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Summary
Aqui, um método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) adequado para a determinação de trimetilamina (TMA) em medicamentos derivados de animais é descrito. O protocolo inclui pré-tratamento da amostra, tratamento com headspace, condições de análise, validação metodológica e determinação de TMA em medicamentos derivados de animais.
Abstract
Os medicamentos de origem animal têm características distintas e efeitos curativos significativos, mas a maioria deles tem um odor de peixe óbvio, resultando na baixa adesão dos pacientes clínicos. A trimetilamina (TMA) é um dos principais componentes de odor de peixe na medicina de origem animal. É difícil identificar com precisão a TMA usando o método de detecção existente devido ao aumento da pressão no frasco para injetáveis de headspace causado pela rápida reação ácido-base após a adição de lixívia, o que faz com que a TMA escape do frasco para injetáveis de headspace, atrasando o progresso da pesquisa do odor de peixe da medicina derivada de animais. Neste estudo, propusemos um método de detecção controlada que introduziu uma camada de parafina como camada de isolamento entre o ácido e a soda cáustica. A taxa de produção de TMA pode ser efetivamente controlada pela liquefação lenta da camada de parafina através do aquecimento termostático do forno. Este método apresentou linearidade satisfatória, experimentos de precisão e recuperações com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade. Prestou apoio técnico para a desodorização de medicamentos derivados de animais.
Introduction
O tratamento de doenças humanas utilizando produtos derivados de partes animais e/ou seus subprodutos (aqui referidos como medicamentos derivados de animais) está recebendo atenção crescente. Eles desempenham um papel importante no tratamento de câncer, doenças cardiovasculares, cirrose hepática, mastite e outras doenças, com as vantagens de um forte efeito, pequena dosagem e eficácia clínica significativa e específica. No entanto, medicamentos de origem animal geralmente apresentam odor proeminente de peixe, o que afeta sobremaneira a adesão dos pacientes, sendo especialmente desfavoráveis para crianças 1,2. O odor de peixe provém principalmente das proteínas, aminoácidos, gorduras e outras substâncias contidas no medicamento, que são decompostas através da oxidação de ácidos graxos, degradação de aminoácidos e outras formas de produzir uma variedade de substâncias com odor de peixe 2,3,4. Dentre eles, a trimetilamina (TMA) é um gás volátil com odor de peixe que existe amplamente em alimentos de origem animal em decomposição ou apodrecidos5.
Até o momento, cromatografia gasosa (CG), cromatografia líquida (CL), cromatografia iônica, espectrofotometria, cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) e métodos sensores têm sido comumente utilizados para detectar TMA no ambiente, alimentos e urina 6,7,8,9. Tendo em vista a baixa contaminação da coluna GC e do sistema de injeção, bem como a alta sensibilidade, reprodutibilidade e baixo limite de detecção (0,1-1 mg/kg), o método de cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas (HS-GC-MS) foi preferido para análise biológica e de alimentos8. Atualmente, apenas a China estabeleceu um padrão nacional para TMA em alimentos, e HS-GC-MS é o primeiro método no padrão GB5009.179-201610. Portanto, o método HS-GC-MS acima foi selecionado para detectar TMA em medicina derivada de animais. No estágio inicial, nosso grupo de pesquisa descobriu que o padrão de detecção de HS-GC-MS para TMA em alimentos poderia detectar o odor de peixe em vários medicamentos derivados de animais. Combinado com os resultados dos estudos11,12, pôde-se provar que a MAT é a substância-chave comum do odor de peixe em medicamentos derivados de animais. No entanto, verificou-se que a reprodutibilidade dos resultados experimentais foi pobre, havendo problemas como escape de ATM e baixa estabilidade, o que não pôde ser verificado pela metodologia. Isso pode ser devido ao fato de que a lixívia foi injetada no frasco do headspace e a rápida reação ácido-base levou ao aumento da pressão no frasco, escapando assim da TMA do poro de injeção, impedindo a detecção estável e precisa da MAT. Portanto, este estudo propôs um método aprimorado de detecção por cromatografia gasosa em headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandem (HS-GC-MS/MS) para resolver esses problemas.
