Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Metoder för elektroporering och transformationsbekräftelse i Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65463
Automatic Translation
1, 1
1University of Toronto Mississauga

Summary

Här presenterar vi protokoll för att arbeta med Limosilactobacillus reuteri DSM20016, som beskriver tillväxt, plasmidtransformation, koloni-PCR, fluorescerande reporterproteinmätning och begränsad plasmid mini-prep, samt vanliga problem och felsökning. Dessa protokoll tillåter mätning av rapportproteiner i DSM20016, eller bekräftelse via koloni-PCR om ingen rapportör är inblandad.

Abstract

Lactobacillus var ett otroligt stort, varierat släkte av bakterier som omfattade 261 arter, varav flera var kommensala stammar med potential att användas som ett chassi för syntetiska biologiska strävanden inom mag-tarmkanalen. Den stora fenotypiska och genotypiska variationen som observerats inom släktet ledde till en ny omklassificering och införandet av 23 nya släkten.

På grund av bredden av variationer inom de gamla släktena kanske protokoll som visas i en medlem inte fungerar som annonserat med andra medlemmar. Brist på centraliserad information om hur man exakt manipulerar specifika stammar har lett till en rad ad hoc-metoder , ofta anpassade från andra bakteriefamiljer. Detta kan komplicera saker för forskare som börjar i fältet, som kanske inte vet vilken information som gäller eller inte gäller för deras valda stam.

I det här dokumentet strävar vi efter att centralisera en uppsättning protokoll med påvisad framgång, särskilt i Limosilactobacillus reuteri-stambeteckningen F275 (andra samlingsnummer: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), tillsammans med felsökningsråd och vanliga problem som man kan stöta på. Dessa protokoll bör göra det möjligt för en forskare med liten eller ingen erfarenhet av att arbeta med L. reuteri DSM20016 att omvandla en plasmid, bekräfta transformation och mäta systemåterkoppling i en plattläsare via ett reporterprotein.

Introduction

Släktet Lactobacillus klassificerades historiskt som grampositiva, stavformade, icke-sporbildande, antingen fakultativa anaerober eller mikroaerofiler som bryter ner socker för att främst producera mjölksyra1. Dessa lösa kriterier ledde till att Lactobacillus var, fenotypiskt och genotypiskt, ett extremt varierat släkte. Denna breda kategorisering resulterade i att släktet omklassificerades och introducerade 23 nya släkten 20202.

Det gamla, bredare släktet inkluderade stora kommensala och probiotiska arter som allmänt betraktas som säkra (GRAS) för konsumtion3. Lactobacillaceae-familjen upprätthåller en allmän uppfattning om att vara "goda bakterier" på grund av många rapporterade hälsofördelar som skänkts via konsumtion av olika stammar 4,5,6,7. Den lätthet med vilken de kan navigera i mag-tarmkanalen8 och deras offentliga acceptans kombineras för att positionera Lactobacillaceae-stammar som starka kandidater som chassiorganismer för intagbara medicinska, terapeutiska eller diagnostiska tillämpningar.

Det stora antalet egenskaper inom familjen Lactobacillaceae har lett till en situation där det inte finns någon de facto-stam av modellorganismer. Forskargrupper har tenderat att välja arter med de egenskaper som är mest relevanta för deras specifika mål. (Till exempel, mejeri jäsning labs kan välja L. lactis; studier av vegetabilisk jäsning kan välja L. plantarum; forskning om probiotika kan fokusera på L. acidophilus; och så vidare.)

Samma breda spektrum av egenskaper över arter har lett till en ackumulering av protokoll och procedurer som kan fungera bra för en delmängd av Lactobacillaceae-familjen , men kräver optimering för att fungera effektivt (eller kanske för att fungera alls) i andra9. Detta behov av optimering mellan familjemedlemmar och även inom medlemmar av samma art kan frustrera okända forskares ansträngningar. Protokoll som publiceras i metodsektionerna i papper kan också innehålla sina egna modifieringar10, vilket leder till fragmenterade, decentraliserade protokollsamlingar.

L. reuteri anses vara ett allmänt ryggradsdjur kommensal, som finns konsekvent i däggdjur, fågel11 och fisk12 gastrointestinala (GI) kanaler. L. reuteri-understammar är ofta genetiskt specialiserade, via slemadhesionsproteinanpassning, för att mer permanent kolonisera specifika inhemska värdar 8,11,13. GI-tarmkanalen Limosilactobacillus arter kan isoleras i värdar utanför sin inhemska värd, men tenderar mer mot en övergående natur8.

På grund av human-host specialisering, L. reuteri DSM20016 positionerar sig mycket bra som ett chassi för diagnostiska eller terapeutiska tillämpningar vid vilken punkt som helst i den mänskliga mag-tarmkanalen, och stammen DSM20016 kan ge ett längre effektfönster för interventioner jämfört med mer övergående stammar.

I detta dokument beskriver vi en serie protokoll med påvisad effektivitet i Limosilactobacillus reuteri (stambeteckning: F275; andra insamlingsnummer: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), tillsammans med centraliserad information om stammen från andra källor för att hjälpa till med molekylära och systembiologiska applikationer. Förfaranden som anges här bör göra det möjligt för en forskare utan tidigare erfarenhet att odla L. reuteri, skapa elektrokompetenta bestånd, välja transformerade kolonier, bekräfta transformation via kolonipolymeraskedjereaktion (PCR) och mäta designat systemsvar via fluorescerande rapportproteiner.

Vi noterar att relaterade protokoll har täckt CRISPR-Cas9-assisterad ssDNA-genomrekombinering i L. reuteri (stam: ATCC-PTA-6475)14 och CRSIPR-Cas9 nickasassisterad genomredigering i flera icke-L. reuteri, Lactobacillaceae-familjefläckar 15,16; Dessa tar dock inte upp L. reuteri DSM20016 stam som är vårt fokus här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av L. reuteri DSM20016 elektrokompetenta celler

OBS: Detta är baserat på ett protokoll av Berthier et al.17, med centrifugeringshastigheter informerade av Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. I ett 50 ml centrifugrör, inokulera L. reuteri från glycerolstam i 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS) buljong. Inkubera aerobt över natten vid 37 °C i en statisk inkubator.
  2. Nästa morgon, inokulera 4 ml av nattkulturen i 200 ml MRS-buljong (1:50 utspädning).
  3. Låt växa aerobt i en statisk 37 ° C inkubator tills 600 nm optisk densitet (OD600) når 0,5-0,85; Detta bör ta ungefär 2-3 timmar.
  4. Så snart ett lämpligt OD600-värde har uppnåtts, dekantera mediet i 50 ml centrifugrör och placera på is medan du balanserar rören.
  5. Centrifugera i 5 minuter vid 5 000 x g i en förkyld centrifug på 4 °C.
  6. Kassera supernatanten, suspendera varje pellet igen i 50 ml förkyld (0 °C till 4 °C) ddH2Ooch centrifugera igen med samma inställningar som föregående steg. Håll cellerna på is så mycket som möjligt.
  7. Upprepa steg 1.6.
  8. Återsuspendera varje pellet i 25 ml ddH2O: 0,5 M sackaros, 10% glycerol. Centrifugera vid 5 000 x g vid 4 °C i 10 minuter. Kassera supernatanten och lägg tillbaka cellerna på is.
  9. Resuspendera alla pellets i samma 2 ml ddH2O: 0,5 M sackaros, 10% glycerol.
  10. Alikvot i portioner 50–100–100 μl i förkylda mikrocentrifugrör. förvaras vid -80 °C för senare användning.

2. Elektroporering av L. reuteri

OBS: Undvik pipettering så mycket som möjligt i följande steg. Införande av en kontrollelektroporering, utan tillsats av plasmid, rekommenderas för att säkerställa att antibiotikavalet är tillräckligt.

  1. Ta en hel elektrokompetent L. reuteri aliquot och tina den på is.
  2. Blanda försiktigt 5 μl till 10 μl plasmid (slutlig plasmidkoncentration >6 nM) i den tinade alikvoten och undvik pipettering så mycket som möjligt.
  3. Överför till en iskyld elektroporeringskyvett med 1 mm mellanrum.
  4. Elektroporat vid 1,25 kV, 400 Ω och 25 μF.
  5. Tillsätt 1 ml rumstemperatur (RT) MRS-buljong och blanda genom att vända kyvetten en eller två gånger.
  6. Placera kyvetter i en statisk inkubator vid 37 °C i 2,5-3 timmar för att möjliggöra återhämtning.
  7. Platta hela mängden på flera MRS-agarplattor med lämpligt val.
  8. Placera plattorna i en helt lufttät behållare med ett litet tänt ljus ("värmeljus") och en anaerob atmosfärgenererande påse.
  9. Odla vid 37 °C i 2-3 dagar eller tills synliga kolonier finns.

3. Mätning av det syrabeständiga fluorescerande reporterproteinet mCherry2

  1. Välj alla kolonier som krävs för mätning och inokulera i en 96-brunns lagringsmikroplatta med 1,5 ml filtersteriliserad (icke-autoklaverad) MRS-buljong per brunn och ett lämpligt urval antibiotikum.
  2. Inkubera aerobt under 24 timmar över natten vid 37 °C utan att skaka.
    OBS: Denna förvaringsmikroplatta bör behållas för användning i avsnitt 4 (koloni-PCR).
  3. L. reuteri kommer att fällas ut ur media när den är i stationär fas; Återuppliva övernattningskulturen genom pipettering.
  4. Överför 200 μl till en platt platta med 96 brunnar med platta, klar botten, överför plattan till en plattläsare och mät OD och fluorescens för mCherry2 (excitation [Ex]: 589 nm; emission [Em]: 610 nm) eller andra relevanta rapportörer.

4. Bekräftelse av plasmidupptag via koloni-PCR

  1. Från förvaringsmikroplattan med 96 brunnar från sektion 3, överför 5 μL till ett PCR-rör.
    OBS: Om >5 minuter har gått, kan det vara nödvändigt att återsuspendera L. reuteri en andra gång.
  2. I en bärbar bänkmikrocentrifug, snurra ner tills pelleten kan ses (ungefär 2 min vid 2,000 x g), kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 20 μL 20 mM NaOH.
  3. Koka vid 95 °C i 5 min, virvel, och upprepa koka en andra gång.
  4. Kyl omedelbart proverna; försök att hålla proverna på is så mycket som möjligt i följande steg för att minska sannolikheten för mallnedbrytning och PCR-hämning.
  5. Snurra nedåt i en bärbar bänkmikrocentrifug vid 2 000 x g i 2 minuter tills cellskräpet är pelleterat, ta sedan 1 μL av supernatanten och späd till 99 μL iskall DNas- och RNase-fri ddH2O(100x utspädning).
  6. Använd 100x utspädning som mall-DNA i en standard PCR-reaktion med plasmidspecifika primrar. Inkludera en positiv kontroll med en plasmid härledd från E. coli mini-prep.
  7. Lägg tillbaka proverna på is och tillsätt ett lämpligt laddningsfärgämne vid en koncentration på 1x.
  8. Kör i 1% agarosgel i TAE-buffert (tris-acetat-etylendiamintetraättiksyra [EDTA]) vid 110 V i 30 minuter. Bild vid behov.

5. Mini-prep protokoll för L. reuteri , följt av PCR för att bekräfta plasmidnärvaro

OBS: Protokoll avsett att användas med mini-prep kit som anges i materialförteckningen.

  1. Inokulera L. reuteri i 10 ml MRS-buljong innehållande ett lämpligt antibiotikum och inkubera över natten aerobt vid 37 °C i en statisk inkubator.
  2. Centrifugera vid 5 000 x g i 10 minuter i en förkyld centrifug på 4 °C.
  3. Tvätta pelleten i 2 ml standard P1-buffert (medföljer satsen) för att negera surhet som kan störa senare steg, centrifugera med samma inställning som tidigare beskrivits och kassera supernatanten.
  4. Återsuspendera pelleten i 250 μl modifierad P1-buffert innehållande 10 mg/ml lysozym och 100 E/ml mutanolysin för att lysera bakterieceller. Inkubera i 1-2 timmar vid 37 °C.
  5. Tillsätt 250 μl buffert P2, blanda genom att vända upp och ned fyra till sex gånger och inkubera vid rumstemperatur i högst 5 minuter.
  6. Tillsätt 350 μL buffert N3 (medföljer satsen) och vänd omedelbart fyra till sex gånger försiktigt för att blanda.
  7. Centrifugera vid 10 000 x g i 10 minuter.
  8. Överför så mycket supernatant som möjligt till en spinnkolonn och centrifugera vid 10 000 x g i 60 sekunder. Ignorera flödet igenom.
  9. Tvätta centrifugeringskolonnen med 500 μl buffert PB (medföljer satsen) och centrifugera vid 10 000 x g i 60 sekunder. Ignorera flödet igenom.
  10. Tvätta centrifugeringskolonnen med 750 μL buffert PE (medföljer satsen) och centrifugera vid 10 000 x g i 60 sekunder. Kassera flödet och centrifugera i 60 sekunder för att avlägsna eventuell kvarvarande buffert.
  11. Placera rotationskolonnen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Applicera 20-30 μL DNAse- och RNAse-friddH2Opå spinnkolonnens filter och låt verka i 1-2 minuter innan centrifugering vid 10 000 x g i 60 s.
  12. Utför en standard PCR-reaktion med plasmidspecifika primrar (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), med eluat som tillhandahåller mall-DNA. Inkludera en positiv kontroll med en plasmid härledd från E. coli mini-prep.
    OBS: PCR-inställningarna som används i denna studie är: 98 °C i 5 minuter, (98 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 45 s) 30 cykler, 72 °C i 2 min, 4 °C håll. Parametrarna är starkt beroende av det polymeras som används, fragmentlängd och exakta primrar som används av någon person som använder detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Effektiv omvandling
L. reuteri kräver ingen icke-metylerad plasmid av dcm/moder, vilket observerats för andra Lactobacillaceae19,20 (se figur 1). Elektroporering av L. reuteri DSM20016 med 10 μL av 8,5 kb plasmid-pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 theta-replikationsursprung) bör ge transformationseffektivitet på ungefär 80 kolonibildande enheter (CFU)/μg (fem till åtta kolonier per 200 μl pläterad), oavsett plasmidmetyleringstillståndet. Med selektiv härdning och retransformation är det möjligt att erhålla muterade L. reuteri-stammar med mycket större transformationseffektivitet21, observerade med pTRKH3_mCherry2 på ungefär 4 x 103 CFU/μg (200-250 kolonier per 200 μL pläterade), vilket möjliggör applikationer med högre genomströmning. Liknande resultat observerades också för reportern mTFP1. Transformationer utfördes också med pNZ123 (pSH71 rullande cirkelursprung), utan exogent konstitutivt rapportprotein, vilket resulterade i transformationseffektivitet på 3 x 104 CFU / μg DNA (kompletterande figur 1).

Figure 1
Figur 1: Elektroporeringseffektivitet. Totalt 10 nM pTRKH3_mTFP1 och 80 nM pTRKH3_mCherry2 plasmidlager erhölls från två källor: DH10β E. coli och dcm-/dam-metylasknockout E. coli. L. reuteri elektroporerades sedan med 10 μL av de två olika metyleringsmönsterplasmiderna och kolonierna räknades. Felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tillväxtförhållanden för omvandling
L. reuteri är aerotolerant och kan odlas i buljong och på agar under normala atmosfäriska förhållanden. Transformationsframgång är dock starkt beroende av genereringen av en anaerob tillväxtmiljö när den pläteras; Det är kanske den viktigaste förutsättningen för framgångsrik transformation. O2-läckor kan detekteras genom att inkludera en platta av icke-transformerad L. reuteri. Kolonimorfologi förändras märkbart i närvaro av syre (se figur 2); alternativt kan anaeroba indikatorer användas (se materialförteckning).

Figure 2
Figur 2: L. reuteri kolonimorfologi. Kolonier transformerade med den pTRKH3_mCherry2 plasmiden. (A) Underkorrekta låg-O2-förhållanden, kolonier verkar vita, ogenomskinliga, släta, runda, konvexa och glänsande. (B) Under partiella eller läckandeO2-förhållanden verkar kolonierna vita, ogenomskinliga, undulerade (vågiga), runda, umbonat (rundade/knöliga) och glänsande. (C) L. reuteri-kolonier utan plasmidomvandling under atmosfäriskaO2-nivåer. Kolonierna verkar antingen ogenomskinliga eller genomskinliga och antingen umbonat eller platta; De verkar alltid lobate, runda och torra. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Reporter proteinmätning
Vildtyp L. reuteri DSM20016 reporterproteinuttryck och tillväxt varierar mellan kolonier (se figur 3A), vilket gör exakta avdrag för systemaktivitet svåra. Det är möjligt att välja och bota korrekt transformerad vildtyp L. reuteri DSM20016; Retransformation kan ge upphov till stammar med mutationer som möjliggör större transformationseffektivitet. En stam som utvecklades via denna metod verkade mycket mer stabil när det gäller rapportproteinuttryck (se figur 3B). Det är tillrådligt att sådana mutationer söks via plasmidhärdning och retransformation innan arbete som kräver inställt proteinuttryck utförs.

Figure 3
Figur 3: Tillväxt, reporterfluorescens och koloni-PCR-resultat för transformerad L. reuteri. Båda experimenten använder pTRKH3_mCherry2 plasmid vid 80 nM. (A,B) Varje kolumn i vart och ett av de tre delområdena avser samma kolonis OD-värde, fluorescensvärde (Ex: 589 nm; Em: 610 nm) och PCR-resultat (fast block indikerar korrekt observerat band). (A) Alla kolonier från L. reuteri DSM20016 transformation plockade (kontrolltransformation = nollkolonier). Kolonierna inkuberas i filtrerad MRS-buljong i 24 timmar före mätning vid vinst 100. (B) Totalt 88 kolonier plockade från L. reuteri DSM20016-stammen utvalda för högre transformationseffektivitet, mer konsekvent rapportproteinproduktion och lägre PCR-hämning (kontrolltransformation = nollkolonier). Kolonier inkuberas i filtrerad MRS-buljong i 24 timmar före mätning vid vinst 200. Kontrollerna är i blått, C = icke-transformerad DSM20016 cellkontroll, M = filtrerad MRS-buljong endast mediekontroll och felstaplar anger standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Koloni PCR
Koloni-PCR bör inte användas som det enda sättet att härleda korrekt omvandling, eftersom de kan vara otillförlitliga även när proverna späds ut och förvaras kylda (se figur 4). Om no-plasmidkontrollen som ingår i transformationer uppvisar noll kolonier, innebär det att alla kolonier har plasmiden som bär antibiotikaresistens. Men om koloni-PCR krävs kan de optimerade förhållandena som anges här öka framgången avsevärt.

Figure 4
Figur 4: Koloni-PCR av transformerad L. reuteri. (A) L. reuteri DSM20016 kolonier screenades för positiva PCR-band; sex erhölls och inokulerades i färsk autoklaverad MRS-buljong. Prover på 5 μl som togs vid olika tidpunkter efter inokuleringen behandlades PCR igen vid de angivna utspädningsnivåerna. Färger i varje tids-/utspädningsruta indikerar framgången för PCR-återhämtningen: grön = korrekt observerat band; röd = inget band observerat. (B) Resultaten för en fast 100x utspädning visar att varierande beredningstemperatur resulterade i olika hastigheter av PCR-framgång: prover bereddes på is och PCR-ed omedelbart (89,77%), bereddes vid rumstemperatur och PCR-ed omedelbart (75%), eller bereddes vid RT och inkuberades sedan vid 37 °C i 30 minuter före PCR (27,27%). (C) (1) Åtta positiva 100x spädningsprov (R1-8) från RT-tillståndet. (2) Efter att ha lämnats vid RT i 48 timmar PCR-ed proverna en andra gång, vilket visade en frånvaro av banden vid ~ 1,1 kb; positiva och negativa kontroller (körfält +/-) är de högra körfälten i C (2). Stegen som användes var 1 kb plus DNA-stegen, listad i materialtabellen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

L. reuteri mini-prep
Mini-prep för L. reuteri är begränsad och endast avsedd som en alternativ metod för bekräftelse av plasmidtransformation. En tidigare publikation noterade att vissa stammar mer effektivt lyseras av mutanolysin22; dubbel lysozym-mutanolysin verkan visade sig vara den mest effektiva för L. reuteri DSM20016. Att köra mini-prep eluate genom en agarosgel resulterar i ett smet snarare än observerbara band. Efterföljande PCR bör dock ge förväntade bandstorlekar (se figur 5).

Figure 5
Figur 5: Agarosgelelektrofores av PCR- och mini-prep-produkter. Samma sex kolonier från figur 4A miniförbereddes med hjälp av protokollet i detta dokument. (Nedre raden) Mini-prep eluat visar ett smet. (Övre raden) Efter att PCR utfördes med eluanten som en DNA-mall observeras tydliga positiva band. Stegen som användes var 1 kb plus DNA-stegen, listad i materialtabellen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Transformationseffektivitet för L. reuteri DSM20016 med pNZ123-plasmid. Transformationer utförda med pNZ123 (pSH71 rullande cirkel ursprung), som inte bär något exogent konstitutivt reporterprotein. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 1: CAD-filer för anaeroba kammare. Blad 1: Grundritning; Blad 2: Långväggsritning; Blad 3: Liten väggritning; Blad 4: Översta ritning; Blad 5: Lockritning; Blad 6: Lås läppritning; Blad 7: Klämstångsritning; Blad 8: Ritning av klämplatta; Blad 9: Översikt över monteringen. Blad 10: Översikt med numrerade delar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiska steget för omvandlingen av L. reuteri DSM20016 är genereringen av anaeroba tillväxtförhållanden efter att transformationer har pläterats; Kolonier som erhållits under aeroba förhållanden är endast mycket tillfälliga och misslyckas i allmänhet med att växa när de inokuleras i MRS-buljong. Plätering av hela återhämtningsvolymen bör också praktiseras för att maximera sannolikheten för kolonitillväxt. Även med dessa två kritiska steg är omvandlingseffektiviteten fortfarande en begränsning för experiment, eftersom förväntade kolonier kan vara så låga som en eller två per platta under transformationer (se figur 1).

Kommersiella livsmedelsbehållare användes ursprungligen och befanns vara otillräckliga för konsekvent uteslutning av O2. CAD-filer för anaeroba kammare designade av universitetets maskinverkstad finns i Kompletterande fil 1. Eftersom dessa lådor ibland kan ha luftinfiltration genom små luckor i snickerier, rekommenderas det att fylla dem med vatten (oförseglat) för att kontrollera eventuella läckor före första användningen. Efterföljande kontroller är i allmänhet inte nödvändiga. Dessa lådor bör ha O 2 ersättningssystem snarare än O2 sekvestreringssystem, eftersom de inte har testats för trycksättning.

Medieproblem kan uppstå; autoklaverad MRS-buljong är selektiv men har mycket autofluorescerande egenskaper, vilket hindrar mätningen av lågfluorescerande avläsningar. Modifiering för att använda filtersteriliserad MRS-buljong förbättrar denna fråga, men är mindre selektiv. L. reuteri sänker mediets pH till cirka pH 4 efter 24 timmar (se figur 6), så mediet kräver buffring för att detektera syrakänslig GFP23. Vi ändrade detta protokoll för att använda mer syrabeständig mCherry2 istället och undvika detta problem.

Figure 6
Figur 6: pH över tid för L. reuteri i MRS-buljong. L. reuteri sänker DSM20016 pH över tiden (streckad linje); pKa-värdet indikerar det pH vid vilket rapportproteinfluorescensen skulle vara 50% av det maximala värdet på grund av surhet (horisontella linjer). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Varje reporterprotein har rapportörens effektivitet reducerad till 50% av den maximala fluorescensen vid olika tidpunkter på grund av deras syrakänslighet när de produceras inom allt surare L. reuteri (vertikala linjer). Klicka här för att se en större version av denna figur.

L. reuteri DSM20016 verkar hämma koloni PCR-ansträngningar, vilket allvarligt begränsar användbarheten av denna procedur. Så lite som 30 minuter vid 37 °C efter steg 4.3 kan öka PCR-felfrekvensen, medan 48 timmar vid RT resulterar i fullständigt PCR-fel (se figur 4B,C). Modifieringen för att späda ut proverna och hålla proverna på is hela tiden är avgörande för att öka kolonins PCR-framgång.

Mycket är fortfarande okänt om de interna funktionerna hos L. reuteri DSM20016. Transformationskontrollplattor utan tillsats av plasmid under elektroporering, som visar nollkolonier, bör innebära att alla kolonier som finns i plasmidtillståndet har plasmiden. Efterföljande koloni-PCR har dock visat sig inte på ett tillförlitligt sätt bekräfta plasmidupptag även med modifieringar. Detta kan bero på restriktionsendonukleaser som bryter ned PCR-DNA-fragment. Endonukleaser har påträffats hos andra Lactobacillaceae-arter och övervunnits genom användning av damm-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 har flera förmodade restriktions-modifieringsenzymer annoterade via beräkningsanalys24. Transformationseffektiviteten hos DSM20016 skulle potentiellt kunna höjas ytterligare om dess restriktionsmodifieringsställen (RM) kunde karakteriseras och undvikas. Ytterligare undersökningar behövs.

Den modifierade elektroporeringsmetoden som beskrivs i denna uppsats erbjuder ett mindre komplext, modernare alternativ till en metod som tidigare beskrivits för L. reuteri DSM20016 av Ahrne et al.25. I denna uppsats undersöks viktiga bestämmelser från Ahrne m.fl. om krav på bestämning av damm-/dcm-metylering för plasmidupptag, vilka inte har bekräftats. Transformationsmetoden som beskrivs i detta dokument betonar också det kritiska anaeroba tillväxtkravet efter plätering, som inte uttryckligen förmedlas av Ahrne et al.

Vissa metoder och tillvägagångssätt som anges här kan användas i framtida applikationer för att hjälpa andra Lactobacillaceae-familjemanipulationsförsök , särskilt: inkludering av transformationskontrollplattor, användning av den syrafasta reportern mCherry2, krav på PCR-temperatur för kolonier och mini-prep mutanolysininkludering. Vissa kan dock fortfarande behöva modifieras för att fungera optimalt i andra stammar.

L. reuteri DSM20016 är av klinisk och jordbruksmässig betydelse på grund av dess position inte bara som ett generiskt ryggradsdjur kommensalt (med potentiell användning som tillsats i djurfoder), utan också som en av ett mycket litet antal stammar av Lactobacillaceae-familjen som är inneboende associerade med människans tarmmiljö8. Effektiv manipulation av denna mikrob kommer att öppna upp den som ett chassi för framtida leverans av nya terapier inom mag-tarmkanalen och icke-invasiv övervakning av inflammatoriska tillstånd. I denna artikel har dessa metoder uttryckligen sammanställts och demonstrerats kollektivt med modifieringar för, specifikt, den icke-modell L. reuteri stam DSM20016.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter föreligger.

Acknowledgments

Vi uppskattar verkligen de värdefulla råd som ges av professor J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), vars vägledning om att arbeta med L. reuteri ATCC PTA 6475 gav en grund för de metoder som beskrivs här.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder NEB N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes Thomas Scientific 1145J12
Agarose  BioShop AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) Beckman Allegra  N/A No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet Thermo Scientific OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system VWR 58017-984
Centrifuge tubes (50 mL) FroggaBio TB50-500
DNA gel x6 loading dye NEB B7024S
Electroporation cuvette Fisherbrand FB101
Erythromycin Millipore Sigma E5389-5G
Gel electroporation bath/dock VWR 76314-748
Glycerol  BioShop GLY001
Limosilactobacillus reuteri Leibniz Institute DSMZ DSM20016 Strain designation F275
Lysozyme BioShop LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) FroggaBio LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen) Qiagen 27106 slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated) Thermo Scientific CM0359B
Mutanolysin Millipore Sigma M9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma 1064691000
P100 Pipette Eppendorf 3123000047
P1000 Pipette Eppendorf 3123000063
P2.5 Pipette Eppendorf 3123000012
P20 Pipette Eppendorf 3123000039
P200 Pipette Eppendorf 3123000055
PCR tubes FroggaBio STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge Genlantis E200100
Petri dishes VWR 25384-088
PTC-150 Thermal Cycler MJ Research N/A No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified) Addgene 27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer Thermo Scientific 840-281700
Storage microplate Fisher Scientific 14-222-225
Sucrose BioShop SUC507
TAE Buffer 50x Thermo Scientific B49
Vortex VWR 58816-121 No longer in production
VWR 1500E incubator VWR N/A No longer in production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Tags

Bioteknik utgåva 196
Metoder för elektroporering och transformationsbekräftelse i <em>Limosilactobacillus reuteri</em> DSM20016
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duggan, A., McMillen, D. Methods for … More

Duggan, A., McMillen, D. Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016. J. Vis. Exp. (196), e65463, doi:10.3791/65463 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter