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Bioengineering

धातु-कार्बनिक फ्रेमवर्क विषाक्तता प्रोफाइल के वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट सेंसिंग

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

निम्नलिखित अध्ययन इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस), एक वास्तविक समय, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग तकनीक का उपयोग करके एक चयनित धातु-कार्बनिक ढांचे के विषाक्त प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन करता है।

Abstract

धातु-कार्बनिक ढांचे (एमओएफ) कार्बनिक सॉल्वैंट्स में धातु आयनों और कार्बनिक लिंकर के समन्वय के माध्यम से बनने वाले संकर हैं। बायोमेडिकल और औद्योगिक अनुप्रयोगों में एमओएफ के कार्यान्वयन ने उनकी सुरक्षा के बारे में चिंताओं को जन्म दिया है। इसमें, एक चयनित एमओएफ की प्रोफ़ाइल, एक ज़ीओलिटिक इमिडाज़ोल फ्रेमवर्क, का मूल्यांकन मानव फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के संपर्क में आने पर किया गया था। मूल्यांकन के लिए मंच एक वास्तविक समय तकनीक थी (यानी, इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन [ईसीआईएस])। यह अध्ययन उजागर कोशिकाओं पर चयनित एमओएफ के कुछ हानिकारक प्रभावों की पहचान और चर्चा करता है। इसके अलावा, यह अध्ययन व्यापक सेल मूल्यांकन के लिए वास्तविक समय विधि बनाम अन्य जैव रासायनिक परख का उपयोग करने के लाभों को दर्शाता है। अध्ययन का निष्कर्ष है कि सेल व्यवहार में देखे गए परिवर्तन विभिन्न भौतिक रासायनिक विशेषताओं के एमओएफ के संपर्क में आने पर प्रेरित संभावित विषाक्तता और उपयोग किए जा रहे उन ढांचे की खुराक का संकेत दे सकते हैं। सेल व्यवहार में परिवर्तन को समझकर, कोई विशेष रूप से उनकी भौतिक रासायनिक विशेषताओं को अनुकूलित करके बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एमओएफ की सुरक्षित-दर-डिजाइन रणनीतियों को बेहतर बनाने की क्षमता की भविष्यवाणी करता है।

Introduction

धातु-कार्बनिक ढांचे (एमओएफ) कार्बनिक सॉल्वैंट्स में धातु आयनों और कार्बनिक लिंकर 1,2 के संयोजन के माध्यम से बने संकर हैं। इस तरह के संयोजनों की विविधता के कारण, एमओएफ में संरचनात्मक विविधता3, असमर्थ छिद्र, उच्च थर्मल स्थिरता और उच्च सतह क्षेत्र 4,5 होते हैं। ऐसी विशेषताएं उन्हें विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों में आकर्षक उम्मीदवार बनाती हैं, गैस भंडारण6,7 से उत्प्रेरण 8,9 तक, और इसके विपरीत एजेंट10,11 से दवा वितरण इकाइयों 12,13 तक। हालांकि, ऐसे अनुप्रयोगों में एमओएफ के कार्यान्वयन ने उपयोगकर्ताओं और पर्यावरण दोनों के लिए उनकी सुरक्षा के सापेक्ष चिंताओं को बढ़ा दिया है। प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है, उदाहरण के लिए, एमओएफसंश्लेषण 1,14,15 के लिए उपयोग किए जाने वाले धातु आयनों या लिंकर के लिए कोशिकाओं के संपर्क में कोशिकाओं के संपर्क में आने पर सेलुलर फ़ंक्शन और विकास बदल जाता है। उदाहरण के लिए, टैमम्स-तबर एट अल ने प्रदर्शित किया कि जेडआईएफ -8 एमओएफ, एक जेडएन-आधारित एमओएफ, जेडआर-आधारित और एफई-आधारित एमओएफ के सापेक्ष मानव ग्रीवा कैंसर सेल लाइन (एचईएलए) और माउस मैक्रोफेज सेल लाइन (जे 774) में अधिक सेलुलर परिवर्तन कर रहा था। इस तरह के प्रभाव संभवतः ZIF-8 (यानी, Zn) के धातु घटक के कारण थे, जो संभावित रूप से फ्रेमवर्क विघटन और Zn आयन रिलीज1 पर सेल एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकता है। इसी तरह, गंडारा-लो एट अल ने प्रदर्शित किया कि एचकेयूएसटी -1, एक क्यू-आधारित एमओएफ, ने 10 μg / mL या उससे अधिक की सांद्रता पर उपयोग किए जाने पर माउस रेटिनोब्लास्टोमा सेल व्यवहार्यता में उच्चतम कमी का कारण बना। यह संभवतः इस ढांचे के संश्लेषण के दौरान शामिल क्यू मेटल आयन के कारण था, जो एक बार जारी होने के बाद,उजागर कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित कर सकता है।

इसके अलावा, विश्लेषण से पता चला है कि विभिन्न भौतिक रासायनिक विशेषताओं वाले एमओएफ के संपर्क में उजागर कोशिकाओं की अलग-अलग प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, वैगनर एट अल ने प्रदर्शित किया कि जेडआईएफ -8 और एमआईएल -160 (एक अल-आधारित ढांचा), एक अमर मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिका के संपर्क में उपयोग किया जाता है, जिससे ढांचे के भौतिक रासायनिक गुणों, अर्थात् हाइड्रोफोबिसिटी, आकार औरसंरचनात्मक विशेषताओं पर निर्भर सेलुलर प्रतिक्रियाएं हुईं। पूरक रूप से, चेन एट अल ने प्रदर्शित किया कि मानव सामान्य यकृत कोशिकाओं (एचएल -7702) के संपर्क में 160 μg / mL MIL-100 (Fe) की एकाग्रता ने सेलुलर व्यवहार्यता में सबसे बड़ा नुकसान किया, संभवतः इस विशिष्ट ढांचे के धातु घटक (यानी, Fe17) के कारण।

हालांकि ये अध्ययन सेलुलर सिस्टम पर एमओएफ के हानिकारक प्रभावों को उनकी भौतिक रासायनिक विशेषताओं और एक्सपोजर सांद्रता के आधार पर वर्गीकृत करते हैं, इस प्रकार फ्रेमवर्क कार्यान्वयन के साथ संभावित चिंताओं को बढ़ाते हैं, विशेष रूप से बायोमेडिकल क्षेत्रों में, इनमें से अधिकांश मूल्यांकन एकल समय बिंदु वर्णमिति परख पर आधारित हैं। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया था कि जब (3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2,5-डाइफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड) टेट्राज़ोलियम (एमटीटी) और पानी में घुलनशील टेट्राज़ोलियम नमक (डब्ल्यूएसटी -1) परख का उपयोग किया गया था, तो ये जैव रासायनिक अभिकर्मक उन कणों के साथ उनकी बातचीत पर गलत सकारात्मकता पैदा कर सकते हैं जो कोशिकाओं को भी18 के संपर्क में थे। टेट्राज़ोलियम नमक और तटस्थ लाल अभिकर्मकों को कणों की सतहों पर एक उच्च सोखना या बाध्यकारी संबंध दिखाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एजेंट सिग्नल हस्तक्षेप19 था। इसके अलावा, अन्य प्रकार के परखों के लिए, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री, जिसे पहले एमओएफ20,21 के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता था, यह दिखाया गया था कि यदि कणों के हानिकारक प्रभावों के व्यवहार्य विश्लेषण पर विचार किया जाना है तो प्रमुख मुद्दों को दरकिनार करना होगा। विशेष रूप से, कणों के आकार की पहचान सीमा, विशेष रूप से मिश्रित आबादी में जैसे कि एमओएफ द्वारा पेश की जाती है या सेलुलर परिवर्तनों से पहले अंशांकन के लिए उपयोग किए जाने वाले कणों के संदर्भ,को संबोधित किया जाना चाहिए। यह भी दिखाया गया था कि इस तरह के साइटोमेट्री परख के लिए सेल लेबलिंग के दौरान उपयोग की जाने वाली डाई नैनोकणों के साथ भी हस्तक्षेप कर सकती है जो कोशिकाओं को23 के संपर्क में लाया गया था।

इस अध्ययन का लक्ष्य एक चुनिंदा एमओएफ के संपर्क में आने पर सेल व्यवहार में परिवर्तन का आकलन करने के लिए वास्तविक समय, उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन परख का उपयोग करना था। वास्तविक समय मूल्यांकन समय-निर्भर प्रभावों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है, जैसा कि एक्सपोज़र16 की खिड़कियों से संबंधित है। इसके अलावा, वे सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन, सेल आकृति विज्ञान और सेल-सेल इंटरैक्शन में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, साथ ही साथ इस तरह के परिवर्तन क्रमशः24,25 और एक्सपोज़र समय की सामग्री के भौतिक रासायनिक गुणों पर कैसे निर्भर करते हैं।

प्रस्तावित दृष्टिकोण की वैधता और प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, मानव ब्रोन्कियल उपकला (बीईएएस -2 बी) कोशिकाओं, जेडआईएफ -8 (ज़ीओलिटिक इमिडाज़ोलेट16 का एक हाइड्रोफोबिक ढांचा), और इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) का उपयोग किया गया था। बीईएएस -2 बी कोशिकाएं फेफड़ों के जोखिमके लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करती हैं और पहले नैनोक्ले और उनके थर्मल रूप से अवक्रमित उपोत्पाद26,27,28 के लिए कोशिकाओं के संपर्क में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के साथ-साथ नैनोमैटेरियल्स की विषाक्तता का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया है, जैसे कि एकल-दीवार कार्बन नैनोट्यूब (एसडब्ल्यूसीएनटी)18। इसके अलावा, ऐसी कोशिकाओं का उपयोग फुफ्फुसीय उपकला समारोह29 के लिए एक मॉडल के रूप में 30 से अधिक वर्षों के लिए किया गया है। ZIF-8 को उत्प्रेरण30 में इसके व्यापक कार्यान्वयन के कारण और बायोइमेजिंग और दवा वितरण 32 के लिए विपरीत एजेंट31 के रूप में चुना गया था, और इस प्रकार ऐसे अनुप्रयोगों के दौरान फेफड़ों के जोखिम की विस्तारित क्षमता के लिए। अंत में, ईसीआईएस, गैर-आक्रामक, वास्तविक समय तकनीक, का उपयोग पहले वास्तविक समय 16,18,28 में विश्लेषणों (सामग्री और दवाओं दोनों) और उजागर कोशिकाओं के बीच विभिन्न प्रकार की बातचीत के परिणामस्वरूप सेल पालन, प्रसार, गतिशीलता और आकृति विज्ञान 16,26 में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था।. ईसीआईएस सोने के इलेक्ट्रोड पर स्थिर कोशिकाओं के प्रतिबाधा को मापने के लिए एक वैकल्पिक धारा (एसी) का उपयोग करता है, जिसमें प्रतिबाधा परिवर्तन सेल-गोल्ड सब्सट्रेट इंटरफ़ेस पर प्रतिरोध और धारिता में परिवर्तन, सेल-सेल इंटरैक्शन द्वारा प्रेरित बाधा फ़ंक्शन और ऐसे सोने के इलेक्ट्रोड33,34 के ओवर-सेल लेयर कवरेज में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। ईसीआईएस का उपयोग एक गैर-संवेदनशील, वास्तविक समय के तरीके सेनैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन पर मात्रात्मक माप की अनुमति देता है।

यह अध्ययन एकल-बिंदु परख मूल्यांकन के साथ वास्तविक समय में सेलुलर व्यवहार में एमओएफ-प्रेरित परिवर्तनों के मूल्यांकन की सादगी और आसानी का आकलन और तुलना करता है। इस तरह के एक अध्ययन को रुचि के अन्य कणों के संपर्क में आने के जवाब में सेल प्रोफाइल के मूल्यांकन के लिए आगे बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार सुरक्षित-बाय-डिज़ाइन कण परीक्षण और बाद में कार्यान्वयन में मदद करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, यह अध्ययन आनुवंशिक और सेलुलर परख ों का पूरक हो सकता है जो एकल-बिंदु मूल्यांकन हैं। इससे सेलुलर आबादी पर कणों के हानिकारक प्रभावों का अधिक सूचित विश्लेषण हो सकता है और इसका उपयोग ऐसे कणों की विषाक्तता की उच्च-थ्रूपुटतरीके से जांच के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. जेडआईएफ -8 संश्लेषण

  1. इस उदाहरण के उद्देश्य के लिए, ZIF-8 को संश्लेषित करने के लिए 1: 10: 100 (धातु: लिंकर: विलायक) द्रव्यमान अनुपात का उपयोग करें। इसके लिए, जस्ता नाइट्रेट हेक्साहाइड्रेट को मापें, और माप रिकॉर्ड करें। लिंकर, 2-मेथिलिमिडाज़ोल और विलायक (यानी, मेथनॉल) के लिए आवश्यक राशि की गणना करने के लिए उदाहरण द्रव्यमान अनुपात का उपयोग करें।
  2. जिंक नाइट्रेट हेक्साहाइड्रेट और लिंकर को दो अलग-अलग ग्लास शीशियों में रखें। मेथनॉल की गणना की गई मात्रा का आधा हिस्सा जिंक नाइट्रेट हेक्साहाइड्रेट में और दूसरा आधा लिंकर में जोड़ें। प्रत्येक घोल को घुलने दें।
  3. दो समाधानों को मिलाएं (यानी, क्रमशः धातु और लिंकर युक्त समाधान)। कंटेनर को एक हलचल प्लेट पर प्रतिक्रिया के लिए संयुक्त समाधान के साथ रखें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 24 घंटे के लिए 700 आरपीएम पर हिलाएं।

2. ZIF-8 संग्रह

  1. एक बार जब उपरोक्त प्रतिक्रिया समाप्त हो जाती है (यानी, 24 घंटे के बाद), घोल को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें और 5 मिनट के लिए 3,075 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें (समान मात्रा में उपयोग करें और रोटर को संतुलित करें)। सेंट्रीफ्यूज ्ड ट्यूबों से किसी भी सुपरनैटेंट को हटा दें।
  2. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मेथनॉल (5-15 एमएल) जोड़ें और कणों को फिर से फैलाएं।
  3. सेंट्रीफ्यूजेशन और धोने के चरणों को कम से कम दो से चार बार दोहराएं। अंतिम धोने के बाद, सतह पर तैरने वाले को छुट्टी दें।
    नोट: धोने के चरण किसी भी गैर-अवक्षेपित प्रजातियों को हटा देते हैं।
  4. ट्यूबों के ढक्कन हटा दें और शीर्ष पर पैराफिल्म टेप रखें; इसके बाद, पैराफिल्म में छेद करें। नमूने वाले ट्यूब को 24 घंटे के लिए सूखने के लिए आरटी में एक वैक्यूम कक्ष में रखें।

3. जेडआईएफ -8 सतह आकृति विज्ञान (स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी [एसईएम])

  1. एसईएम विश्लेषण के दौरान होने वाली किसी भी चार्जिंग को रोकने के लिए कार्बन टेप पर जेडआईएफ -8 के सूखे पाउडर को माउंट करें और सोने-पैलेडियम के साथ 120 सेकंड के लिए स्पटर करें।
  2. माइक्रोस्कोप के त्वरित वोल्टेज को 15 केवी पर सेट करें। कणों को फ़ोकस में लाएं और आवर्धन को समायोजित करें (500x, 1,000x, 1,500x, 4,000x, 10,000x, 20,000x, 30,000x, और 40,000x के आवर्धन का उपयोग किया गया था।
  3. आवर्धन के तहत कणों की छवि बनाएं जो एक स्पष्ट कण आकार और आकृति विज्ञान मूल्यांकन दोनों की अनुमति देता है (5 μm, 10 μm, और 20 μm के कणों के लिए श्रेणियों पर विचार करने की अनुशंसित)।
  4. दृश्य के कम से कम तीन अलग-अलग क्षेत्रों से डेटा एकत्र करें, और प्रत्येक के लिए, विभिन्न आवर्धन पर विचार करें।

4. जेडआईएफ -8 मौलिक संरचना

  1. SEM इमेजिंग के लिए चरणों का पालन करें।
  2. एसईएम माइक्रोस्कोप की ऊर्जा-फैलाने वाली एक्स-रे (ईडीएक्स) स्पेक्ट्रोस्कोपी इकाई का उपयोग करके, नमूना मौलिक संरचना का विश्लेषण करें।
  3. सुनिश्चित करें कि एसईएम त्वरण वोल्टेज और आवर्धन ईडीएक्स मॉनिटर से मेल खाता है। एसईएम माइक्रोस्कोप पर इन्फ्रारेड कैमरा बंद करें।
  4. ईडीएक्स मॉनिटर पर, स्पेक्ट्रम एकत्र करें पर जाएं और 200 सेकंड का संग्रह समय इनपुट करें। यह कण चार्जिंग और विघटन से बचने के लिए अनुशंसित है जो गलत मूल्यांकन का कारण बन सकता है।
  5. दृश्य के कम से कम तीन अलग-अलग क्षेत्रों से डेटा एकत्र करें। एक बार संग्रह समाप्त हो जाने के बाद, डेटा का विश्लेषण करें, और रुचि के तत्वों की पहचान करें।

5. सेल संस्कृति

  1. कल्चर ने मीडिया में बीईएएस -2 बी कोशिकाओं को 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 0.2% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया।
    नोट: 5-10 के बीच के मार्ग का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि37 का उपयोग किए जा रहे सेल बैच में पहले कोई फेनोटाइपिक परिवर्तन नहीं हुआ है (सभी अभिकर्मक सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं)।
  2. 100 मिमी सेल कल्चर प्लेट लें और प्लेट पर 10 एमएल मीडिया रखें। प्लेट में 1 एमएल बीईएएस -2 बी सेल समाधान जोड़ें।
  3. प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें और कोशिकाओं को बढ़ने दें।
  4. यह निर्धारित करने के लिए 24 घंटे के बाद प्लेट की जांच करें कि क्या कोशिकाएं 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच गई हैं। इसमें, 80% कंफ्लुएंसी पालन की गई कोशिकाओं द्वारा कवर की गई सतह के प्रतिशत को संदर्भित करता है। यदि नहीं, तो मीडिया को बदलें और कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि 80% कंफ्लुएंसी स्तर तक न पहुंच जाए।

6. सेल गिनती

  1. एक बार जब प्लेट पर कोशिकाएं 80% की स्थिरता तक पहुंच जाती हैं, तो प्लेट से मीडिया को हटा दें। प्लेट को 5 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से धोएं।
  2. पीबीएस को प्लेट से हटा दें। प्लेट में 2 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और इसे 2 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें।
  3. प्लेट में 2 एमएल मीडिया जोड़ें और प्लेट से कोशिकाओं को हटाने के लिए मीडिया को ऊपर और नीचे पाइप करें। घोल को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 123 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें और 2 एमएल मीडिया जोड़ें। कोशिकाओं को फिर से फैलाने के लिए मीडिया को ऊपर और नीचे करें।
  5. 1.5 एमएल ट्यूब का उपयोग करके, ट्राइपैन ब्लू के 20 μL और फिर सेल समाधान के 20 μL (ट्राइपैन ब्लू: सेल समाधान का 1: 1 अनुपात) जोड़ें।
  6. सेल मिश्रण के 10 μL को एक ग्लास स्लाइड पर रखें और इसे एक स्वचालित सेल काउंटर पर रखें। स्क्रीन के फ़ोकस में आने तक प्रतीक्षा करें, फिर कैप्चर का चयन करें।
  7. स्क्रीन लाइव सेल नंबर और सेल व्यवहार्यता प्रदर्शित करता है। माप सीमा 1 x 104-1 x 107 कोशिकाओं तक फैली हुई है।
  8. वैकल्पिक रूप से, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से कोशिकाओं की गणना करें।
    1. इसके लिए, हेमोसाइटोमीटर में ट्राइपैन ब्लू-ट्रीटेड सेल समाधान के 15-20 μL जोड़ें।
    2. हेमोसाइटोमीटर की ग्रिड लाइनों पर 10x उद्देश्य फोकस के साथ एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    3. चार बाहरी वर्गों में कोशिकाओं की संख्या की गणना करें और संख्या को चार से विभाजित करें। फिर, लाइव सेल काउंट नंबर प्राप्त करने के लिए 10,000 से गुणा करें।
    4. सेल व्यवहार्यता की गणना करने के लिए, कुल सेल गिनती प्राप्त करने के लिए जीवित और मृत सेल गिनती को एक साथ जोड़ें, और बाद में कुल सेल गिनती से लाइव सेल काउंट को विभाजित करें।

7. जेडआईएफ -8 खुराक की तैयारी

  1. 1 मिलीग्राम / एमएल का एक ZIF-8 स्टॉक समाधान बनाएं। इसके लिए, ZIF-8 की मात्रा को मापें और 1 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए कणों में विआयनीकृत (डीआई) पानी जोड़ें।
  2. सोनिकेट (सोनिकेटर को सोनिक्स पर सेट करें) पानी के स्नान में 30 सेकंड के अंतराल पर 2 मिनट के लिए ZIF-8 स्टॉक समाधान।
  3. समीकरण सी 1 वी1= सी 2 वी2का उपयोग करके वांछित खुराक तक पहुंचने के लिए आवश्यक स्टॉक समाधान और डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) की मात्रा की गणना करके सेलुलर एक्सपोजर के लिए जेडआईएफ -8 की अलग-अलग खुराक बनाएं। खुराक 0-950 μg / mL से होगी।
    नोट: इस प्रयोग में, 0 μg / mL, 1 μg / mL, 10 μg / mL, 50 μg / mL, 100 μg / mL, 250 μg / mL, 500 μg / mL, 750 μg / mL और 950 μg / mL की खुराक का चयन किया गया था।

8. आधा-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50)

  1. सेल गिनती के बाद, 100 μL / वेल की मात्रा के साथ 96-वेल प्लेट में 4 x 104 कोशिकाओं / mL के घनत्व पर BEAS-2B कोशिकाओं को बीज दें।
    1. 4 x 104 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व तक पहुंचने के लिए, मीडिया के साथ संयुक्त होने के लिए आवश्यक सेल समाधान की मात्रा की गणना करने के लिए सी 1 वी1= सी 2 वी2का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक खुराक के लिए खाली कुओं को बनाए रखना सुनिश्चित करें; इन कुओं को ZIF-8 एक्सपोजर तक खाली छोड़ दें।
  2. 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें और कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर में बढ़ने की अनुमति दें।
  3. कुओं से मीडिया को निकालें और बीईएएस -2 बी कोशिकाओं को 0-950 μg / mL से लेकर ZIF-8 खुराक तक उजागर करें। अपने संबंधित रिक्त और सेल कुओं में ZIF-8 के 100 μL जोड़ें।
  4. 96-वेल प्लेटों को 48 घंटे के एक्सपोजर समय के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  5. एक्सपोजर के बाद, प्रत्येक कुएं (रिक्त और सेल कुओं) में 4-[3-(4-इडोफिनाइल)-2-(4-नाइट्रोफेनिल)-2एच-5-टेट्राज़ोलियो]-1,3-बेंजीन डाइसल्फोनेट (डब्ल्यूएसटी -1) के 10 μL जोड़ें और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। मीडिया कुओं में रहता है; अनुपात 1: 10 (अभिकर्मक: मीडिया) है।
  6. 485 एनएम अवशोषण का उपयोग करके प्लेट रीडर पर अवशोषण में परिवर्तन पढ़ें।
  7. आईसी50 मान निर्धारित करने के लिए सॉफ्टवेयर के माध्यम से सेल व्यवहार्यता की गणना करें (अनुभाग 10 देखें)।

9. इलेक्ट्रिकल सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस)

  1. ECIS विश्लेषण करने के लिए 96-वेल प्लेट (96W10idf) का उपयोग करें। प्लेट28 में अंतर-डिजिटाइज्ड उंगली कनेक्शन इलेक्ट्रोड होते हैं जो लगभग 4 मिमी2 के क्षेत्र को कवर करते हैं।
  2. सबसे पहले, परीक्षण करें कि सभी कुओं को सेंसर द्वारा पढ़ा जा रहा है। इसके लिए 96-वेल प्लेट को वेल स्टेशन पर रखें और सेटअप बटन पर क्लिक करें।
  3. यदि कुओं को ठीक से जोड़ा जाता है, तो हरा दिखाई देगा; किसी भी असंबद्ध कुएं को लाल के रूप में पहचाना जाएगा। यदि ऐसा कोई मामला उठता है, तो कुएं की प्लेट को हटा दें और फिर से डालें और सेटअप बटन पर फिर से क्लिक करें, जब तक कि सभी कुएं व्यवहार्य ग्रीन रीडिंग प्रदान न करें।
  4. संभावित बहाव को रोकने के लिए प्रति कुएं 200 μL मीडिया के साथ 40 मिनट के लिए इलेक्ट्रोड को स्थिर करें। उपयोग किए जा रहे प्रत्येक कुएं में 200 μL मीडिया जोड़ें और फिर 96-वेल प्लेट को ECIS स्टेशन पर रखें। प्लेट ठीक से कनेक्ट डे है यह सुनिश्चित करने के लिए सेटअप/चेक पर क्लिक करें। स्थिर पर क्लिक करें।
  5. एक बार स्थिरीकरण पूरा हो जाने के बाद, स्टेशन से प्लेट को हटा दें और प्रत्येक कुएं से मीडिया को हटा दें।
  6. बीईएएस -2 बी कोशिकाओं को 4 x 104 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर, प्रति कुएं 100 μL की मात्रा के साथ, कोशिकाओं वाले कुओं में बीज दें और इनक्यूबेटर में ईसीआईएस स्टेशन पर प्लेट रखें।
  7. मॉनिटर पर, यह निर्धारित करने के लिए चेक पर क्लिक करें कि सभी इलेक्ट्रोड स्टेशन पर सेंसर द्वारा पढ़े जाते हैं।
  8. एकाधिक Freq/Time (MFT) का चयन करके समय पाठ्यक्रम माप सेट करें। कार्यक्रम सात अलग-अलग आवृत्तियों पर प्रत्येक अच्छी तरह से मापेगा।
  9. प्रारंभ पर क्लिक करें और इसे 24 घंटे तक चलने दें ताकि कोशिकाएं एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर बना सकें।
  10. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं वाले कुएं मॉनिटर पर बढ़े हुए प्रतिरोध दिखाएंगे। यह एक संकेतक है कि कोशिकाएं इलेक्ट्रोड से जुड़ी हुई हैं।
  11. डेटा संग्रह को रोकने के लिए मॉनिटर पर विराम दबाएँ.
  12. ऊपर अनुभाग 7 में उल्लिखित चरणों का पालन करके गणना किए गए आईसी50 मान पर और नीचे ZIF-8 खुराक बनाएं।
  13. ZIF-8 नैनोकणों को 100 μL प्रति कुएं की मात्रा पर उनके संबंधित रिक्त और सेल कुओं में उजागर करें और 96-वेल प्लेट को स्टेशन पर वापस रखें।
  14. यह सुनिश्चित करने के लिए मॉनिटर पर फिर से चेक पर क्लिक करें कि सेंसर सभी इलेक्ट्रोड को पढ़ रहे हैं। रिज्यूम पर क्लिक करें और सेलुलर व्यवहार और अनुलग्नक की निगरानी के लिए सिस्टम को 72 घंटे तक चलाने की अनुमति दें।
  15. एक बार डेटा संग्रह समाप्त हो जाने के बाद, मॉनिटर पर समाप्त करें पर क्लिक करें । फ़ाइल सहेजने के लिए, फ़ाइल > इस रूप में सहेजें क्लिक करें. डेटा को स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  16. अल्फा पैरामीटर प्राप्त करने के लिए, मॉडल पर क्लिक करें। स्क्रीन पॉप-अप पर, मीडिया-ओनली वेल पर क्लिक करें, फिर उस कुएं का चयन करें जिसमें केवल मीडिया है।
  17. सेट रेफ पर क्लिक करें। मॉनिटर पर, खोजें पर क्लिक करें।
  18. यदि सिस्टम में दिखाया गया कुआं वही नहीं है जो चुना गया था, तो चरण 9.16 दोहराएं।
  19. सेट पर क्लिक करें। डेटा संग्रह के लिए वांछित समय सीमा निर्धारित करने के लिए फिट टी-रेंज पर क्लिक करें।
  20. जब यह प्रसंस्करण कर रहा है, तो अल्फा पर क्लिक करें। जब सिस्टम विश्लेषण समाप्त कर लेता है, तो Save RBA पर क्लिक करें और इसे स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में सहेजें।
    नोट: ईसीआईएस मैनुअल देखें, जो निर्माता की वेबसाइट38 पर पाया जा सकता है।

10. डेटा विश्लेषण

  1. SEM
    1. एसईएम छवियों का विश्लेषण करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। फ़ाइल > खोलें क्लिक करें, और उसके बाद विश्लेषण करने के लिए छवि का चयन करें।
    2. थ्रेशोल्ड ऑपरेशन करने > लिए छवि को ग्रेस्केल में बदलने के लिए टाइप > 8 बिट्स पर क्लिक करें।
    3. पिक्सेल से माइक्रोन की दूरी माप को कैलिब्रेट करें। स्ट्रेट-लाइन टूल पर क्लिक करें और मापा जाने वाले प्रत्येक कण की लंबाई का पता लगाएं।
    4. विश्लेषण क्लिक करें , और उसके बाद स्केल सेट करें. ज्ञात दूरी एसईएम छवि पर स्केल बार के आकार की लंबाई पर सेट की जाएगी। लंबाई की ज्ञात इकाई को माइक्रोन पर सेट किया जाएगा। Global की जाँच करें और OK दबाएँ.
    5. स्ट्रेट-लाइन टूल पर क्लिक करें और कण के व्यास का पता लगाएं, फिर विश्लेषण और माप का चयन करें। लंबाई परिणाम रिकॉर्ड करें।
    6. सभी एकत्रित छवियों के लिए दोहराएं। एक उपयुक्त सांख्यिकी मूल्यांकन के लिए कम से कम 60 कणों से सभी व्यास का औसत निकालें।
  2. EDX
    1. सभी एकत्रित छवियों से प्रत्येक तत्व के सभी वजन प्रतिशत को एक साथ औसत करें (ऊपर ईडीएक्स अनुभाग देखें)।
    2. एक स्प्रेडशीट का उपयोग करके, एक्स-अक्ष पर प्रत्येक तत्व का बार ग्राफ ़ और वाई-अक्ष पर उनका औसत मौलिक भार प्रतिशत प्लॉट करें।
  3. आईसी50
    1. खाली कुओं का औसत निकालें और प्रत्येक प्रतिकृति के लिए खुराक कुओं का औसत निकालें।
    2. खुराक रिक्त औसत से नियंत्रण रिक्त औसत घटाकर समायोजित रिक्त की गणना करें। औसत खुराक मान से समायोजित रिक्त स्थान को घटाकर प्रत्येक खुराक के लिए सही सेल मूल्य की गणना करें।
    3. औसत नियंत्रण मान से प्रत्येक खुराक के लिए समायोजित रिक्त मान घटाएं। समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक खुराक की सेल व्यवहार्यता की गणना करें: सेल व्यवहार्यता = (सही सेल मूल्य / (नियंत्रण मूल्य - समायोजित रिक्त मान)) x 100।
    4. अन्य सभी प्रतिकृतियों के लिए इसे दोहराएं।
    5. प्रत्येक खुराक के लिए अंतिम सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रतिकृति के लिए सेल व्यवहार्यता का औसत निकालें।
    6. सॉफ्टवेयर में, स्क्रीन पर XY टैब चुनें।
    7. एक्स कॉलम में एकाग्रता (खुराक) मान दर्ज करें और वाई कॉलम में प्रत्येक खुराक से सेल व्यवहार्यता (%) दर्ज करें।
    8. विश्लेषण > ट्रांसफॉर्म > ओके पर क्लिक करके X मानों को रूपांतरित करें , और X = Log(X) ट्रांसफॉर्म करें.
    9. रूपांतरित डेटा पत्रक का चयन करके, विश्लेषण करें पर क्लिक करके और फिर सामान्यीकृत करें का चयन करके Y मानों को सामान्य करें.
    10. ट्रांसफ़ॉर्म डेटा शीट के सामान्यीकरण का चयन करें, विश्लेषण करें क्लिक करें, और नॉनलाइनियर रिग्रेशन (कर्व फिट) का चयन करें. खुराक-प्रतिक्रिया-निषेध का चयन करें और लॉग (अवरोधक) बनाम प्रतिक्रिया-परिवर्तनीय ढलान (चार पैरामीटर) पर क्लिक करें। परिणाम देखने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  4. ECIS
    1. स्प्रेडशीट से, प्रत्येक प्रतिकृति (रिक्त कुएं और खुराक कुएं) के लिए प्रतिरोध (ओम) कॉलम लें और उन्हें 4,000 हर्ट्ज आवृत्ति से एक साथ औसत करें। यह आवृत्ति सेल-सेल संपर्क मूल्यांकन38 की अनुमति देती है।
    2. प्रत्येक प्रतिकृति के लिए औसत खुराक से औसत रिक्त स्थान को घटाकर सही प्रतिरोध की गणना करें। प्रत्येक खुराक के लिए प्रतिकृति के लिए सही प्रतिरोध का औसत निकालें।
    3. औसत अल्फा पैरामीटर की गणना करने के लिए अल्फा मानों के लिए समान चरणों को दोहराएं। x-अक्ष को समय (h) के रूप में और y-अक्ष को प्रत्येक खुराक मान के लिए औसत प्रतिरोध/अल्फा मान के रूप में प्लॉट करें।

11. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. SEM
    1. स्प्रेडशीट फ़ाइल में एक मानक विचलन करें जहां ZIF-8 कणों के औसत व्यास की गणना की गई थी।
    2. स्प्रेडशीट में STDEV फ़ंक्शन का उपयोग करते हुए, 60 कणों के डेटा को हाइलाइट करें और एंटर पर क्लिक करें। गणना किए गए प्रत्येक औसत व्यास के लिए मानक विचलन को ग्राफ़ करें।
  2. EDX
    1. एसईएम (चरण 11.1.1-11.1.2) के समान, स्प्रेडशीट में एसटीडीईवी फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रत्येक औसत मौलिक संरचना के लिए मानक विचलन की गणना करें। प्रत्येक औसत तात्विक संरचना के लिए मानक विचलन को ग्राफ़ करें।
  3. आईसी50
    1. आईसी50 की गणना करने के लिए उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर को खोलें और समूहीकृत डेटा शीट पर क्लिक करें।
    2. समूह ए, समूह बी, आदि लेबल पंक्तियों में जेडआईएफ -8 खुराक दर्ज करें। प्रत्येक खुराक के लिए औसत सेल व्यवहार्यता दर्ज करें और जेडआईएफ -8 खुराक के अनुरूप कॉलम में दोहराएं।
    3. विश्लेषण पर क्लिक करें, और स्तंभ विश्लेषण के तहत, वन-वे एनोवा (और गैर-पैरामीट्रिक या मिश्रित) का चयन करें।
    4. प्रायोगिक डिज़ाइन टैब में, कोई मिलान या युग्मन नहीं चुनें. अवशिष्ट के गॉसियन वितरण के तहत, एनोवा का उपयोग करने के लिए हाँ का चयन करें। अंत में, समान एसडी मान लें के तहत साधारण एनोवा टेस्ट का उपयोग करें का चयन करें।
    5. एकाधिक तुलना टैब के अंतर्गत, नियंत्रण स्तंभ के माध्य के साथ प्रत्येक स्तंभ के माध्य की तुलना करें का चयन करें. परिणाम देखने के लिए ओके पर क्लिक करें।

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Representative Results

एक सामान्य इन विट्रो मॉडल सेल लाइन39 (बीईएएस -2 बी) का उपयोग करते हुए, इस अध्ययन का उद्देश्य प्रयोगशाला-संश्लेषित एमओएफ के संपर्क में आने पर सेल व्यवहार में परिवर्तन का आकलन करने के लिए ईसीआईएस की व्यवहार्यता और प्रयोज्यता का प्रदर्शन करना था। इन परिवर्तनों के मूल्यांकन को पारंपरिक वर्णमिति परख के माध्यम से विश्लेषण द्वारा पूरक किया गया था।

ढांचे की भौतिक रासायनिक विशेषताओं का मूल्यांकन पहले नियोजित विधियों की प्रजनन क्षमता, प्राप्त परिणामों की वैधता और ऐसे परिणामों की प्रासंगिक चर्चाओं को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। उदाहरण के लिए, ZIF-8 की सतह आकृति विज्ञान का विश्लेषण SEM के माध्यम से किया गया था; छवियों से पता चला कि फ्रेमवर्क ने एक रोम्बिक डोडेकाहेड्रॉन आकृति विज्ञान40 प्रदर्शित किया और इसका औसत आकार 62.87 एनएम ± 9.61 एनएम (चित्रा 1 ए) था। एमओएफ की मौलिक संरचना ईडीएक्स स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम सेनिर्धारित की गई थी। परिणामों से पता चला कि ZIF-8 की मुख्य संरचना में C, N, और Zn (यानी, इमिडाज़ोलेट लिंकर और धातु आयन, Zn16 का मेकअप) शामिल थे (चित्रा 1B)। पिछले एक्स-रे विवर्तन से पता चला है कि ZIF-8 क्रिस्टलीय चरणों ने 10.33 °, 12.8 °, 14.7 °, 16.5 ° और 18 ° पर विशिष्ट चोटियों की पहचान की है, ऐसी चोटियों को क्रमशः विमानों (002), (112), (022), (013), और (222) के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है।

प्रस्तावित सेल व्यवहार स्क्रीनिंग के लिए, आईसी 50 (एकाग्रता जहां जेडआईएफ -8 सेल विकास को50 % तक रोकता है) निर्धारित किया गया था। इसके लिए, कोशिकाओं को 0-950 μg / mL (चित्रा 2 A) से लेकर 48 घंटे तक की खुराक पर ZIF-8 के संपर्क में लाया गया था। उजागर कोशिकाओं की खुराक-प्रतिक्रिया ग्राफ चित्रा 2 बी में प्रदर्शित किया गया है, जिसमें बाद में 35.7 μg / mL का IC50 दर्ज किया गया है। इसके अलावा, विश्लेषण ने जेडआईएफ -8 के संपर्क में आने पर कोशिकाओं की व्यवहार्यता में खुराक-निर्भर प्रवृत्ति का खुलासा किया।

आईसी50 का निर्धारण करने पर, ईसीआईएस विश्लेषण किया गया था। संक्षेप में, ईसीआईएस का उपयोग आईसी50 पर जेडआईएफ -8 एमओएफ के संपर्क में आने वाले बीईएएस -2 बी की वास्तविक समय स्क्रीनिंग रणनीति के रूप में किया गया था, साथ ही इस एकाग्रता के नीचे और ऊपर, अर्थात् 15.7 μg / mL (C1), 35.7 μg / mL (C2), 55.7 μg / mL (C3), और 75.7 μg / mL (C4) क्रमशः कोशिकाओं को कुल 72 घंटे की अवधि के लिए उजागर किया गया था। ईसीआईएस को शामिल करने की कल्पना वास्तविक समय में सेल कवरेज, आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता में परिवर्तन ों को निर्धारित करने में अंतर्दृष्टि की अनुमति देने के लिए की गई थी। ईसीआईएस परिणामों को प्रतिरोध में परिवर्तन और सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन में परिवर्तन के रूप में दर्ज किया गया था, अर्थात् अल्फा पैरामीटर42।

प्रतिरोध प्रवृत्तियों को चित्रा 3 ए में नियंत्रण (ब्लैक लाइन) (यानी, अनएक्सपोज़्ड कोशिकाओं) की तुलना में ZIF-8 के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के प्रोफाइल में परिवर्तन के रूप में प्रदर्शित किया गया है। विशेष रूप से, विश्लेषण से पता चला है कि सी 2-सी 4 खुराक के संपर्क में आने वाले सोने के इलेक्ट्रोड पर कोशिकाओं वाले कुओं ने ढांचे के सेल एक्सपोजर के तुरंत बाद प्रतिरोध में प्रारंभिक मामूली वृद्धि प्रदर्शित की (सभी नियंत्रण के सापेक्ष [यानी, अनएक्सपोज़्ड कोशिकाएं])। इन प्रारंभिक परिवर्तनों के बाद बाद में दर्ज प्रतिरोधों में तेज कमी आई, इस तरह की कमी एक्सपोजर से 6-8 घंटे के बीच प्रचलित थी (चित्रा 3 ए)। एक्सपोजर समय से 14-18 घंटे के बाद प्रतिरोध में पूर्ण हानि देखी गई। आईसी50 मान से नीचे की खुराक के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने प्रतिरोध प्रदर्शित किया, जैसे नियंत्रण कोशिकाओं वाले कुएं, जोखिम से लगभग 16-18 घंटे तक जब प्रतिरोध हानि दिखाई देती है। इसके अलावा, सेलुलर एक्सपोजर के दौरान, प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले कुओं के सिग्नल का एक निरंतर सिग्नल गड़बड़ी देखी गई थी। अल्फा पैरामीटर (चित्रा 3 बी) के विश्लेषण के दौरान ये गड़बड़ी बनी रही, इस विश्लेषण से पता चलता है कि उजागर कोशिकाएं प्रतिरोध के समान प्रोफाइल के साथ अपने सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन को बदलती हैं। इसके अलावा, इस तरह के परिवर्तन एक्सपोजर से समय और इस तरह के एक्सपोजर में उपयोग की जाने वाली खुराक पर निर्भर थे।

Figure 1
चित्र 1: एसईएम छवि और औसत मौलिक संरचना ZIF-8 कण। (A) ZIF-8 कणों की प्रतिनिधि SEM छवि। (बी) जेडआईएफ -8 कणों की औसत मौलिक संरचना (± मानक विचलन [एसडी] सलाखों)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सेल व्यवहार्यता। (ए) सेल उपचार योजनाबद्ध (Biorender.com के साथ बनाया गया)। (बी) 0-950 μg / mL की खुराक पर ZIF-8 कणों के संपर्क में आने वाली BEAS-2B कोशिकाओं की व्यवहार्यता; इस विश्लेषण का उपयोग आईसी50 (± एसडी बार; ***पी = 0.0001 और **** पी < 0.0001 नियंत्रण के सापेक्ष) को निर्धारित करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि सेलुलर प्रतिरोध और सेलुलर लगाव में परिवर्तन। (ए) आईसी50 सांद्रता के नीचे, ऊपर और ऊपर जेडआईएफ -8 कणों के संपर्क में आने वाली बीईएएस -2 बी कोशिकाओं का प्रतिनिधि सेलुलर प्रतिरोध। (बी) आईसी50 सांद्रता के नीचे और ऊपर जेडआईएफ -8 कणों के संपर्क में आने पर बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के सेलुलर अनुलग्नक (यानी, अल्फा पैरामीटर में परिवर्तन) में परिवर्तन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले विश्लेषण से पता चला है कि ईसीआईएस का उपयोग विश्लेषणों (यानी, कार्बन नैनोट्यूब35, ड्रग्स43, या नैनोक्ले16) के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, स्टुकल एट अल ने नैनोक्ले और उनके उपोत्पादों के संपर्क में आने वाली बीईएएस -2 बी कोशिकाओं की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए ईसीआईएस का उपयोग किया और पाया कि सेलुलर व्यवहार और लगावऐसी सामग्रियों की भौतिक रासायनिक विशेषताओं पर निर्भर थे। यहां, हमने एमओएफ के संपर्क में आने के जवाब में बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के संभावित परिवर्तनों को निर्धारित करने का प्रस्ताव दिया, इस प्रकार विट्रो में सेलुलर सिस्टम पर जेडआईएफ -8 के किसी भी हानिकारक प्रभाव को अलग करने के उद्देश्य से ज्ञान के शरीर में योगदान दिया, सभी उच्च-थ्रूपुट और वास्तविक समय के तरीके से।

विश्लेषण ने पहले फ्रेमवर्क गुणों के मूल्यांकन के लिए अनुमति दी ताकि इस प्रकार परीक्षण किए गए एमओएफ44 के भौतिक रासायनिक गुणों के लिए सेलुलर व्यवहार में परिवर्तन को सहसंबंधित करने में मदद मिल सके। विशेष रूप से, समान मौलिक संरचना के नियमित ज्यामिति के साथ एमओएफ के सेलुलर संपर्क में आने पर (ऊपर परिणाम देखें), विश्लेषण ने सेलुलर व्यवहार में परिवर्तन दिखाया, संभवतः फ्रेमवर्क के उत्थान और उनके प्रोफाइल सेलुलर गिरावट के परिणामस्वरूप। विशेष रूप से अपटेक के संदर्भ में, हाइड्रोफोबिक सामग्रियों पर विषाक्तता के पिछले विश्लेषण, जैसे कि इस ढांचे से पता चला है कि जब ऐसी सामग्री कोशिकाओं के संपर्क में आती है, तो उनका उत्थान उनके हाइड्रोफिलिक समकक्षों के उत्थान की तुलना में सेलुलर झिल्ली के लिए अधिक विघटनकारी होता है, संभवतः झिल्ली के संरचनात्मक बाइलेयर16 से लिपिड को हटाने की उनकी क्षमता के कारण। 45 उनके सेलुलर स्थानांतरण के दौरान इस प्रकार झिल्ली की शिथिलता या प्लाज्मा झिल्ली गड़बड़ी46,47 हो जाती है। विशेष रूप से, लिपिड हटाने से झिल्ली अखंडता, सेल सिग्नलिंग48 में परिवर्तन और सेल फ़ंक्शन प्रभावों के नकारात्मक पक्ष के साथ सेलुलर अपटेक49 में वृद्धि देखी गई। उदाहरण के लिए, फार्कल एट अल ने प्रदर्शित किया कि एक हाइड्रोफोबिक टीआईओ2 नैनोमटेरियल में उजागर वायुकोशीय मैक्रोफेज50 में अपने हाइड्रोफिलिक समकक्ष की तुलना में साइटोटोक्सिक प्रभाव में वृद्धि हुई थी। इसके अलावा, वैगनर एट अल ने प्रदर्शित किया कि हाइड्रोफिलिक एमआईएल -16016 की तुलना में हाइड्रोफोबिक जेडआईएफ -8 ने बीईएएस -2 बी कोशिकाओं में अधिक व्यवधान पैदा किया।

सेल व्यवहार में दर्ज परिवर्तन संभवतः सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन26 और / या सेल व्यवहार्यता में गड़बड़ी और चयनित ढांचे के सेल एक्सपोजर के परिणामस्वरूप इलेक्ट्रोड पर प्रसार16 के कारण हैं। उदाहरण के लिए, वैगनर एट अल ने नैनोक्ले के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं में समान मापदंडों का मूल्यांकन किया। लेखकों ने पाया कि 72 घंटे के प्रयोगों के दौरान सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन में पूर्ण हानि देखी गई थी। इसके अलावा, लेखकों ने सेल व्यवहार्यता और प्रसार पर एक समय-निर्भर प्रभाव का प्रदर्शन किया जब बीईएएस -2 बी को उनके चयनित नैनोक्ले26 के संपर्क में लाया गया। जबकि यहां परीक्षण किए जा रहे कण एमओएफ हैं, नैनोक्ले के लिए देखे गए प्रभावों के साथ संभावित विस्तारित संबंध संभव है, क्योंकि इन कणों की कुछ भौतिक रासायनिक विशेषताएं (अर्थात् आकार, हाइड्रोफोबिसिटी और संरचना) एमओएफ के समान हैं। इसके अलावा, स्टुकेल एट अल ने समय और उपचार-निर्भर सेलुलर व्यवहार का भी प्रदर्शन किया जब नैनोक्ले को अमर बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के संपर्क में लाया गया था। दूसरों ने प्रदर्शित किया है कि ZIF-8, 100 μg / mL की खुराक पर, BEAS-2B कोशिकाओं को सेल मोनोलेयर और सेल व्यवहार्यता में पूर्ण नुकसान का कारण बनता है, संभवतः सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन16 में परिवर्तन के कारण। हालांकि, यह ध्यान दिया जाता है कि इस तरह के अध्ययनों में, जेडआईएफ -8 कणों को विभिन्न संश्लेषण स्थितियों (यानी, इस अध्ययन में उपयोग किए गए 10 मिनट बनाम 24 घंटे) के तहत प्राप्त किया गया था, इस तरह की संश्लेषण स्थितियों के परिणामस्वरूप बाद में पिछले निष्कर्षों का समर्थन करने के लिए ढांचे के विभिन्न आकार / आकृति विज्ञान हुए। इससे पता चलता है कि कण संश्लेषण के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रतिक्रिया समय6, तापमान2, और विलायक44 उनके आकार, आकार और संरचना प्रोफाइल को प्रभावित करते हैं, और बाद में उजागर कोशिकाओं में अंतर प्रभाव और व्यवहार का कारण बनते हैं।

विश्लेषण से यह भी पता चला है कि आईसी50 मूल्य से नीचे जेडआईएफ -8 खुराक के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने नियंत्रण के समान प्रतिरोध प्रदर्शित किए, संभवतः क्योंकि ऐसी खुराक उन स्थितियों और समय सीमा में ईसीआईएस-अवलोकन योग्य सेल परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त महत्वपूर्ण नहीं थीं। हालांकि, आईसी50 से ऊपर की खुराक पर, सेलुलर प्रतिरोध में एक पूर्ण हानि देखी गई और एक्सपोजर के बाद केवल कुछ घंटों के भीतर, सेल व्यवहार्यता में परिवर्तन और सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन16 (चित्रा 3 ए) में प्रेरित संभावित परिवर्तनों के कारण सबसे अधिक संभावना है। ये दावे पिछले अध्ययनों द्वारा समर्थित हैं जो दिखाते हैं कि गैर-व्यवहार्य कोशिकाएं अपना आकार बदलती हैं और सब्सट्रेट्स से अलग हो जाती हैं। उदाहरण के लिए, वर्मा एट अल ने मानव वायुकोशीय उपकला कोशिका लाइन (ए 549) में नैनोक्ले की साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन करने के लिए एक वास्तविक समय प्रतिबाधा संवेदन तकनीक का उपयोग किया। यह दिखाया गया था कि प्लेटलेट-प्रकार के नैनोक्ले ने ट्यूबलर प्रकार नैनोक्ले51 की तुलना में अलग और विकृत कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि का कारण बना। इसके अलावा, जिओ एट अल ने प्रदर्शित किया कि कल्चर माध्यम से पानी, बाह्य आयनों और साइटोटोक्सिक रसायनों की आमद के कारण, कैडमियम क्लोराइड के संपर्क में आने पर फाइब्रोब्लास्टिक वी 79 कोशिकाओं के साइटोस्केलेटन से समझौता किया गया था। सेल साइटोस्केलेटन में परिवर्तन से सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन का नुकसान हुआ। इसके अलावा, जब बेंजालकोनियम क्लोराइड को वी 79 कोशिकाओं के संपर्क में लाया गया था, तो सेलुलर झिल्ली को नुकसान के कारण सेलुलर प्रतिरोध में उल्लेखनीय कमी आईथी।

इसके अलावा, प्रतिरोध में परिवर्तन ZIF-8 की भौतिक रासायनिक विशेषताओं के लिए सेल प्रतिक्रियाओं के कारण हो सकता है। विशेष रूप से, ZIF-8 एक हाइड्रोफोबिक फ्रेमवर्क है; पिछले विश्लेषण से पता चला है कि हाइड्रोफोबिसिटीविषाक्तता में वृद्धि का कारण बन सकती है। जेडएन जैसे धातु आयनों को पहले जेडआर और एफई1 जैसी अन्य धातुओं की तुलना में विषाक्तता की उच्च डिग्री को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, संभवतः उच्च सेलुलर मृत्यु में योगदान देता है।

यह आगे दिखाया गया कि सभी कोशिकाओं ने एक्सपोजर के ठीक बाद प्रतिरोध में प्रारंभिक कमी दर्ज की, इसके बाद बाद की वृद्धि हुई। एल्दावुद एट अल ने इसी तरह के प्रभाव ों का प्रदर्शन किया जब एसडब्ल्यूसीएनटी को बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के संपर्क में लाया गया था। लेखकों ने सेलुलर प्रतिरोध में वृद्धि की व्याख्या बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के कारण सामग्री के संपर्क के कारण होने वाली गड़बड़ी पर काबू पाने और बाद में इलेक्ट्रोड बहाव28 को समाप्त करते हुएअपनी अखंडता को पुनः प्राप्त करने के कारण की, इस प्रकार डेटा विश्लेषण की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए (ईसीआईएस हैंडबुक देखें)।

भले ही इस अध्ययन से पता चला है कि ईसीआईएस सेल व्यवहार स्क्रीनिंग में उपयोग करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है, विशेष रूप से उच्च-थ्रूपुट सुविधा के कारण, यह अनुशंसा की जाती है कि तकनीक एकल समय बिंदु परख को प्रतिस्थापित नहीं करती है जब किसी सामग्री के हानिकारक मूल्यांकन की पूरी तस्वीर वांछित होती है। विशेष रूप से, एकल बिंदु परख आगे उनके आनुवंशिक स्तर 45,53 पर सेल परिवर्तन के मूल्यांकन की अनुमति दे सकती है, जैसा कि एल्दावुड एट अल द्वारा दिखाया गया है, उदाहरण के लिए नैनोडायमंड के संपर्क में आने वाली बीईएएस -2 बी कोशिकाओं के लिए और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस)45 के माध्यम से।   यू एट अल, ने मानव बृहदान्त्र कैंसर कोशिकाओं (HCT0116) का मूल्यांकन करने के लिए एफएसीएस का भी उपयोग किया, जो हाइलूरोनिक एसिड-संशोधित मेथोडस सिलिका नैनोकणों (एचए-एमएसएन) 54 के संपर्क में थे।

प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि परिवर्तन का मार्ग एमओएफ की भौतिक रासायनिक विशेषताओं पर निर्भर है, साथ ही एक्सपोज़र में उपयोग किए जाने वाले ऐसे ढांचे के समय और खुराक पर भी निर्भर है। यहां वर्णित परिणाम और विधियां सेलुलर प्रोफाइल में परिवर्तन को समझने में वास्तविक समय माप और उनके फायदे के महत्व पर जोर देती हैं। विषाक्तता के तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए इन्हें संभावित रूप से अतिरिक्त जैव रासायनिक परख ों के साथ पूरक किया जा सकता है, इस प्रकार एमओएफ की सुरक्षित-दर-डिजाइन रणनीतियों का नेतृत्व किया जा सकता है जिनका सेल व्यवहार पर कोई हानिकारक प्रभाव नहीं पड़ता है, जिसे सेल अटैचमेंट, सेल-सेल इंटरैक्शन या सेल-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के रूप में दर्ज किया जाता है।

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Disclosures

लेखक ों ने इस काम में हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (एनआईजीएमएस) टी 32 कार्यक्रम (टी 32 GM133369) और नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ 1454230) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इसके अतिरिक्त, डब्ल्यूवीयू साझा अनुसंधान सुविधाएं और एप्लाइड बायोफिज़िक्स सहायता और समर्थन स्वीकार किए जाते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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References

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