 分 |
| 顶空针温 | 100 °C |
| 样本量 | 1毫升 |
| 气相色谱-质谱条件 | |
| 色谱柱 | SH-挥发胺，30米×0.32毫米×5微米 |
| 柱温程序 | 40 °C （0.5 分钟） _20 °C /分钟 _200 °C （5 分钟） |
| 喷油器温度 | 200 °C |
| 载气控制模式 | 恒定线速度 |
| 注射模式 | 分体注射 |
| 分流比 | 10:01 |
| 列流量 | 2毫升/分钟 |
| 样本量 | 1毫升 |
| 电离模式 | 就业保险 |
| 离子源温度 | 200 °C |
| GC-MS 界面温度 | 230 °C |
| 检测器电压 | 调谐电压 +0.6 kV |
| 采集模式信息 | 磁共振成像 |
表 2：顶空条件和 GC-MS/MS 条件。
| 化合物名称 | 中国科学院 | 保留时间（分钟） | 定量离子（米/z） | 行政长官 | 参考离子 （米/z） | 行政长官 |
| 三甲胺 | 75-50-3 | 2.308 | 58>42 | 20 | 58>30 | 7 |
表 3：TMA 化合物信息。
| 样本 | 样品浓度（毫克/千克） | 加标浓度（毫克/千克） | 测量浓度（毫克/千克） | 平均回收率（%） | 固定期限 （%） |
| S02 | 128.99 | 500.00 | 548.50 | 84.49 | 2.12% |
| S05 | 49.08 | 500.00 | 520.93 | 94.66 | 0.96% |
| S07 | 101.36 | 500.00 | 527.07 | 85.67 | 1.87% |
表4：动物源性药物中TMA的回收率实验结果。
| 样本 | 样品浓度（毫克/千克） |
| S01 | 88.11 |
| S02 | 137.34 |
| S03 | 18.63 |
| S04 | 19.10 |
| S05 | 40.50 |
| S06 | 13.23 |
| S07 | 271.63 |
| S08 | 69.73 |
| S09 | 67.70 |
表5：动物源性药物中TMA浓度的测定结果。
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Discussion
动物源性药物来自动物的全身、器官或组织、生理或病理产物、排泄物或分泌物以及加工产品。TMA是动物源性药物中鱼腥味的重要来源;它是一种典型的恶臭物质，嗅觉阈值非常低（0.000032 × 10-6 V/V）和强烈的鱼腥味13。目前，常用的HS-GC-MS方法无法稳定、准确地检测动物源性药物中的TMA。
该方案在几个方面进行了改进：（1）TMA更具极性和碱性。该方案选择挥发胺气相色谱专用柱检测TMA，保证了TMA检测的准确性和灵敏度。（2）在GB5009.179-2016中HC-GC-MS法的样品制备过程中，将高浓度氢氧化钠溶液注入密封的顶空小瓶10中。此时，酸碱反应的发生导致顶空小瓶中的压力增加，这可能导致TMA逸出，导致TMA检测不准确。本规程提及中药二氧化硫残留的检测方法14.在样品预处理中，固体石蜡用作分离酸碱反应物的培养基。顶空小瓶密封后，石蜡在恒温炉的加热下缓慢熔化，避免了剧烈的酸碱反应，为TMA反应提供了良好的密闭环境，保证了TMA检测的稳定性和准确性。（3）该方案采用GC-MS/MS中的MRM模式进行采集，并对检测参数（柱温程序等）进行优化，确保分析效率和准确性。
在本协议的操作中必须注意以下几点：（1）必须选择适量的固体石蜡。较小的石蜡剂量将导致石蜡层未密封和酸碱反应物的立即反应，导致在密封前产生和逸出TMA。较高的石蜡剂量可能会阻碍TMA的释放、富集和检测。（2）压盖必须紧密，密封完好。此外，该协议还存在一些限制。动物源性药物中的TMA是内源性的，不能通过干燥干净去除;回收实验采用低浓度TMA盐酸盐标准溶液，但效果不理想。因此，在本协议中仅选择相同浓度的TMA盐酸盐标准溶液进行回收实验。
总之，该方案提供了一种样品预处理方法和动物源性药物中TMA的准确检测。该方法的建立填补了动物源性药物中TMA检测方法的空白，为动物源性药物中鱼腥味物质的研究提供了技术支持，对促进动物源性药物的研究、开发和应用具有重要意义。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（82173991）和四川省科学技术计划（2022YFS0442）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
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Tags
化学，第193期，动物源性药物，三甲胺，鱼腥味，顶空气相色谱-串联四极杆质谱Erratum
Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd
to:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd
