Summary
Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.
Abstract
Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l'uso come telaio per sforzi biologici sintetici all'interno del tratto gastrointestinale. L'ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all'interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all'introduzione di 23 nuovi generi.
A causa dell'ampiezza delle variazioni all'interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.
In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.
Introduction
Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico1. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 20202.
Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente considerate sicure (GRAS) per il consumo3. La famiglia delle Lactobacillaceae mantiene una percezione pubblica di essere "batteri buoni" a causa di molti benefici per la salute segnalati attraverso il consumo di vari ceppi 4,5,6,7. La facilità con cui possono navigare nel tratto gastrointestinale8 e la loro accettazione pubblica si combinano per posizionare i ceppi di Lactobacillaceae come candidati forti come organismi del telaio per applicazioni medicinali, terapeutiche o diagnostiche ingeribili.
L'ampia gamma di caratteristiche presenti all'interno della famiglia delle Lactobacillaceae ha portato ad una situazione in cui non esiste di fatto un ceppo modello-organismo; I gruppi di ricerca hanno teso a selezionare le specie con le proprietà più rilevanti per i loro obiettivi particolari. (Ad esempio, i laboratori di fermentazione lattiero-casearia potrebbero scegliere L. lactis; gli studi sulla fermentazione vegetale potrebbero selezionare L. plantarum; la ricerca sui probiotici potrebbe concentrarsi su L. acidophilus; e così via.)
Questa stessa vasta gamma di caratteristiche tra le specie ha portato a un accumulo di protocolli e procedure che possono funzionare bene per un sottogruppo della famiglia delle Lactobacillaceae , ma richiedono un'ottimizzazione per funzionare in modo efficiente (o forse per funzionare affatto) in altri9. Questa necessità di ottimizzazione tra i membri della famiglia e anche all'interno di membri della stessa specie può vanificare gli sforzi di ricercatori non familiari. I protocolli pubblicati nelle sezioni dei metodi dei documenti possono anche includere le proprie modifiche10, portando a raccolte di protocolli frammentate e decentralizzate.
L. reuteri è considerato un commensale ampiamente vertebrato, trovato costantemente nei tratti gastrointestinali (GI) di mammiferi, uccelli11 e pesci12. I sottoceppi di L. reuteri sono spesso geneticamente specializzati, attraverso l'adattamento delle proteine di adesione del muco, per colonizzare in modo più permanente specifici ospiti nativi 8,11,13. Le specie di Limosilactobacillus del tratto gastrointestinale possono essere isolate in ospiti al di fuori del loro ospite nativo, ma tendono più verso una natura transitoria8.
A causa della specializzazione uomo-ospite, L. reuteri DSM20016 si posiziona molto bene come telaio per applicazioni diagnostiche o terapeutiche in qualsiasi punto del tratto gastrointestinale umano e il ceppo DSM20016 potrebbe fornire una finestra di effetto più duratura per gli interventi rispetto a ceppi più transitori.
In questo articolo, delineiamo una serie di protocolli con efficacia dimostrata in Limosilactobacillus reuteri (designazione del ceppo: F275; altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a informazioni centralizzate sul ceppo da altre fonti per aiutare nelle applicazioni di biologia molecolare e dei sistemi. Le procedure qui descritte dovrebbero consentire a un ricercatore senza esperienza precedente di coltura di L. reuteri, creare stock elettrocompetenti, selezionare colonie trasformate, confermare la trasformazione tramite reazione a catena della polimerasi di colonia (PCR) e misurare la risposta del sistema progettato tramite proteine reporter fluorescenti.
Notiamo che i protocolli correlati hanno riguardato la ricombinazione del genoma ssDNA assistito da CRISPR-Cas9 in L. reuteri (ceppo: ATCC-PTA-6475)14 e l'editing del genoma assistito da nickase-CRSIPR-Cas9 in più non-L. reuteri, Lactobacillaceae famiglia colorazioni15,16; questi, tuttavia, non affrontano il ceppo di L. reuteri DSM20016 che è il nostro obiettivo qui.
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Protocol
1. Preparazione di L. reuteri DSM20016 cellule elettrocompetenti
NOTA: Questo si basa su un protocollo di Berthier et al.17, con velocità di centrifugazione informate da Rattanachaikunsopon et al.18.
- In una provetta da centrifuga da 50 ml, inoculare L. reuteri dal brodo di glicerolo in 6 ml di brodo di deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubare aerobicamente durante la notte a 37 °C in un incubatore statico.
- La mattina seguente, inoculare 4 ml di coltura notturna in 200 ml di brodo MRS (diluizione 1:50).
- Lasciare crescere aerobicamente in un incubatore statico a 37 °C fino a quando il valore di densità ottica di 600 nm (OD600) raggiunge 0,5-0,85; Questo dovrebbe richiedere circa 2-3 ore.
- Non appena viene raggiunto un valore OD600 adeguato, decantare il fluido in provette da centrifuga da 50 ml e metterlo su ghiaccio bilanciando i tubi.
- Centrifugare per 5 minuti a 5.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata a 4 °C.
- Scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 50 ml di ddH2O pre-raffreddato (da 0 °C a 4 °C) e centrifugare nuovamente con le stesse impostazioni del passaggio precedente. Mantenere le cellule sul ghiaccio il più possibile.
- Ripetere il passaggio 1.6.
- Risospendere ogni pellet in 25 ml di ddH2O: 0,5 M di saccarosio, 10% di glicerolo. Centrifugare a 5.000 x g a 4 °C per 10 min. Scartare il surnatante e rimettere le cellule sul ghiaccio.
- Risospendere tutti i pellet negli stessi 2 ml di ddH2O: 0,5 M saccarosio, 10% glicerolo.
- aliquota in porzioni da 50 μL a 100 μL in provette per microcentrifuga prerefrigerate; conservare a -80 °C per un uso successivo.
2. Elettroporazione di L. reuteri
NOTA: evitare il pipettaggio il più possibile nei passaggi seguenti. Si consiglia l'inclusione di un elettroporazione di controllo, senza aggiunta di plasmide, per garantire che la selezione antibiotica sia adeguata.
- Prendere un'intera aliquota elettrocompetente di L. reuteri e scongelarla sul ghiaccio.
- Mescolare delicatamente da 5 μL a 10 μL di plasmide (concentrazione plasmidica finale >6 nM) nell'aliquota scongelata, evitando il più possibile il pipettaggio.
- Trasferire in una cuvetta di elettroporazione raffreddata con ghiaccio da 1 mm.
- Elettroporate a 1,25 kV, 400 Ω e 25 μF.
- Aggiungere 1 mL di brodo MRS a temperatura ambiente (RT) e mescolare capovolgendo la cuvetta una o due volte.
- Posizionare le cuvette in un incubatore statico a 37 °C per 2,5-3 ore per consentire il recupero.
- Impiattare l'intera quantità su più piastre di agar MRS con la selezione appropriata.
- Posizionare i piatti all'interno di un contenitore completamente ermetico con una piccola candela accesa ("candeletta") e una bustina anaerobica generatrice di atmosfera.
- Crescere a 37 °C per 2-3 giorni o fino alla presenza di colonie visibili.
3. Misurazione della proteina reporter fluorescente resistente agli acidi mCherry2
- Prelevare eventuali colonie necessarie per la misurazione e inoculare in una micropiastra di stoccaggio a 96 pozzetti con 1,5 ml di brodo MRS sterilizzato con filtro (non sterilizzato) per pozzetto e un antibiotico di selezione appropriato.
- Incubare aerobicamente per 24 ore durante la notte a 37 °C senza agitare.
NOTA: Questa micropiastra di conservazione deve essere conservata per l'uso nella sezione 4 (PCR di colonia). - L. reuteri precipiterà fuori dai mezzi quando si trova nella fase stazionaria; Risospendere la coltura notturna tramite pipettaggio.
- Trasferire 200 μL in una piastra piatta, a fondo chiaro, a 96 pozzetti, trasferire la piastra su un lettore di piastre e misurare l'OD e la fluorescenza di mCherry2 (eccitazione [Ex]: 589 nm; emissione [Em]: 610 nm) o di altri reporter pertinenti.
4. Conferma dell'assorbimento del plasmide tramite PCR di colonia
- Dalla micropiastra di stoccaggio a 96 pozzetti della sezione 3, trasferire 5 μL in una provetta PCR.
NOTA: Se sono trascorsi >5 minuti, potrebbe essere necessario risospendere il L. reuteri una seconda volta. - In una microcentrifuga portatile da banco, ruotare verso il basso fino a quando il pellet può essere visto (circa 2 minuti a 2.000 x g), scartare il surnatante e risospendere il pellet in 20 μL di 20 mM NaOH.
- Far bollire a 95 °C per 5 minuti, vortice e ripetere l'ebollizione una seconda volta.
- Raffreddare immediatamente i campioni; cercare di mantenere i campioni sul ghiaccio il più possibile nei seguenti passaggi per ridurre la probabilità di degradazione del modello e inibizione della PCR.
- Girare in una microcentrifuga portatile da banco a 2.000 x g per 2 minuti fino a quando i detriti cellulari sono pellettati, quindi prendere 1 μL del surnatante e diluire in 99 μL di DDH2O senza DNasi e RNasi ghiacciato (diluizione 100x).
- Utilizzare la diluizione 100x come modello di DNA in una reazione PCR standard utilizzando primer plasmidi specifici. Includere un controllo positivo con un plasmide derivato dalla mini-preparazione di E. coli.
- Restituire i campioni sul ghiaccio e aggiungere un colorante di carico appropriato a una concentrazione 1x.
- Eseguire in gel di agarosio all'1% in tampone TAE (acido tris-acetato-etilendiamminotetraacetico [EDTA]) a 110 V per 30 minuti. Immagine se necessario.
5. Protocollo Mini-prep per L. reuteri , seguito da PCR per confermare la presenza di plasmidi
NOTA: Protocollo destinato all'uso con il kit mini-prep elencato nella tabella dei materiali.
- Inoculare L. reuteri in 10 mL di brodo MRS contenente un antibiotico appropriato e incubare aerobicamente per una notte a 37 °C in un incubatore statico.
- Centrifugare a 5.000 x g per 10 minuti in una centrifuga pre-raffreddata a 4 °C.
- Lavare il pellet in 2 ml di tampone P1 standard (incluso nel kit) per eliminare l'acidità che potrebbe interferire con i passaggi successivi, centrifugare con la stessa impostazione descritta in precedenza e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 250 μL di tampone P1 modificato contenente 10 mg/mL di lisozima e 100 U/mL di mutanolisina per lisare le cellule batteriche. Incubare per 1-2 h a 37 °C.
- Aggiungere 250 μL di tampone P2, mescolare capovolgendo da quattro a sei volte e incubare a RT per non più di 5 minuti.
- Aggiungere 350 μL di tampone N3 (incluso nel kit) e capovolgere immediatamente da quattro a sei volte delicatamente per mescolare.
- Centrifugare a 10.000 x g per 10 min.
- Trasferire quanto più surnatante possibile in una colonna di rotazione e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso attraverso.
- Lavare la colonna di centrifuga con 500 μL di tampone PB (incluso nel kit) e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso attraverso.
- Lavare la colonna di centrifuga con 750 μL di PE tampone (incluso nel kit) e centrifugare a 10.000 x g per 60 s. Scartare il flusso e centrifugare per 60 s per rimuovere eventuali residui di tampone.
- Posizionare la colonna di rotazione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Applicare 20-30 μL di ddH 2 O privo di DNAsi e RNAsi al filtro della colonna di spin e lasciare agire per1-2minuti, prima di centrifugare a 10.000 x g per 60 s.
- Eseguire una reazione PCR standard utilizzando primer plasmidi specifici (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), con eluato che fornisce il DNA modello. Includere un controllo positivo con un plasmide derivato dalla mini-preparazione di E. coli.
NOTA: Le impostazioni PCR utilizzate in questo studio sono: 98 °C per 5 min, (98 °C per 30 s, 55 °C per 30 s, 72 °C per 45 s) 30 cicli, 72 °C per 2 min, 4 °C hold. I parametri dipendono fortemente dalla polimerasi utilizzata, dalla lunghezza del frammento e dai primer esatti utilizzati da qualsiasi persona che utilizza questo protocollo.
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Representative Results
Efficienza di trasformazione
L. reuteri non richiede un plasmide dcm-/dam- non metilato, come osservato per altre Lactobacillaceae19,20 (vedere Figura 1). L'elettroporazione di L. reuteri DSM20016 con 10 μL del pTRKH3_mCherry2 plasmidico da 8,5 kb (origine della replicazione di pAMβ1 theta) dovrebbe fornire efficienze di trasformazione di circa 80 unità formanti colonie (CFU)/μg (da cinque a otto colonie per 200 μL placcati), indipendentemente dalla condizione di metilazione del plasmide. Con la polimerizzazione selettiva e la ritrasformazione, è possibile ottenere ceppi mutati di L. reuteri con efficienze di trasformazione molto maggiori21, osservate con pTRKH3_mCherry2 di circa 4 x 103 CFU/μg (200-250 colonie per 200 μL placcati), consentendo applicazioni a più alta produttività. Risultati simili sono stati osservati anche per il reporter mTFP1. Le trasformazioni sono state effettuate anche con pNZ123 (origine del rolling circle pSH71), che non trasporta alcuna proteina reporter costitutiva esogena, con conseguente efficienza di trasformazione di 3 x 104 CFU/μg DNA (Figura supplementare 1).
Figura 1: Efficienze di elettroporazione. I totali di 10 nM pTRKH3_mTFP1 e 80 nM pTRKH3_mCherry2 gli stock di plasmidi sono stati ottenuti da due fonti: DH10β E. coli e dcm-/dam-metilasi knockout E. coli. L. reuteri è stato quindi elettropolato con 10 μL dei due diversi plasmidi del modello di metilazione e delle colonie contate. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Condizioni di crescita della trasformazione
L. reuteri è aero-tollerante e può essere coltivato in brodo e su agar in condizioni atmosferiche normali. Tuttavia, il successo della trasformazione dipende fortemente dalla generazione di un ambiente di crescita anaerobica quando placcato; È forse la condizione più importante per il successo della trasformazione. Le perdite di O2 possono essere rilevate includendo una lastra di L. reuteri non trasformata. La morfologia della colonia cambia notevolmente in presenza di ossigeno (vedi Figura 2); in alternativa, possono essere utilizzati indicatori anaerobici (vedi Tabella dei materiali).
Figura 2: Morfologia della colonia di L. reuteri. Colonie trasformate con il plasmide pTRKH3_mCherry2. (A) In condizioni di basso contenuto di O2 , le colonie appaiono bianche, opache, lisce, rotonde, convesse e lucide. (B) In condizioni di O2 parziale o permeabile, le colonie appaiono bianche, opache, ondulate (ondulate), rotonde, umbonate (arrotondate/nodose) e lucide. (C) Colonie di L. reuteri senza trasformazione plasmidica sotto i livelli atmosferici di O2 . Le colonie appaiono opache o traslucide e umbonate o piatte; appaiono sempre lobati, rotondi e asciutti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Misurazione delle proteine Reporter
L'espressione e la crescita delle proteine selvatiche di L. reuteri DSM20016 reporter variano tra le colonie (vedi Figura 3A), rendendo difficili deduzioni accurate sull'attività del sistema. E' possibile selezionare e curare correttamente trasformato il wild-type L. reuteri DSM20016; La ritrasformazione può dare origine a ceppi con mutazioni che consentono una maggiore efficienza di trasformazione. Un ceppo sviluppato con questo metodo è apparso molto più stabile in termini di espressione della proteina reporter (vedi Figura 3B). È consigliabile che tali mutazioni siano ricercate, attraverso la polimerizzazione e la ritrasformazione dei plasmidi, prima di svolgere lavori che richiedono un'espressione proteica sintonizzata.
Figura 3: Crescita, fluorescenza reporter e risultati della PCR delle colonie per L. reuteri trasformato. Entrambi gli esperimenti utilizzano pTRKH3_mCherry2 plasmide a 80 nM. (A,B) Ogni colonna in ciascuno dei tre sotto-plot si riferisce al valore OD della stessa colonia, il valore di fluorescenza (Es: 589 nm; Em: 610 nm) e risultato della PCR (il blocco solido indica la banda corretta osservata). (A) Tutte le colonie di L. reuteri DSM20016 trasformazione scelta (trasformazione di controllo = zero colonie). Colonie incubate in brodo MRS filtrato per 24 ore prima della misurazione al guadagno 100. (B) Un totale di 88 colonie prelevate dal ceppo di L. reuteri DSM20016 selezionato per una maggiore efficienza di trasformazione, una produzione di proteine reporter più coerente e una minore inibizione della PCR (trasformazione di controllo = zero colonie). Colonie incubate in brodo MRS filtrato per 24 ore prima della misurazione al guadagno 200. I controlli sono in blu, C = controllo a celle DSM20016 non trasformate, M = controllo del supporto solo brodo MRS filtrato e le barre di errore indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
PCR di colonia
La PCR delle colonie non deve essere utilizzata come unico mezzo per dedurre la corretta trasformazione, in quanto può essere inaffidabile anche quando i campioni vengono diluiti e mantenuti refrigerati (vedere Figura 4). Se il controllo no-plasmidico incluso nelle trasformazioni mostra zero colonie, implica che tutte le colonie hanno il plasmide che trasporta resistenza agli antibiotici. Tuttavia, se è richiesta la PCR delle colonie, le condizioni ottimizzate qui esposte possono aumentare notevolmente il successo.
Figura 4: PCR di colonia di L. reuteri trasformato. (A) Le colonie di L. reuteri DSM20016 sono state sottoposte a screening per bande PCR positive; sei sono stati ottenuti e inoculati in brodo MRS fresco autoclavato. I campioni di 5 μL prelevati in vari momenti dopo l'inoculazione sono stati nuovamente sottoposti a PCR ai livelli di diluizione indicati. I colori in ogni casella di tempo/diluizione indicano il successo del recupero della PCR: verde = banda corretta osservata; rosso = nessuna banda osservata. (B) I risultati di una diluizione fissa di 100x mostrano che la variazione della temperatura di preparazione ha comportato diversi tassi di successo della PCR: i campioni sono stati preparati su ghiaccio e PCR-ed immediatamente (89,77%), preparati a temperatura ambiente e PCR-ed immediatamente (75%), o preparati a RT quindi incubati a 37 °C per 30 minuti prima della PCR (27,27%). (C) (1) Otto campioni di diluizione 100x positivi (R1-8) dalla condizione RT. (2) Dopo essere stati lasciati a RT per 48 ore, i campioni sono stati sottoposti a PCR una seconda volta, mostrando un'assenza delle bande a ~ 1,1 kb; i controlli positivi e negativi (corsie +/-) sono le corsie più a destra in C (2). La scala utilizzata era di 1 kb più la scala del DNA, elencata nella tabella dei materiali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L. reuteri mini-prep
La mini-prep per L. reuteri è limitata e intesa solo come metodo alternativo di conferma della trasformazione plasmidica. Una precedente pubblicazione ha notato che alcuni ceppi sono più efficacemente lisati dalla mutanolisina22; La doppia azione lisozima-mutanolisina è risultata essere la più efficace per L. reuteri DSM20016. L'esecuzione del mini-eluato di preparazione attraverso un gel di agarosio si traduce in uno striscio piuttosto che in bande osservabili. La successiva PCR dovrebbe, tuttavia, produrre le dimensioni di banda previste (vedere Figura 5).
Figura 5: Elettroforesi su gel di agarosio di prodotti PCR e mini-prep. Le stesse sei colonie della Figura 4A sono state preparate utilizzando il protocollo descritto in questo documento. (Riga inferiore) Mini-prep eluate mostra una sbavatura. (Riga superiore) Dopo che la PCR è stata eseguita utilizzando l'eluente come modello di DNA, si osservano chiare bande positive. La scala utilizzata era di 1 kb più la scala del DNA, elencata nella tabella dei materiali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Efficienze di trasformazione di L. reuteri DSM20016 con plasmide pNZ123. Trasformazioni effettuate con pNZ123 (origine del cerchio di rotolamento pSH71), che non trasporta alcuna proteina reporter costitutiva esogena. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: file CAD per camere anaerobiche. Foglio 1: Disegno di base; Foglio 2: Disegno lungo della parete; Foglio 3: Disegno murale piccolo; Foglio 4: Disegno dall'alto; Foglio 5: Disegno del coperchio; Foglio 6: Disegno del labbro di blocco; Foglio 7: Disegno della barra di serraggio; Foglio 8: Disegno della piastra di morsetto; Foglio 9: Panoramica dell'assemblaggio; Foglio 10: Panoramica con parti numerate. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l'intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l'efficienza della trasformazione è ancora una limitazione della sperimentazione, poiché le colonie previste possono essere inferiori a una o due per piastra durante le trasformazioni (vedere la Figura 1).
Inizialmente sono stati utilizzati contenitori per alimenti commerciali che si sono rivelati insufficienti per un'esclusione coerente di O2. I file CAD per le camere anaerobiche progettate dall'officina meccanica dell'università sono disponibili nel file supplementare 1. Poiché queste scatole possono occasionalmente avere infiltrazioni d'aria attraverso piccoli spazi vuoti nella falegnameria, si consiglia di riempirle con acqua (non sigillata) per verificare eventuali perdite prima del primo utilizzo; I controlli successivi non sono generalmente necessari. Queste scatole dovrebbero avere sistemi di sostituzione O 2 piuttosto che sistemi di sequestro O2, in quanto non sono stati testati per la pressurizzazione.
Possono sorgere problemi con i media; Il brodo MRS autoclavato è selettivo ma possiede proprietà altamente autofluorescenti, ostacolando la misurazione di letture fluorescenti basse. La modifica per utilizzare il brodo MRS sterilizzato con filtro migliora questo problema, ma è meno selettiva. L. reuteri abbassa il pH del mezzo a circa pH 4 dopo 24 ore (vedi Figura 6), quindi il mezzo richiede un tamponamento per rilevare GFP23 sensibile agli acidi. Abbiamo modificato questo protocollo per utilizzare invece mCherry2 più resistente agli acidi, evitando questo problema.
Figura 6: pH nel tempo di L. reuteri nel brodo MRS. L. reuteri abbassa DSM20016 pH nel tempo (linea tratteggiata); il valore pKa indica il pH al quale la fluorescenza della proteina reporter sarebbe il 50% del valore massimo dovuto all'acidità (linee orizzontali). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Ogni proteina reporter ha un'efficacia reporter ridotta al 50% della fluorescenza massima in diversi punti temporali a causa della loro sensibilità acida quando prodotta all'interno di L. reuteri sempre più acido (linee verticali). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L. reuteri DSM20016 sembra inibire gli sforzi di PCR delle colonie, limitando fortemente l'utilità di questa procedura. Solo 30 minuti a 37 °C dopo la fase 4.3 possono aumentare il tasso di fallimento della PCR, mentre 48 ore a RT provocano un fallimento completo della PCR (vedi Figura 4B,C). La modifica per diluire i campioni e mantenere i campioni sul ghiaccio in ogni momento è fondamentale per aumentare il successo della PCR delle colonie.
Molto rimane sconosciuto sulle funzioni interne di L. reuteri DSM20016. Le piastre di controllo della trasformazione senza plasmide aggiunto durante l'elettroporazione, che mostrano zero colonie, dovrebbero implicare che tutte le colonie presenti nella condizione plasmidica possiedono il plasmide. Tuttavia, la successiva PCR delle colonie ha dimostrato di non confermare in modo affidabile l'assorbimento del plasmide anche con modifiche. Ciò potrebbe essere dovuto alla restrizione endonucleasi che degrada i frammenti di DNA della PCR. Le endonucleasi sono state riscontrate in altre specie di Lactobacillaceae e superate attraverso l'uso di dam-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 ha diversi enzimi putativi di modificazione della restrizione annotati tramite analisi computazionale24. Le efficienze di trasformazione di DSM20016 potrebbero potenzialmente essere ulteriormente aumentate se i suoi siti di riconoscimento enzimatico di modifica della restrizione (RM) potessero essere caratterizzati ed evitati. Sono necessarie ulteriori indagini.
Il metodo di elettroporazione modificato esposto in questo articolo offre un'alternativa meno complessa e più moderna a un metodo precedentemente descritto per L. reuteri DSM20016 da Ahrne et al.25. Il presente documento esamina le disposizioni significative fatte da Ahrne et al. riguardo ai requisiti di metilazione dam-/dcm- per l'assorbimento del plasmide, che non sono state confermate. Il metodo di trasformazione esposto in questo articolo sottolinea anche il requisito critico di crescita anaerobica dopo la placcatura, non esplicitamente trasmesso da Ahrne et al.
Alcuni metodi e approcci qui esposti possono essere utilizzati in applicazioni future per aiutare altri tentativi di manipolazione della famiglia delle Lactobacillaceae , in particolare: l'inclusione di piastre di controllo della trasformazione, l'uso del reporter resistente agli acidi mCherry2, i requisiti di temperatura della PCR delle colonie e l'inclusione della mutanolisina mini-preparazione. Tuttavia, alcuni potrebbero ancora aver bisogno di modifiche per funzionare in modo ottimale in altri ceppi.
L. reuteri DSM20016 è di importanza clinica e agricola a causa della sua posizione non solo come vertebrato commensale generico (con potenziali usi come additivo nell'alimentazione del bestiame), ma anche come uno dei pochissimi ceppi della famiglia delle Lactobacillaceae intrinsecamente associati all'ambiente intestinale umano8. Una manipolazione efficiente di questo microbo lo aprirà come telaio per la futura consegna di nuove terapie all'interno del tratto gastrointestinale e il monitoraggio non invasivo delle condizioni infiammatorie. In questo articolo, questi metodi sono stati esplicitamente raccolti e dimostrati collettivamente con modifiche per, in particolare, il ceppo non modello di L. reuteri DSM20016.
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Disclosures
Non esistono conflitti di interesse.
Acknowledgments
Apprezziamo molto i preziosi consigli forniti dal Prof. J.P. van Pijkeren (Università del Wisconsin-Madison), la cui guida sul lavoro con L. reuteri ATCC PTA 6475 ha fornito una base per i metodi qui descritti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
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