Summary
Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.
Abstract
Lactobacillus waren eine unglaublich große, vielfältige Bakteriengattung mit 261 Arten, von denen einige kommensale Stämme waren, die das Potenzial hatten, als Chassis für synthetische biologische Unternehmungen im Magen-Darm-Trakt verwendet zu werden. Die große phänotypische und genotypische Variation, die innerhalb der Gattung beobachtet wurde, führte zu einer kürzlichen Neuklassifizierung und der Einführung von 23 neuen Gattungen.
Aufgrund der Breite der Variationen innerhalb der alten Gattungen kann es vorkommen, dass Protokolle, die in einem Mitglied nachgewiesen wurden, bei anderen Mitgliedern nicht so funktionieren, wie es angekündigt wurde. Der Mangel an zentralisierten Informationen darüber, wie bestimmte Stämme genau manipuliert werden können, hat zu einer Reihe von Ad-hoc-Ansätzen geführt, die oft von anderen Bakterienfamilien übernommen wurden. Dies kann die Sache für Forscher, die auf diesem Gebiet beginnen, erschweren, da sie möglicherweise nicht wissen, welche Informationen auf die von ihnen gewählte Sorte zutreffen und welche nicht.
In diesem Artikel wollen wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesenem Erfolg zentralisieren, insbesondere in der Limosilactobacillus reuteri-Stammbezeichnung F275 (andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit Ratschlägen zur Fehlerbehebung und häufigen Problemen, auf die man stoßen kann. Diese Protokolle sollten es einem Forscher mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Arbeit mit L. reuteri DSM20016 ermöglichen, ein Plasmid zu transformieren, die Transformation zu bestätigen und die Systemrückkopplung in einem Plattenleser über ein Reporterprotein zu messen.
Introduction
Die Gattung Lactobacillus wurde historisch als grampositive, stäbchenförmige, nicht sporenbildende Anaerobier oder Mikroaerophile klassifiziert, die Zucker abbauen, um hauptsächlich Milchsäure zu produzieren1. Diese lockeren Kriterien führten dazu, dass Lactobacillus phänotypisch und genotypisch eine äußerst vielfältige Gattung ist. Diese breite Kategorisierung führte dazu, dass die Gattung neu klassifiziert wurde und im Jahr 2020 23 neue Gattungen eingeführt wurden2.
Die alte, breitere Gattung umfasste wichtige kommensale und probiotische Arten, die allgemein als sicher für den Verzehr angesehen werden (GRAS)3. Die Familie der Lactobacillaceae wird in der Öffentlichkeit aufgrund vieler berichteter gesundheitlicher Vorteile, die durch den Verzehrverschiedener Stämme erzielt werden, als "gute Bakterien" wahrgenommen 4,5,6,7. Die Leichtigkeit, mit der sie sich im Magen-Darm-Trakt zurechtfinden 8, und ihre öffentliche Akzeptanz machen Lactobacillaceae-Stämme zu starken Kandidaten als Chassis-Organismen für einnehmbare medizinische, therapeutische oder diagnostische Anwendungen.
Das breite Spektrum an Merkmalen, die innerhalb der Familie der Lactobacillaceae vorhanden sind, hat zu einer Situation geführt, in der es de facto keinen Modellorganismusstamm gibt; Forschungsgruppen tendieren dazu, Arten mit den Eigenschaften auszuwählen, die für ihre jeweiligen Ziele am relevantesten sind. (Zum Beispiel könnten Milchfermentationslabore L. lactis auswählen; Studien zur pflanzlichen Fermentation könnten L. plantarum auswählen; die Forschung an Probiotika könnte sich auf L. acidophilus konzentrieren; und so weiter.)
Dieselbe breite Palette von Merkmalen über alle Arten hinweg hat zu einer Anhäufung von Protokollen und Verfahren geführt, die für eine Untergruppe der Lactobacillaceae-Familie gut funktionieren können, aber bei anderen optimiert werden müssen, um effizient zu funktionieren (oder vielleicht überhaupt zu funktionieren)9. Dieser Optimierungsbedarf zwischen Familienmitgliedern und sogar innerhalb von Mitgliedern derselben Art kann die Bemühungen unbekannter Forscher vereiteln. Protokolle, die in den Methodenabschnitten von Artikeln veröffentlicht werden, können auch ihre eigenen Modifikationen10 enthalten, was zu fragmentierten, dezentralen Protokollsammlungen führt.
L. reuteri gilt als weit verbreiteter Wirbeltier-Kommensal, der durchweg im Magen-Darm-Trakt von Säugetieren, Vögeln11 und Fischen12 vorkommt. L. reuteri-Unterstämme sind oft genetisch spezialisiert, indem sie sich an Schleimadhäsionsproteine anpassen, um bestimmte einheimische Wirte dauerhafter zu besiedeln 8,11,13. Limosilactobacillus-Arten aus dem Magen-Darm-Trakt können in Wirten außerhalb ihres heimischen Wirts isoliert werden, tendieren aber eher zu einer vorübergehenden Natur8.
Aufgrund der Spezialisierung von Mensch und Wirt positioniert sich L. reuteri DSM20016 sehr gut als Chassis für diagnostische oder therapeutische Anwendungen an jedem Punkt des menschlichen Magen-Darm-Trakts, und der Stamm DSM20016 könnte im Vergleich zu transitorischen Stämmen ein länger anhaltendes Wirkungsfenster für Interventionen bieten.
In diesem Artikel skizzieren wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesener Wirksamkeit bei Limosilactobacillus reuteri (Stammbezeichnung: F275; andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit zentralisierten Informationen über den Stamm aus anderen Quellen, um molekular- und systembiologische Anwendungen zu unterstützen. Die hier beschriebenen Verfahren sollten es einem Forscher ohne vorherige Erfahrung ermöglichen, L. reuteri zu kultivieren, elektrokompetente Bestände zu schaffen, transformierte Kolonien auszuwählen, die Transformation durch die Koloniepolymerase-Kettenreaktion (PCR) zu bestätigen und die geplante Systemantwort über fluoreszierende Reporterproteine zu messen.
Wir stellen fest, dass verwandte Protokolle die CRISPR-Cas9-unterstützte ssDNA-Genom-Rekombinierung in L. reuteri (Stamm: ATCC-PTA-6475)14 und die CRSIPR-Cas9-Nickase-unterstützte Genomeditierung in mehreren nicht-L. reuteri, Lactobacillaceae-Familienfärbungen 15,16; Diese befassen sich jedoch nicht mit dem Stamm L. reuteri DSM20016, auf den wir uns hier konzentrieren.
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Protocol
1. Herstellung von L. reuteri DSM20016 elektrokompetente Zellen
HINWEIS: Dies basiert auf einem Protokoll von Berthier et al.17, wobei die Zentrifugationsgeschwindigkeiten von Rattanachaikunsopon et al.18. Der Teufel
- In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen L. reuteri aus dem Glycerinvorrat in 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS)-Brühe beimpfen. Aerob über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
- Am nächsten Morgen werden 4 ml der Nachtkultur in 200 ml MRS-Brühe (1:50 Verdünnung) geimpft.
- In einem statischen Inkubator bei 37 °C aerob wachsen lassen, bis der optische Dichtewert von 600 nm (OD600) 0,5-0,85 erreicht; Dies sollte etwa 2-3 Stunden dauern.
- Sobald ein adäquater OD600-Wert erreicht ist, wird das Medium in 50-ml-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und unter Auswuchten der Röhrchen auf Eis gelegt.
- 5 min bei 5.000 x g in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 4 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 ml vorgekühltem (0 °C bis 4 °C) ddH2O und zentrifugieren Sie erneut mit den gleichen Einstellungen wie im vorherigen Schritt. Bewahren Sie die Zellen so weit wie möglich auf Eis auf.
- Wiederholen Sie Schritt 1.6.
- Resuspendieren Sie jedes Pellet in 25 mlddH2O: 0,5 M Saccharose, 10 % Glycerin. Zentrifugieren bei 5.000 x g bei 4 °C für 10 min. Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie die Zellen wieder auf Eis.
- Resuspendieren Sie alle Pellets in denselben 2 mlddH2O: 0,5 M Saccharose, 10% Glycerin.
- Aliquot in Portionen von 50 μl bis 100 μl in vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen; Für die spätere Verwendung bei -80 °C lagern.
2. Elektroporation von L. reuteri
HINWEIS: Vermeiden Sie in den folgenden Schritten das Pipettieren so weit wie möglich. Der Einbau einer Kontrollelektroporation ohne Zusatz von Plasmid wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die Antibiotikaauswahl angemessen ist.
- Nehmen Sie ein ganzes elektrokompetentes L. reuteri aliquot und tauen Sie es auf Eis auf.
- Mischen Sie vorsichtig 5 μl bis 10 μl Plasmid (Endplasmidkonzentration >6 nM) in das aufgetaute Aliquot und vermeiden Sie das Pipettieren so weit wie möglich.
- In eine eisgekühlte Elektroporationsküvette mit 1 mm Spalt überführen.
- Elektroporat bei 1,25 kV, 400 Ω und 25 μF.
- Fügen Sie 1 ml MRS-Brühe bei Raumtemperatur (RT) hinzu und mischen Sie, indem Sie die Küvette ein- oder zweimal umdrehen.
- Legen Sie die Küvetten für 2,5-3 h in einen statischen Inkubator bei 37 °C, damit sie sich erholen können.
- Verteilen Sie die gesamte Menge auf mehrere MRS-Agarplatten mit entsprechender Auswahl.
- Stellen Sie die Teller in einen vollständig luftdichten Behälter mit einer kleinen brennenden Kerze ("Teelicht") und einem anaeroben Atmosphärenbeutel.
- Wachsen Sie bei 37 °C für 2-3 Tage oder bis sichtbare Kolonien vorhanden sind.
3. Messung des säureresistenten fluoreszierenden Reporterproteins mCherry2
- Wählen Sie alle für die Messung erforderlichen Kolonien aus und beimpfen Sie sie in eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit 1,5 ml filtersterilisierter (nicht autoklavierter) MRS-Brühe pro Vertiefung und einem geeigneten Auswahlantibiotikum.
- Aerob 24 h über Nacht bei 37 °C ohne Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Diese Mikrotiterplatte sollte für die Verwendung in Abschnitt 4 (Kolonie-PCR) aufbewahrt werden. - L. reuteri fällt in der stationären Phase aus dem Medium aus; Resuspendieren Sie die Kultur über Nacht durch Pipettieren.
- Übertragen Sie 200 μl in eine flache 96-Well-Platte mit klarem Boden, übertragen Sie die Platte auf ein Plattenlesegerät und messen Sie den Außendurchmesser und die Fluoreszenz von mCherry2 (Anregung [Ex]: 589 nm; Emission [Em]: 610 nm) oder anderen relevanten Reportern.
4. Bestätigung der Plasmidaufnahme mittels Kolonie-PCR
- Von der 96-Well-Speichermikrotiterplatte aus Abschnitt 3 werden 5 μl in ein PCR-Röhrchen überführt.
HINWEIS: Wenn >5 Minuten vergangen sind, kann es notwendig sein, den L. reuteri ein zweites Mal zu resuspendieren. - In einer tragbaren Tischmikrozentrifuge nach unten schleudern, bis das Pellet sichtbar ist (ca. 2 min bei 2.000 x g), den Überstand verwerfen und das Pellet in 20 μl 20 mM NaOH resuspendieren.
- Bei 95 °C 5 min kochen, vortexen und das Kochen ein zweites Mal wiederholen.
- Kühlen Sie die Proben sofort; Versuchen Sie, die Proben in den folgenden Schritten so weit wie möglich auf Eis zu halten, um die Wahrscheinlichkeit einer Template-Degradation und PCR-Inhibition zu verringern.
- In einer tragbaren Tisch-Mikrozentrifuge bei 2.000 x g 2 min lang herunterschleudern, bis die Zelltrümmer pelletiert sind, dann 1 μl des Überstands nehmen und zu 99 μl eiskaltem DNase- und RNase-freiemddH2O(100-fache Verdünnung) verdünnen.
- Verwenden Sie die 100-fache Verdünnung als Template-DNA in einer Standard-PCR-Reaktion unter Verwendung plasmidspezifischer Primer. Fügen Sie eine Positivkontrolle mit einem Plasmid hinzu, das aus dem E. coli-Minipräparat gewonnen wurde.
- Geben Sie die Proben auf Eis zurück und fügen Sie einen geeigneten Beladungsfarbstoff in einer Konzentration von 1x hinzu.
- 1%iges Agarosegel in TAE-Puffer (Trisacetat-Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) bei 110 V für 30 min laufen lassen. Bild bei Bedarf.
5. Mini-Prep-Protokoll für L. reuteri , gefolgt von PCR zur Bestätigung des Plasmidvorhandenseins
HINWEIS: Das Protokoll ist für die Verwendung mit dem Mini-Vorbereitungskit vorgesehen, das in der Materialtabelle aufgeführt ist.
- L. reuteri wird in 10 ml MRS-Brühe mit einem geeigneten Antibiotikum geimpft und über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator aerob inkubiert.
- Bei 5.000 x g für 10 min in einer vorgekühlten 4 °C-Zentrifuge zentrifugieren.
- Waschen Sie das Pellet in 2 ml Standard-P1-Puffer (im Lieferumfang enthalten), um Säure zu vermeiden, die spätere Schritte beeinträchtigen könnte, zentrifugieren Sie mit der gleichen Einstellung wie zuvor beschrieben und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 250 μl modifiziertem P1-Puffer, der 10 mg/ml Lysozym und 100 U/ml Mutanolysin enthält, um die Bakterienzellen zu lysieren. 1-2 h bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie 250 μl Puffer P2 hinzu, mischen Sie durch vier- bis sechsmaliges Invertieren und inkubieren Sie bei RT nicht länger als 5 Minuten.
- Fügen Sie 350 μl Puffer N3 (im Lieferumfang enthalten) hinzu und drehen Sie ihn sofort vier- bis sechsmal vorsichtig um, um ihn zu mischen.
- Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min.
- Übertragen Sie so viel Überstand wie möglich in eine Schleudersäule und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Waschen Sie die Schleudersäule mit 500 μl Puffer PB (im Lieferumfang enthalten) und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Waschen Sie die Schleudersäule mit 750 μl PE-Puffer (im Lieferumfang enthalten) und zentrifugieren Sie sie 60 s lang bei 10.000 x g . Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie ihn 60 Sekunden lang, um den verbleibenden Puffer zu entfernen.
- Setzen Sie die Spin-Säule in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. 20-30 μL DNAse- und RNAse-freies ddH 2 O auf den Filter der Spin-Säule geben und1-2min ruhen lassen, dann 60 s bei 10.000 x g zentrifugieren.
- Führen Sie eine Standard-PCR-Reaktion mit plasmidspezifischen Primern (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) durch, wobei das Eluat die Template-DNA liefert. Fügen Sie eine Positivkontrolle mit einem Plasmid hinzu, das aus dem E. coli-Minipräparat gewonnen wurde.
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten PCR-Einstellungen sind: 98 °C für 5 min, (98 °C für 30 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 45 s) 30 Zyklen, 72 °C für 2 min, 4 °C halten. Die Parameter hängen stark von der verwendeten Polymerase, der Fragmentlänge und den genauen Primern ab, die von jeder Person verwendet werden, die dieses Protokoll verwendet.
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Representative Results
Effizienz der Transformation
L. reuteri benötigt kein dcm-/dam-nicht-methyliertes Plasmid, wie es bei anderen Lactobacillaceaebeobachtet wurde 19,20 (siehe Abbildung 1). Die Elektroporation von L. reuteri DSM20016 mit 10 μL des 8,5 kb Plasmids pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 Theta-Ursprung der Replikation) sollte Transformationseffizienzen von etwa 80 koloniebildenden Einheiten (KBE)/μg (fünf bis acht Kolonien pro 200 μl plattiert) ergeben, unabhängig von der Plasmidmethylierungsbedingung. Durch selektive Aushärtung und Retransformation ist es möglich, mutierte L. reuteri-Stämme mit weitaus höheren Transformationseffizienzen21 zu erhalten, die mit pTRKH3_mCherry2 von etwa 4 x 103 KBE/μg (200-250 Kolonien pro 200 μl plattiert) beobachtet wurden, was Anwendungen mit höherem Durchsatz ermöglicht. Ähnliche Ergebnisse wurden auch für den Reporter mTFP1 beobachtet. Transformationen wurden auch mit pNZ123 (pSH71-Rollkreisursprung) durchgeführt, das kein exogenes konstitutives Reporterprotein trug, was zu Transformationseffizienzen von 3 x 104 KBE/μg DNA führte (ergänzende Abbildung 1).
Abbildung 1: Wirkungsgrade der Elektroporation. Insgesamt wurden 10 nM pTRKH3_mTFP1 und 80 nM pTRKH3_mCherry2 Plasmidbestände aus zwei Quellen gewonnen: DH10β E. coli und dcm-/Dam-Methylase-Knockout-E. coli. L. reuteri wurde dann mit 10 μL der beiden verschiedenen Methylierungsmuster-Plasmide elektroporiert und die Kolonien gezählt. Fehlerbalken bezeichnen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wachstumsbedingungen für die Transformation
L. reuteri ist aerotolerant und kann unter normalen atmosphärischen Bedingungen in Brühe und auf Agar angebaut werden. Der Erfolg der Transformation hängt jedoch stark von der Erzeugung einer anaeroben Wachstumsumgebung ab, wenn sie plattiert wird. Sie ist vielleicht die wichtigste Voraussetzung für den Erfolg der Transformation. O2-Leckagen können durch Einschluss einer Platte mit nicht transformiertem L. reuteri detektiert werden. Die Koloniemorphologie ändert sich in Gegenwart von Sauerstoff merklich (siehe Abbildung 2); alternativ können auch anaerobe Indikatoren verwendet werden (siehe Materialtabelle).
Abbildung 2: Morphologie der Kolonie von L. reuteri. Kolonien, die mit dem pTRKH3_mCherry2 Plasmid transformiert wurden. (A) Unter Bedingungen mit niedrigemO2-Gehalt erscheinen die Kolonien weiß, undurchsichtig, glatt, rund, konvex und glänzend. (B) Unter partiellen oder undichtenO2-Bedingungen erscheinen die Kolonien weiß, undurchsichtig, wellenförmig (gewellt), rund, umbonat (gerundet/knorrig) und glänzend. (C) L. reuteri-Kolonien ohne Plasmidtransformation unter atmosphärischemO2-Gehalt . Die Kolonien erscheinen entweder undurchsichtig oder durchscheinend und entweder umbonat oder flach; Sie erscheinen immer gelappt, rund und trocken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Reporter-Protein-Messung
Die Expression und das Wachstum des Reporterproteins von L. reuteri vom Wildtyp DSM20016 variieren zwischen den Kolonien (siehe Abbildung 3A), was genaue Rückschlüsse auf die Systemaktivität erschwert. Es ist möglich, korrekt transformierte Wildtyp-L. reuteri-DSM20016 zu selektieren und zu heilen; Die Rücktransformation kann zu Stämmen mit Mutationen führen, die eine höhere Umwandlungseffizienz ermöglichen. Ein Stamm, der mit dieser Methode entwickelt wurde, schien in Bezug auf die Expression von Reporterproteinen weitaus stabiler zu sein (siehe Abbildung 3B). Es ist ratsam, solche Mutationen durch Plasmidhärtung und Retransformation zu suchen, bevor Arbeiten durchgeführt werden, die eine abgestimmte Proteinexpression erfordern.
Abbildung 3: Wachstums-, Reporterfluoreszenz- und Kolonie-PCR-Ergebnisse für transformierte L. reuteri. In beiden Experimenten wird pTRKH3_mCherry2 Plasmid bei 80 nM verwendet. (A,B) Jede Spalte in jedem der drei Teildiagramme bezieht sich auf den OD-Wert derselben Kolonie, den Fluoreszenzwert (z. B. 589 nm; Em: 610 nm) und PCR-Ergebnis (durchgezogener Block zeigt die richtige beobachtete Bande an). (A) Alle Kolonien von L. reuteri DSM20016 Transformation ausgewählt (Kontrolltransformation = null Kolonien). Die Kolonien wurden 24 h lang in gefilterter MRS-Brühe inkubiert, bevor sie mit einer Verstärkung von 100 gemessen wurden. (B) Insgesamt 88 Kolonien, die aus dem Stamm von L. reuteri DSM20016 ausgewählt wurden, um eine höhere Transformationseffizienz, eine konsistentere Reporterproteinproduktion und eine geringere PCR-Inhibition (Kontrolltransformation = null Kolonien) zu erzielen. Die Kolonien wurden 24 h lang in gefilterter MRS-Brühe inkubiert, bevor sie mit einer Verstärkung von 200 gemessen wurden. Die Kontrollen sind blau dargestellt, C = nicht transformierte DSM20016 Zellkontrolle, M = reine Medienkontrolle mit gefilterter MRS-Brühe, und Fehlerbalken stehen für die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
PCR von Kolonien
Die Kolonie-PCR sollte nicht als alleiniges Mittel zur Ableitung der korrekten Transformation verwendet werden, da sie selbst dann unzuverlässig sein kann, wenn die Proben verdünnt und gekühlt aufbewahrt werden (siehe Abbildung 4). Wenn die No-Plasmid-Kontrolle, die den Transformationen beigefügt ist, keine Kolonien aufweist, bedeutet dies, dass alle Kolonien das Plasmid aufweisen, das eine Antibiotikaresistenz trägt. Wenn jedoch eine Kolonie-PCR erforderlich ist, können die hier dargelegten optimierten Bedingungen den Erfolg erheblich steigern.
Abbildung 4: Kolonie-PCR von transformiertem L. reuteri. (A) L. reuteri DSM20016 Kolonien wurden auf positive PCR-Banden untersucht; sechs wurden gewonnen und in frische, autoklavierte MRS-Bouillon geimpft. Proben von 5 μl, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation entnommen wurden, wurden erneut in den angegebenen Verdünnungsgraden einer PCR unterzogen. Farben in jedem Zeit-/Verdünnungsfeld zeigen den Erfolg der PCR-Wiederherstellung an: grün = richtige Bande beobachtet; rot = keine Bande beobachtet. (B) Die Ergebnisse für eine feste 100-fache Verdünnung zeigen, dass die Variation der Präparationstemperatur zu unterschiedlichen PCR-Erfolgsraten führte: Die Proben wurden auf Eis vorbereitet und sofort PCR-behandelt (89,77 %), bei Raumtemperatur und sofort PCR-behandelt (75 %) oder bei RT vorbereitet und dann 30 Minuten vor der PCR bei 37 °C inkubiert (27,27 %). (C) (1) Acht positive Proben mit 100-facher Verdünnung (R1-8) aus der RT-Bedingung. (2) Nachdem die Proben 48 h lang bei RT belassen worden waren, wurden sie ein zweites Mal PCR-behandelt und zeigten ein Fehlen der Banden bei ~1,1 kb; Positiv- und Negativkontrollen (Fahrspuren +/-) sind die Fahrspuren ganz rechts in C (2). Die verwendete Leiter war 1 kb zuzüglich der DNA-Leiter, die in der Materialtabelle aufgeführt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
L. reuteri mini-prep
Mini-Prep für L. reuteri ist begrenzt und nur als alternative Methode zur Bestätigung der Plasmidtransformation gedacht. In einer früheren Veröffentlichung wurde festgestellt, dass einige Stämme durch Mutanolysin22 effektiver lysiert werden; Die duale Wirkung von Lysozym-Mutanolysin erwies sich bei L. reuteri DSM20016 als die wirksamste. Das Mini-Prep-Eluat durch ein Agarose-Gel führt zu einem Abstrich und nicht zu beobachtbaren Banden. Eine anschließende PCR sollte jedoch die erwarteten Bandengrößen ergeben (siehe Abbildung 5).
Abbildung 5: Agarose-Gelelektrophorese von PCR- und Mini-Prep-Produkten. Die gleichen sechs Kolonien aus Abbildung 4A wurden unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Protokolls minipräpariert. (Untere Reihe) Mini-Prep-Eluat zeigt einen Abstrich. (Obere Reihe) Nach der PCR mit dem Eluant als DNA-Vorlage werden deutliche positive Banden beobachtet. Die verwendete Leiter war 1 kb zuzüglich der DNA-Leiter, die in der Materialtabelle aufgeführt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Transformationseffizienzen von L. reuteri DSM20016 mit dem pNZ123-Plasmid. Transformationen, die mit pNZ123 (pSH71-Rolling-Circle-Ursprung) durchgeführt wurden, das kein exogenes konstitutives Reporterprotein trägt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 1: CAD-Dateien für anaerobe Kammern. Blatt 1: Grundzeichnung; Blatt 2: Lange Wandzeichnung; Blatt 3: Kleine Wandzeichnung; Blatt 4: Zeichnung von oben; Blatt 5: Deckelzeichnung; Blatt 6: Zeichnung der Sperrlippe; Blatt 7: Spannstangenzeichnung; Blatt 8: Klemmplattenzeichnung; Blatt 9: Montageübersicht; Blatt 10: Übersicht mit nummerierten Teilen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der kritischste Schritt für die Transformation von L. reuteri DSM20016 ist die Erzeugung von anaeroben Wachstumsbedingungen nach der Transformation; Kolonien, die unter aeroben Bedingungen gewonnen werden, sind nur sehr selten und wachsen im Allgemeinen nicht, wenn sie in MRS-Brühe geimpft werden. Die Beschichtung des gesamten Erholungsvolumens sollte ebenfalls geübt werden, um die Wahrscheinlichkeit des Koloniewachstums zu maximieren. Selbst mit diesen beiden kritischen Schritten ist die Transformationseffizienz immer noch eine Einschränkung für Experimente, da die erwarteten Kolonien während der Transformationen nur ein oder zwei pro Platte betragen können (siehe Abbildung 1).
Ursprünglich wurden handelsübliche Lebensmittelbehälter verwendet, die sich für einen konsequentenO2-Ausschluss als unzureichend erwiesen. CAD-Dateien für anaerobe Kammern, die von der Maschinenwerkstatt der Universität konstruiert wurden, finden Sie in der Ergänzungsdatei 1. Da bei diesen Boxen gelegentlich Luft durch kleine Lücken in der Tischlerei eindringen kann, wird empfohlen, sie vor dem ersten Gebrauch mit Wasser (nicht abgedichtet) zu füllen, um sie auf Undichtigkeiten zu überprüfen. Nachträgliche Kontrollen sind in der Regel nicht notwendig. Diese Boxen sollten über O2-Ersatzsysteme und nicht überO2-Abscheidesysteme verfügen, da sie nicht auf Druckbeaufschlagung getestet wurden.
Medienprobleme können auftreten; Autoklavierte MRS-Bouillon ist selektiv, besitzt aber stark autofluoreszierende Eigenschaften, die die Messung niedriger Fluoreszenzwerte erschweren. Die Umstellung auf die Verwendung von filtersterilisierter MRS-Bouillon verbessert dieses Problem, ist aber weniger selektiv. L. reuteri senkt den pH-Wert des Mediums nach 24 h auf etwa pH 4 (siehe Abbildung 6), so dass das Medium gepuffert werden muss, um säureempfindliches GFP23 nachzuweisen. Wir haben dieses Protokoll geändert, um stattdessen säurebeständigeres mCherry2 zu verwenden, um dieses Problem zu vermeiden.
Abbildung 6: pH-Wert von L. reuteri im Zeitverlauf in MRS-Bouillon. L. reuteri senkt DSM20016 den pH-Wert im Zeitverlauf (gestrichelte Linie); Der pKa-Wert gibt den pH-Wert an, bei dem die Fluoreszenz des Reporterproteins aufgrund des Säuregehalts 50 % des Maximalwertes betragen würde (horizontale Linien). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Jedes Reporterprotein hat zu verschiedenen Zeitpunkten eine auf 50% der maximalen Fluoreszenz reduzierte Reportereffektivität, da es in zunehmend sauren L. reuteri (vertikale Linien) säureempfindlich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
L. reuteri DSM20016 scheint die PCR-Bemühungen von Kolonien zu hemmen, was die Nützlichkeit dieses Verfahrens stark einschränkt. Bereits 30 min bei 37 °C nach Schritt 4.3 können die PCR-Versagensrate erhöhen, während 48 h bei RT zu einem vollständigen PCR-Versagen führen (siehe Abbildung 4B,C). Die Modifikation, die Proben zu verdünnen und die Proben immer auf Eis zu halten, ist entscheidend für die Steigerung des Erfolgs der Kolonie-PCR.
Über die inneren Funktionen von L. reuteri DSM20016 ist noch viel unbekannt. Transformationskontrollplatten, denen während der Elektroporation kein Plasmid zugesetzt wurde und die keine Kolonien aufweisen, sollten implizieren, dass alle Kolonien, die im Plasmidzustand vorhanden sind, das Plasmid besitzen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die anschließende Kolonie-PCR die Plasmidaufnahme auch bei Modifikationen nicht zuverlässig bestätigt. Dies könnte auf Restriktionsendonukleasen zurückzuführen sein, die PCR-DNA-Fragmente abbauen. Endonukleasen wurden auch bei anderen Lactobacillaceae-Arten gefunden und durch den Einsatz von dam-/dcm-E.coli überwunden 19,20. L. reuteri DSM20016 hat mehrere mutmaßliche Restriktionsmodifikationsenzyme, die durch computergestützte Analyse24 annotiert wurden. Die Transformationseffizienz von DSM20016 könnte möglicherweise weiter gesteigert werden, wenn es gelingt, seine Restriktionsmodifikations-Enzymerkennungsstellen (RM) zu charakterisieren und zu vermeiden. Weitere Untersuchungen sind erforderlich.
Die in dieser Arbeit beschriebene modifizierte Elektroporationsmethode bietet eine weniger komplexe, modernere Alternative zu einer Methode, die zuvor von Ahrne et al. für L. reuteri DSM20016 beschrieben wurde.25. In diesem Beitrag werden wesentliche Festlegungen von Ahrne et al. bezüglich der dam-/dcm-Methylierungsanforderungen für die Plasmidaufnahme untersucht, die nicht bestätigt wurden. Die in dieser Arbeit beschriebene Transformationsmethode betont auch die kritische Anforderung an das anaerobe Wachstum nach dem Plattieren, die von Ahrne et al. nicht explizit vermittelt wird.
Einige der hier vorgestellten Methoden und Ansätze können in zukünftigen Anwendungen verwendet werden, um andere Manipulationsversuche der Lactobacillaceae-Familie zu unterstützen, insbesondere: die Einbeziehung von Transformationskontrollplatten, die Verwendung des säureresistenten Reporters mCherry2, die Anforderungen an die PCR-Temperatur der Kolonien und die Aufnahme von Mini-Prep-Mutanolysin. Einige benötigen jedoch möglicherweise noch Modifikationen, um bei anderen Sorten optimal zu funktionieren.
L. reuteri DSM20016 ist von klinischer und landwirtschaftlicher Bedeutung, da es nicht nur als generisches Wirbeltier-Kommensal (mit potenzieller Verwendung als Zusatzstoff in Viehfutter) gilt, sondern auch als einer der wenigen Stämme der Lactobacillaceae-Familie, die untrennbar mit der menschlichen Darmumgebung assoziiert sind8. Eine effiziente Manipulation dieser Mikrobe wird sie als Chassis für die zukünftige Bereitstellung neuartiger Therapien im Magen-Darm-Trakt und die nichtinvasive Überwachung von Entzündungszuständen öffnen. In diesem Artikel wurden diese Methoden explizit zusammengestellt und zusammen mit Modifikationen für den Nicht-Modell-L. reuteri-Stamm DSM20016 demonstriert.
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Disclosures
Es bestehen keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir schätzen die wertvolle Beratung durch Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), dessen Anleitung zur Arbeit mit L. reuteri ATCC PTA 6475 eine Grundlage für die hier beschriebenen Methoden bildete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
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