Metoder för elektroporering och transformationsbekräftelse i Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
Här presenterar vi protokoll för att arbeta med Limosilactobacillus reuteri DSM20016, som beskriver tillväxt, plasmidtransformation, koloni-PCR, fluorescerande reporterproteinmätning och begränsad plasmid mini-prep, samt vanliga problem och felsökning. Dessa protokoll tillåter mätning av rapportproteiner i DSM20016, eller bekräftelse via koloni-PCR om ingen rapportör är inblandad.
Abstract
Lactobacillus var ett otroligt stort, varierat släkte av bakterier som omfattade 261 arter, varav flera var kommensala stammar med potential att användas som ett chassi för syntetiska biologiska strävanden inom mag-tarmkanalen. Den stora fenotypiska och genotypiska variationen som observerats inom släktet ledde till en ny omklassificering och införandet av 23 nya släkten.
På grund av bredden av variationer inom de gamla släktena kanske protokoll som visas i en medlem inte fungerar som annonserat med andra medlemmar. Brist på centraliserad information om hur man exakt manipulerar specifika stammar har lett till en rad ad hoc-metoder , ofta anpassade från andra bakteriefamiljer. Detta kan komplicera saker för forskare som börjar i fältet, som kanske inte vet vilken information som gäller eller inte gäller för deras valda stam.
I det här dokumentet strävar vi efter att centralisera en uppsättning protokoll med påvisad framgång, särskilt i Limosilactobacillus reuteri-stambeteckningen F275 (andra samlingsnummer: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), tillsammans med felsökningsråd och vanliga problem som man kan stöta på. Dessa protokoll bör göra det möjligt för en forskare med liten eller ingen erfarenhet av att arbeta med L. reuteri DSM20016 att omvandla en plasmid, bekräfta transformation och mäta systemåterkoppling i en plattläsare via ett reporterprotein.
Introduction
Släktet Lactobacillus klassificerades historiskt som grampositiva, stavformade, icke-sporbildande, antingen fakultativa anaerober eller mikroaerofiler som bryter ner socker för att främst producera mjölksyra1. Dessa lösa kriterier ledde till att Lactobacillus var, fenotypiskt och genotypiskt, ett extremt varierat släkte. Denna breda kategorisering resulterade i att släktet omklassificerades och introducerade 23 nya släkten 20202.
Det gamla, bredare släktet inkluderade stora kommensala och probiotiska arter som allmänt betraktas som säkra (GRAS) för konsumtion3. Lactobacillaceae-familjen upprätthåller en allmän uppfattning om att vara “goda bakterier” på grund av många rapporterade hälsofördelar som skänkts via konsumtion av olika stammar 4,5,6,7. Den lätthet med vilken de kan navigera i mag-tarmkanalen8 och deras offentliga acceptans kombineras för att positionera Lactobacillaceae-stammar som starka kandidater som chassiorganismer för intagbara medicinska, terapeutiska eller diagnostiska tillämpningar.
Det stora antalet egenskaper inom familjen Lactobacillaceae har lett till en situation där det inte finns någon de facto-stam av modellorganismer. Forskargrupper har tenderat att välja arter med de egenskaper som är mest relevanta för deras specifika mål. (Till exempel, mejeri jäsning labs kan välja L. lactis; studier av vegetabilisk jäsning kan välja L. plantarum; forskning om probiotika kan fokusera på L. acidophilus; och så vidare.)
Samma breda spektrum av egenskaper över arter har lett till en ackumulering av protokoll och procedurer som kan fungera bra för en delmängd av Lactobacillaceae-familjen , men kräver optimering för att fungera effektivt (eller kanske för att fungera alls) i andra9. Detta behov av optimering mellan familjemedlemmar och även inom medlemmar av samma art kan frustrera okända forskares ansträngningar. Protokoll som publiceras i metodsektionerna i papper kan också innehålla sina egna modifieringar10, vilket leder till fragmenterade, decentraliserade protokollsamlingar.
L. reuteri anses vara ett allmänt ryggradsdjur kommensal, som finns konsekvent i däggdjur, fågel11 och fisk12 gastrointestinala (GI) kanaler. L. reuteri-understammar är ofta genetiskt specialiserade, via slemadhesionsproteinanpassning, för att mer permanent kolonisera specifika inhemska värdar 8,11,13. GI-tarmkanalen Limosilactobacillus arter kan isoleras i värdar utanför sin inhemska värd, men tenderar mer mot en övergående natur8.
På grund av human-host specialisering, L. reuteri DSM20016 positionerar sig mycket bra som ett chassi för diagnostiska eller terapeutiska tillämpningar vid vilken punkt som helst i den mänskliga mag-tarmkanalen, och stammen DSM20016 kan ge ett längre effektfönster för interventioner jämfört med mer övergående stammar.
I detta dokument beskriver vi en serie protokoll med påvisad effektivitet i Limosilactobacillus reuteri (stambeteckning: F275; andra insamlingsnummer: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), tillsammans med centraliserad information om stammen från andra källor för att hjälpa till med molekylära och systembiologiska applikationer. Förfaranden som anges här bör göra det möjligt för en forskare utan tidigare erfarenhet att odla L. reuteri, skapa elektrokompetenta bestånd, välja transformerade kolonier, bekräfta transformation via kolonipolymeraskedjereaktion (PCR) och mäta designat systemsvar via fluorescerande rapportproteiner.
Vi noterar att relaterade protokoll har täckt CRISPR-Cas9-assisterad ssDNA-genomrekombinering i L. reuteri (stam: ATCC-PTA-6475)14 och CRSIPR-Cas9 nickasassisterad genomredigering i flera icke-L. reuteri, Lactobacillaceae-familjefläckar 15,16; Dessa tar dock inte upp L. reuteri DSM20016 stam som är vårt fokus här.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiska steget för omvandlingen av L. reuteri DSM20016 är genereringen av anaeroba tillväxtförhållanden efter att transformationer har pläterats; Kolonier som erhållits under aeroba förhållanden är endast mycket tillfälliga och misslyckas i allmänhet med att växa när de inokuleras i MRS-buljong. Plätering av hela återhämtningsvolymen bör också praktiseras för att maximera sannolikheten för kolonitillväxt. Även med dessa två kritiska steg är omvandlingseffektiviteten fortfarande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppskattar verkligen de värdefulla råd som ges av professor J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), vars vägledning om att arbeta med L. reuteri ATCC PTA 6475 gav en grund för de metoder som beskrivs här.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O’Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