O protocolo melhora o pré-tratamento da amostra separando os reagentes ácido-base no pré-tratamento com a ajuda de parafina sólida, um bom material de mudança de fase sólido-líquido. Como a parafina se liquefez lentamente com o aumento da temperatura do forno termostático, a TMA também foi liberada lentamente no frasco do headspace selado, evitando o aumento de pressão causado pela violenta e rápida reação ácido-base e garantindo uma detecção estável e precisa da TMA. Além disso, a injeção de headspace combinada com os modos de monitoramento de reação múltipla (MRM) em GC-MS/MS efetivamente suprimiu a interferência química da matriz e garantiu a confiabilidade dos resultados. Os resultados da validação metodológica comprovaram que a linearidade, o teste de precisão e a taxa de recuperação do método de detecção aprimorado podem atender aos requisitos, com boa reprodutibilidade e alta sensibilidade.
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Protocol
Ver Tabela 1 para informações sobre os medicamentos de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo. Eles foram identificados pelo Prof. Xu Runchun, da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, como os corpos secos de Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. e Whitmania pigra Whitman.
1. Extração do espécime
- Esmague Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo com um moedor de ervas (ver Tabela de Materiais), peneire o pó medicinal através das peneiras padrão nº 2 (abertura da peneira: 0,8 mm) e nº 4 (abertura da peneira: 0,25 mm) e colete o pó entre as duas peneiras para obter o pó de amostra necessário.
OBS: A Pheretima é fofa após o esmagamento, portanto seu pó não precisa ser peneirado. - Tomar 1 g de pó (com precisão de 0,001 g) num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml, adicionar 20 ml de solução de ácido tricloroacético (TCA) a 5% (ver Tabela de Materiais) e homogeneizar a 1.000 rmin-1 durante 1 min com um homogeneizador de dispersão de alta velocidade.
- Após homogeneização, centrifugar a 1.717 x g por 5 min à temperatura ambiente, adicionar um pouco de algodão absorvente no funil de vidro e filtrar o sobrenadante em um balão volumétrico de 50 mL.
- Repetir o processo de extração acima duas vezes com 15 mL e 10 mL de solução de TCA a 5%. Combinar o filtrado e diluí-lo a 50 ml com solução de TCA a 5%.
2. Preparação dos reagentes
- Preparar solução de hidróxido de sódio a 20%: pesar 20 g de hidróxido de sódio e utilizar água deionizada para fixar o volume num balão volumétrico de 100 ml.
- Preparar solução de ATA a 5%: pesar 25 g de ATA e utilizar água deionizada para fixar o volume num balão volumétrico de 500 ml.
3. Preparação da solução-mãe padrão TMA
- Preparar solução-mãe padrão de TMA: pesar 0,0162 g de amostra-padrão de cloridrato de TMA, dissolvê-la em solução de TCA a 5% e fixar o volume em 100 mL, igual à concentração de 100 μg/mL de solução-mãe padrão de TMA. Conservar a 4 °C.
- Preparar a solução padrão de TMA: tomar um determinado volume de solução-mãe padrão de TMA e diluí-la passo a passo com solução padrão de TCA a 5% para concentrações de 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL de solução padrão de TMA.
4. Processamento do headspace da amostra
- Pesar com precisão 2 ml de solução de hidróxido de sódio e 0,5 g de parafina sólida (ponto de fusão: 58-60 °C) num frasco para injetáveis de 20 ml de headspace (ver Tabela de Materiais).
- Coloque o frasco para injetáveis headspace num forno a 70 °C durante cerca de 30 min. A parafina sólida derrete completamente.
- Retire-o e deixe esfriar até a temperatura ambiente para que a parafina se solidifique. A parafina solidificada selará o hidróxido de sódio.
- Pegue 2 mL de cada solução de extração de amostra e coloque-a sobre a camada de parafina, pressione a tampa e lacre.
- Coloque o frasco para injetáveis de headspace selado na máquina (ver Tabela de Materiais) para medição.
5. Definição das condições de análise de HS-GC-MS/MS
- Consulte a Tabela 2 para condições de headspace e condições de GC-MS.
- Consulte a Tabela 3 para obter informações sobre íons.
6. Desenho de curva padrão
- Consulte o processamento do headspace da amostra nas etapas 4.1-4.3 para preparar o frasco para injetáveis de headspace contendo lixívia e camada de vedação de parafina.
- Aspirar 2 mL de 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL de solução padrão de TMA em um frasco para injetáveis de 20 mL, selar a tampa e medir na máquina.
7. Teste de precisão
- Consulte o processamento do headspace da amostra nas etapas 4.1-4.3 para preparar o frasco para injetáveis de headspace contendo lixívia e a camada de vedação em parafina.
- Aspirar 2 ml de solução-padrão de 0,1 μg/ml de TMA para um frasco para injetáveis de 20 ml de headspace e selar a tampa. Realizar seis testes paralelos na máquina seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
8. Experimento de taxa de recuperação
- Tome um lote de Pheretima, Periplaneta Americana e Hirudo (S02, S05, S07; Tabela 1) como os medicamentos representativos para o experimento de taxa de recuperação.
- Tomar vários lotes de amostra de pó (S02, S05, S07) e assar-os num forno a 50 °C durante 72 h até não ser detectado TMA.
- Consulte o método de preparação da amostra nas secções 4-6 para detectar o teor de TMA no pó de medicamento cozido.
- Tome 1 g de fermento em pó (com precisão de 0,001 g), coloque-o num tubo de centrífuga de plástico de 50 ml e adicione 50 μL de solução padrão de TMA.
NOTA: A concentração da solução padrão de TMA é de 100 μg/mL, 1000 μg/mL e 10000 μg/mL. - Adicionar 20 mL de solução de ATA a 5% e homogeneizar a 1000 rmin-1 por 1 min.
- Após homogeneização, centrifugar a 1717 x g por 5 min, adicionar um pouco de algodão absorvente no funil de vidro e filtrar o sobrenadante em um balão volumétrico de 50 mL.
- Repetir o processo de extração acima duas vezes com 15 mL e 10 mL de solução de TCA a 5%; combinar o filtrado e diluí-lo a 50 ml com solução de TCA a 5%.
9. Determinação dos limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ)
- Determine o LOD pela concentração correspondente quando a relação sinal-ruído (S/N) = 3.
- Determinar o LOQ pela concentração correspondente quando a S/N = 10.
10. Determinação do teor de TMA da amostra
- Pegue cerca de 1 g de pó fino de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo , respectivamente, extraia a amostra de acordo com o método acima e determine-a na máquina.
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Representative Results
Diagramas esquemáticos do princípio de pré-processamento e operação deste protocolo são mostrados na Figura 1 e na Figura 2, respectivamente. O tempo de pico da MAT foi de 2,3 min, com forma acentuada do pico e sem interferência de outras impurezas (Figura 3). Medindo-se a faixa linear de 0,1-10 μg/mL de solução padrão de TMA, com concentração de TMA como abscissa e área de pico como ordenada, uma curva padrão foi traçada. A equação de regressão linear foi obtida como y = 2522482x + 24255, com o coeficiente de correlação (R2) = 0,9998, mostrando uma boa relação linear. O LOD e o LOQ foram calculados com S/N = 3 e S/N = 10, respectivamente. O LOD foi de 0,03 mg/kg e o LOQ foi de 0,11 mg/kg. Para investigar a precisão deste método, o conteúdo de TMA (0,1 μg/mL) foi determinado seis vezes em paralelo com um desvio padrão relativo (RSD) de 5,84%, o que comprovou a boa precisão deste método. Um grupo de amostras de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo foram selecionadas como amostras representativas para o experimento de recuperação (S02, S05, S07, respectivamente); estes foram submetidos a testes de recuperação fortificada por secagem para redução de TMA nas ervas, e as taxas médias de recuperação foram de 84,49%, 94,66% e 85,67%, respectivamente, com a precisão atendendo aos requisitos de análise (Tabela 4). TMA foi detectada em nove lotes de ervas de Pheretima, Periplaneta Americana e Hirudo, com concentrações variando de 13,23-271,63 mg/kg (Tabela 5). Este método de protocolo tem bons resultados de validação metodológica e também detectou o conteúdo de TMA em drogas derivadas de animais com um odor de peixe óbvio.
Figura 1: Diagrama esquemático do princípio de reação da solução de extração de lixívia-parafina. (1) Pesar com precisão 2 ml de solução de hidróxido de sódio num frasco para injetáveis de 20 ml de headspace. (2) Adicionar 0,5 g de parafina sólida ao frasco para injetáveis para o headspace. (3) Aquecer para derreter a parafina sólida, que é revestida com solução de hidróxido de sódio e flutua acima da solução de hidróxido de sódio. (4) Após arrefecimento, a parafina solidifica-se e sela firmemente sobre a solução de hidróxido de sódio. (5) Tomar 2 mL de solução de extração da amostra e colocá-la sobre a camada de parafina, pressionar a tampa e selar. (6) Coloque o frasco para injetáveis de headspace selado na máquina para medição. O aquecimento do forno termostático derrete a camada de parafina, e os reagentes ácido-base acima e abaixo da camada de parafina reagem para produzir TMA em um ambiente selado. O processamento do headspace da amostra é realizado aproximadamente nas seções 1 a 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama esquemático da operação de pré-tratamento da amostra. (A) Lixívia selada: passo 4.1-4.3 do protocolo. (B) Extração da amostra: seção 1 e etapa 4.4 do protocolo. (C) Detecção de MAT: passo 4.5 e seção 5 do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatograma iônico total de TMA. Espectrograma de 1 μg/mL de solução padrão de TMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Lote | Origem | |
| Pheretima | S01 | Cidade de Leshan, Província de Sichuan |
| Pheretima | E02 | Cidade de Dianbai, Província de Guangdong |
| Pheretima | E03 | Cidade de Maoming, Província de Guangdong |
| Periplaneta americana | E04 | Cidade de Xichang, Prefeitura Autônoma de Liangshan Yi, Província de Sichuan |
| Periplaneta americana | E05 | Condado de Midu, Prefeitura de Dali, Província de Yunnan |
| Periplaneta americana | E06 | Cidade de Bozhou, Província de Anhui |
| Hirudo | E07 | Condado de Weishan (Cidade de Jining) |
| Hirudo | E08 | Cidade de Kunshan, Província de Jiangsu |
| Hirudo | E09 | Distrito de Laiwu, Cidade de Jinan, Província de Shandong |
Tabela 1: Informações sobre medicamentos derivados de animais.
| Condição de headspace | |
| Temperatura do forno termostático | 80 °C |
| Tempo para a amostra b termostato | 30 minutos |
| Temperatura da agulha do headspace | 100 °C |
| Tamanho da amostra | 1 mL |
| Condições GC-MS | |
| Coluna Cromatográfica | SH-Amina volátil, 30m×0.32mm×5μm |
| Programa de temperatura da coluna | 40 °C (0,5 min) _20 °C /min _200 °C (5 min) |
| Temperatura do injetor | 200 °C |
| Modo de controle de gás transportador | velocidade linear constante |
| Modo de injeção | injeção dividida |
| Razão de divisão | 10:01 |
| Fluxo da coluna | 2 mL/min |
| Tamanho da amostra | 1 mL |
| Modo de ionização | IE |
| Temperatura da fonte de íons | 200 °C |
| Temperatura da interface GC-MS | 230 °C |
| Tensão do detector | Tensão de sintonia +0,6 kV |
| Informações sobre o modo de aquisição | MRM |
Tabela 2: Condição do headspace e condições do GC-MS/MS.
| Nome composto | CAS | Tempo de retenção (min) | Íon quantitativo (m/z) | CE | Íon de referência (m/z) | CE |
| Trimetilamina | 75-50-3 | 2.308 | 58>42 | 20 | 58>30 | 7 |
Tabela 3: Informações sobre o composto de TMA.
| Amostra | Concentração da amostra (mg/kg) | Concentração acentuada (mg/kg) | Concentração medida (mg/kg) | Taxa média de recuperação (%) | DSR (%) |
| E02 | 128.99 | 500.00 | 548.50 | 84.49 | 2.12% |
| E05 | 49.08 | 500.00 | 520.93 | 94.66 | 0.96% |
| E07 | 101.36 | 500.00 | 527.07 | 85.67 | 1.87% |
Tabela 4: Resultados da experiência de taxa de recuperação de TMA em medicamentos derivados de animais.
| Amostra | Concentração da amostra (mg/kg) |
| S01 | 88.11 |
| E02 | 137.34 |
| E03 | 18.63 |
| E04 | 19.10 |
| E05 | 40.50 |
| E06 | 13.23 |
| E07 | 271.63 |
| E08 | 69.73 |
| E09 | 67.70 |
Quadro 5: Resultados da determinação da concentração de TMA em medicamentos de origem animal.
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Discussion
Os medicamentos de origem animal provêm de todo o corpo, órgãos ou tecidos, produtos fisiológicos ou patológicos, excreções ou secreções e produtos transformados de animais. A TMA é uma importante fonte de odor de peixe em medicamentos derivados de animais; é uma substância malcheirosa típica com um limiar olfatório muito baixo (0,000032 × 10-6 V/V) e um forte odor de peixe13. Atualmente, o método HS-GC-MS comumente usado não pode detectar TMA em medicamentos derivados de animais de forma estável e precisa.
Este protocolo é aprimorado em vários aspectos: (1) A ATM é mais polar e alcalina. Neste protocolo, uma coluna especial para cromatografia gasosa de amina volátil é selecionada para detectar TMA, o que garante a precisão e sensibilidade da detecção de TMA. (2) No processo de preparação da amostra do método HC-GC-MS em GB5009.179-2016, uma solução de hidróxido de sódio de alta concentração é injetada no frasco para injetáveis de headspace selado10. Nesse momento, a ocorrência da reação ácido-base leva a um aumento da pressão no frasco do headspace, o que pode causar o escape de MAT, resultando em detecção imprecisa de MAT. Esse protocolo refere-se ao método de detecção de resíduo de dióxido de enxofre na medicina tradicional chinesa14. No pré-tratamento da amostra, a parafina sólida é usada como meio para isolar reagentes ácido-básicos. Depois que o frasco para injetáveis de headspace é selado, a parafina derrete lentamente sob o aquecimento do forno termostático, evita a reação ácido-base grave e fornece um bom ambiente hermético para a reação de TMA, garantindo a estabilidade e precisão da detecção de TMA. (3) Este protocolo utiliza o modo MRM em GC-MS/MS para aquisição e otimiza os parâmetros de detecção (programa de temperatura da coluna, etc.) para garantir a eficiência e precisão analítica.
Os seguintes pontos devem ser observados na operação deste protocolo: (1) uma quantidade adequada de cera sólida de parafina deve ser selecionada. Uma dosagem menor de parafina levará a uma camada de parafina não selada e à reação imediata de reagentes ácido-básicos, resultando na geração e escape de TMA antes do selamento. Uma dosagem maior de parafina pode dificultar a liberação, o enriquecimento e a detecção de TMA. (2) A glândula deve estar apertada e o selo intacto. Além disso, existem algumas limitações do protocolo. A TMA em medicamentos de origem animal é endógena e não pode ser removida de forma limpa por secagem; uma baixa concentração de solução padrão de cloridrato de TMA foi usada no experimento de recuperação, mas o efeito foi insatisfatório. Portanto, apenas a mesma concentração da solução-padrão de cloridrato de TMA foi selecionada para o experimento de recuperação neste protocolo.
Em conclusão, este protocolo forneceu um método de pré-tratamento da amostra e detecção precisa de MAT em medicamentos derivados de animais. O estabelecimento desse método preencheu a lacuna no método de detecção de TMA em medicamentos derivados de animais e forneceu suporte técnico para a pesquisa de substâncias odoríferas de peixe em medicamentos derivados de animais, o que é de grande importância para promover a pesquisa, o desenvolvimento e a aplicação de medicamentos derivados de animais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82173991) e do Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2022YFS0442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
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Química Edição 193 medicina derivada de animais trimetilamina odor de peixe cromatografia gasosa headspace-espectrometria de massas quadrupolo em tandemErratum
Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd
to:
Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd
