Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65463
Automatic Translation
1, 1
1University of Toronto Mississauga

Summary

Burada, Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ile çalışmak, büyümeyi, plazmid dönüşümünü, koloni PCR'sini, floresan muhabir protein ölçümünü ve sınırlı plazmid mini hazırlığını detaylandırmak için protokollerin yanı sıra yaygın sorunları ve sorun gidermeyi sunuyoruz. Bu protokoller, DSM20016'daki muhabir proteinlerinin ölçülmesine veya muhabir dahil değilse koloni PCR ile doğrulanmasına izin verir.

Abstract

Lactobacillus , birçoğu gastrointestinal sistem içindeki sentetik biyolojik çabalar için bir şasi olarak kullanılma potansiyeline sahip kommensal suşlar olan 261 türden oluşan inanılmaz derecede büyük, çeşitli bir bakteri cinsiydi. Cins içinde gözlenen geniş fenotipik ve genotipik varyasyon, yakın zamanda yeniden sınıflandırılmasına ve 23 yeni cinsin tanıtılmasına yol açmıştır.

Eski cins içindeki varyasyonların genişliği nedeniyle, bir üyede gösterilen protokoller diğer üyelerle ilan edildiği gibi çalışmayabilir. Belirli suşların tam olarak nasıl manipüle edileceğine dair merkezi bilgi eksikliği, genellikle diğer bakteri ailelerinden uyarlanan bir dizi geçici yaklaşıma yol açmıştır. Bu, hangi bilgilerin seçtikleri suş için geçerli olup olmadığını bilmeyen alanda başlayan araştırmacılar için sorunları karmaşıklaştırabilir.

Bu yazıda, özellikle Limosilactobacillus reuteri suşu tanımı F275'te (diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) başarı gösteren bir dizi protokolü, sorun giderme önerileri ve karşılaşılabilecek yaygın sorunlarla birlikte merkezileştirmeyi amaçlıyoruz. Bu protokoller, L. reuteri DSM20016 ile çalışma deneyimi çok az olan veya hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının bir plazmidi dönüştürmesini, dönüşümü doğrulamasını ve bir muhabir proteini aracılığıyla bir plaka okuyucusundaki sistem geri bildirimini ölçmesini sağlamalıdır.

Introduction

Lactobacillus cinsi tarihsel olarak gram-pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaeroblar veya öncelikle laktik asit1 üretmek için şekerleri parçalayan mikroaerofiller olarak sınıflandırılmıştır. Bu gevşek kriterler, Lactobacillus'un fenotipik ve genotipik olarak son derece çeşitli bir cins olmasına yol açtı. Bu geniş kategorizasyon, cinsin yeniden sınıflandırılmasına neden oldu ve 2020'de 23 yeni cins tanıtıldı2.

Eski, daha geniş cins, genellikle tüketim için güvenli (GRAS) olarak kabul edilen başlıca kommensal ve probiyotik türleri içeriyordu3. Lactobacillaceae ailesi, çeşitli suşların tüketimi yoluyla verilen birçok sağlık yararı nedeniyle halkın 'iyi bakteri' olma algısını sürdürmektedir 4,5,6,7. Gastrointestinal sistem8'de gezinme kolaylığı ve halkın kabulü, Lactobacillaceae suşlarını yutulabilir tıbbi, terapötik veya tanısal uygulamalar için şasi organizmaları kadar güçlü adaylar olarak konumlandırmak için birleşir.

Lactobacillaceae familyasında bulunan çok çeşitli özellikler, fiili model-organizma suşunun olmadığı bir duruma yol açmıştır; Araştırma grupları, kendi özel amaçlarıyla en alakalı özelliklere sahip türleri seçme eğilimindedir. (Örneğin, süt fermantasyon laboratuvarları L. lactis'i seçebilir; bitkisel fermantasyon çalışmaları L. plantarum'u seçebilir; probiyotikler üzerine yapılan araştırmalar L. acidophilus'a odaklanabilir; vb.)

Türler arasındaki bu aynı geniş özellik yelpazesi, Lactobacillaceae familyasının bir alt kümesi için iyi çalışabilecek, ancak diğerlerinde verimli bir şekilde çalışmak (veya belki de hiç çalışmamak) için optimizasyon gerektiren protokollerin ve prosedürlerin birikmesine yol açmıştır9. Aile üyeleri arasında ve hatta aynı türün üyeleri arasında bile optimizasyon ihtiyacı, yabancı araştırmacıların çabalarını boşa çıkarabilir. Makalelerin yöntemler bölümlerinde yayınlanan protokoller, parçalanmış, merkezi olmayan protokol koleksiyonlarına yol açan kendi modifikasyonlarını da içerebilir10.

L. reuteri, memeli, kuş11 ve balık12 gastrointestinal (GI) kanallarında tutarlı bir şekilde bulunan yaygın bir omurgalı kommensal olarak kabul edilir. L. reuteri alt suşları genellikle, mukus adezyon proteini adaptasyonu yoluyla, spesifik yerli konakçıları daha kalıcı olarak kolonize etmek için genetik olarak uzmanlaşmıştır 8,11,13. GI yolu Limosilactobacillus türleri, doğal konakçılarının dışındaki konakçılarda izole edilebilir, ancak geçici bir doğaya doğru daha fazla eğilimlidir8.

İnsan-konakçı uzmanlığı nedeniyle, L. reuteri DSM20016 kendisini insan GI kanalının herhangi bir noktasında tanısal veya terapötik uygulamalar için bir şasi olarak çok iyi konumlandırır ve gerinim DSM20016, daha geçici suşlara kıyasla müdahaleler için daha uzun süreli bir etki penceresi sağlayabilir.

Bu yazıda, Limosilactobacillus reuteri'de (suş tanımı: F275; diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) etkinliği kanıtlanmış bir dizi protokolün yanı sıra, moleküler ve sistem biyolojisi uygulamalarına yardımcı olmak için diğer kaynaklardan gelen suş hakkında merkezi bilgileri özetledik. Burada ortaya konan prosedürler, L. reuteri kültürüne daha önce hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının, elektroyetkin stoklar oluşturmasına, dönüştürülmüş kolonileri seçmesine, koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR ) yoluyla dönüşümü doğrulamasına ve floresan muhabir proteinleri aracılığıyla tasarlanmış sistem tepkisini ölçmesine olanak sağlamalıdır.

İlgili protokollerin L. reuteri'de (suş: ATCC-PTA-6475)14 CRISPR-Cas9 yardımlı ssDNA genom recombineringini ve çoklu L. reuteri'de CRSIPR-Cas9 nickaz destekli genom düzenlemesini kapsadığını not ettik. reuteri, Lactobacillaceae familyası lekeleri 15,16; ancak bunlar, burada odak noktamız olan L. reuteri DSM20016 suşu ele almamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. L. reuteri DSM20016 elektrokompetan hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu, Rattanachaikunsopon ve ark. tarafından bilgilendirilen santrifüjleme hızları ile Berthier ve ark.17 tarafından hazırlanan bir protokole dayanmaktadır.18.

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, L. reuteri'yi gliserol stoğundan 6 mL deMan Rogosa Sharpe (MRS) suyuna aşılayın. Statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
  2. Ertesi sabah, gece kültürünün 4 mL'sini 200 mL MRS suyuna (1:50 seyreltme) aşılayın.
  3. 600 nm optik yoğunluk değeri (OD600) 0.5-0.85'e ulaşana kadar statik bir 37 ° C inkübatörde aerobik olarak büyümesine izin verin; Bu yaklaşık 2-3 saat sürmelidir.
  4. Yeterli bir OD600 değerine ulaşılır ulaşılmaz, ortamı 50 mL santrifüj tüplerine boşaltın ve tüpleri dengelerken buzun üzerine yerleştirin.
  5. Önceden soğutulmuş, 4 °C santrifüjde 5.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  6. Süpernatanı atın, her bir pelet 50 mL önceden soğutulmuş (0 °C ila 4 °C) ddH2O'da tekrar askıya alın ve önceki adımla aynı ayarlarla tekrar santrifüj yapın. Hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.
  7. 1.6. adımı yineleyin.
  8. Her bir pelet 25 mL ddH2O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın. 10 dakika boyunca 4 °C'de 5.000 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve hücreleri tekrar buzun üzerine koyun.
  9. Tüm peletleri aynı 2 mL ddH2O: 0.5 M sakaroz,% 10 gliserol içinde tekrar askıya alın.
  10. Önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerinde 50 μL ila 100 μL porsiyonlara aliquot; Daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

2. L. reuteri'nin elektroporasyonu

NOT: Aşağıdaki adımlarda mümkün olduğunca pipetlemeden kaçının. Antibiyotik seçiminin yeterli olmasını sağlamak için plazmid eklenmemiş bir kontrol elektroporasyonunun dahil edilmesi önerilir.

  1. Tüm elektroyetkin L. reuteri aliquot'u alın ve buz üzerinde çözün.
  2. 5 μL ila 10 μL plazmidi (nihai plazmid konsantrasyonu >6 nM) çözülmüş aliquot'a yavaşça karıştırın ve pipetlemeyi mümkün olduğunca önleyin.
  3. Buz soğutmalı, 1 mm boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın.
  4. 1,25 kV, 400 Ω ve 25 μF'de elektroporat.
  5. 1 mL oda sıcaklığında (RT) MRS suyu ekleyin ve küveti bir veya iki kez ters çevirerek karıştırın.
  6. İyileşmeyi sağlamak için küvetleri 2,5-3 saat boyunca 37 ° C'de statik bir inkübatöre yerleştirin.
  7. Tüm miktarı uygun seçimle birden fazla MRS agar plakasına plakalayın.
  8. Tabakları, küçük yanan bir mum ("çay ışığı") ve anaerobik atmosfer oluşturan bir poşet ile tamamen hava geçirmez bir kabın içine yerleştirin.
  9. 37 ° C'de 2-3 gün boyunca veya görünür koloniler bulunana kadar büyütün.

3. Aside dayanıklı floresan muhabir proteini mCherry2'nin ölçümü

  1. Ölçüm için gerekli kolonileri seçin ve kuyu başına 1,5 mL filtre sterilize (otoklavlanmamış) MRS suyu ve uygun bir seçim antibiyotiği içeren 96 delikli bir depolama mikroplakasına aşılayın.
  2. Gece boyunca 24 saat boyunca 37 ° C'de titremeden aerobik olarak inkübe edin.
    NOT: Bu depolama mikroplakası, bölüm 4'te (koloni PCR) kullanılmak üzere saklanmalıdır.
  3. L. reuteri , durağan fazdayken medyadan çökelecektir; pipetleme yoluyla gecelik kültürü yeniden askıya alın.
  4. 200 μL'yi düz, şeffaf tabanlı, 96 delikli bir plakaya aktarın, plakayı bir plaka okuyucuya aktarın ve mCherry2'nin (uyarma [Ex]: 589 nm; emisyon [Em]: 610 nm) veya diğer ilgili muhabirlerin OD ve floresansını ölçün.

4. Koloni PCR ile plazmid alımının doğrulanması

  1. Bölüm 3'teki 96 delikli depolama mikroplakasından, 5 μL'yi bir PCR tüpüne aktarın.
    NOT: >5 dakika geçtiyse, L. reuteri'yi ikinci kez askıya almak gerekebilir.
  2. Portatif bir tezgah üstü mikrosantrifüjde, pelet görülebilene kadar aşağı doğru döndürün (2.000 x g'de kabaca 2 dakika), süpernatanı atın ve peleti 20 μL'lik 20 mM NaOH'da yeniden askıya alın.
  3. 95 ° C'de 5 dakika kaynatın, vorteks yapın ve kaynatmayı ikinci kez tekrarlayın.
  4. Numuneleri hemen soğutun; Şablon bozulması ve PCR inhibisyonu olasılığını azaltmak için aşağıdaki adımlarda örnekleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutmaya çalışın.
  5. Hücre enkazı peletlenene kadar 2 dakika boyunca 2.000 x g'de taşınabilir bir tezgah üstü mikrosantrifüjde döndürün, ardından süpernatantın 1 μL'sini alın ve 99 μL buz gibi soğuk DNaz ve RNaz içermeyen ddH2O'ya (100x seyreltme) seyreltin.
  6. Plazmid-spesifik primerler kullanarak standart bir PCR reaksiyonunda şablon DNA olarak 100x seyreltmeyi kullanın. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
  7. Numuneleri buz üzerinde geri koyun ve 1x konsantrasyonda uygun bir yükleme boyası ekleyin.
  8. TAE tamponunda (tris-asetat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA]) 30 dakika boyunca 110 V'ta% 1 agaroz jeli içinde çalıştırın. Gerekirse görüntü.

5. L. reuteri için mini hazırlık protokolü, ardından plazmid varlığını doğrulamak için PCR

NOT: Protokol, Malzeme Tablosunda listelenen mini hazırlık kiti ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

  1. L. reuteri'yi uygun bir antibiyotik içeren 10 mL MRS suyuna aşılayın ve statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
  2. Önceden soğutulmuş 4 °C santrifüjde 10 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj.
  3. Pelet, sonraki adımlara müdahale edebilecek asitliği ortadan kaldırmak için 2 mL standart P1 tamponunda (kit ile birlikte verilir) yıkayın, daha önce tarif edildiği gibi aynı ayarla santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
  4. Bakteri hücrelerini lize etmek için peleti 10 mg/mL lizozim ve 100 U/mL mutanolizin içeren 250 μL modifiye P1 tamponunda tekrar askıya alın. 37 ° C'de 1-2 saat inkübe edin.
  5. 250 μL tampon P2 ekleyin, dört ila altı kez ters çevirerek karıştırın ve RT'de 5 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
  6. 350 μL tampon N3 (kit ile birlikte verilir) ekleyin ve karıştırmak için hemen dört ila altı kez yavaşça ters çevirin.
  7. 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
  8. Bir spin kolonuna mümkün olduğunca fazla süpernatant aktarın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
  9. Sıkma kolonunu 500 μL tampon PB (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Akışı atın.
  10. Sıkma kolonunu 750 μL tampon PE (kit ile birlikte verilir) ile yıkayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Kalan tamponları gidermek için akışı atın ve 60 sn boyunca santrifüj yapın.
  11. Sıkma sütununu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Spin kolonunun filtresine 20-30 μL DNAse- ve RNAse-freeddH2O uygulayın ve 60 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapmadan önce 1-2 dakika bekletin.
  12. Plazmid-spesifik primerler (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) kullanarak standart bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin, eluate şablon DNA'yı sağlar. E. coli mini prep'ten türetilen bir plazmid ile pozitif bir kontrol ekleyin.
    NOT: Bu çalışmada kullanılan PCR ayarları şunlardır: 5 dakika boyunca 98 °C, (30 s için 98 °C, 30 s için 55 °C, 45 s için 72 °C) 30 döngü, 2 dakika boyunca 72 °C, 4 °C tutma. Parametreler, kullanılan polimeraz, parça uzunluğu ve bu protokolü kullanan herhangi bir kişi tarafından kullanılan kesin primerlere büyük ölçüde bağlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dönüşüm verimlilikleri
L. reuteri, diğer Lactobacillaceae19,20 için gözlemlendiği gibi dcm-/dam- metillenmemiş plazmid gerektirmez (bkz. Şekil 1). L. reuteri DSM20016'nin 8.5 kb plazmid pTRKH3_mCherry2'nin 10 μL'si (replikasyonun pAMβ1 teta kökeni) ile elektroporasyonu, plazmid metilasyon durumundan bağımsız olarak, kabaca 80 koloni oluşturan birimin (CFU) / μg'nin (200 μL kaplama başına beş ila sekiz koloni) dönüşüm verimliliğini sağlamalıdır. Seçici kürleme ve yeniden dönüşüm ile, kabaca 4 x 103 CFU / μg (200 μL kaplama başına 200-250 koloni) pTRKH3_mCherry2 ile gözlenen çok daha yüksek dönüşüm verimliliğine sahip mutasyona uğramış L. reuteri suşları elde etmek mümkündür21, daha yüksek verimli uygulamalara izin verir. Benzer sonuçlar muhabir mTFP1 için de gözlendi. Dönüşümler ayrıca ekzojen kurucu muhabir proteini taşımayan pNZ123 (pSH71 yuvarlanan daire orijinli) ile gerçekleştirildi ve 3 x 104 CFU / μg DNA'nın dönüşüm verimlilikleri ile sonuçlandı (Ek Şekil 1).

Figure 1
Şekil 1: Elektroporasyon verimlilikleri. İki kaynaktan toplam 10 nM pTRKH3_mTFP1 ve 80 nM pTRKH3_mCherry2 plazmid stoğu elde edildi: DH10β E. coli ve dcm-/dam- metilaz nakavt E. coli. L. reuteri daha sonra iki farklı metilasyon paterni plazmidinin 10 μL'si ile elektroponize edildi ve koloniler sayıldı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Dönüşüm büyüme koşulları
L. reuteri aero-toleranslıdır ve normal atmosferik koşullarda et suyunda ve agarda yetiştirilebilir. Bununla birlikte, dönüşüm başarısı büyük ölçüde kaplandığında anaerobik bir büyüme ortamının oluşturulmasına dayanır; dönüşüm başarısının belki de en önemli koşuludur. O2 sızıntıları, dönüştürülmemiş L. reuteri plakası dahil edilerek tespit edilebilir. Koloni morfolojisi oksijen varlığında gözle görülür şekilde değişir (bkz. Şekil 2); alternatif olarak, anaerobik göstergeler kullanılabilir (bakınız Malzeme Tablosu).

Figure 2
Resim 2: L. reuteri koloni morfolojisi. Koloniler pTRKH3_mCherry2 plazmid ile dönüştü. (A)Düşük O2 koşullarının düzeltilmesi, kolonilerin beyaz, opak, pürüzsüz, yuvarlak, dışbükey ve parlak görünmesi. (B) Kısmi veya sızdıranO2 koşulları altında, koloniler beyaz, opak, dalgasız (dalgalı), yuvarlak, umbonat (yuvarlak/topuzlu) ve parlak görünür. (C) AtmosferikO2 seviyeleri altında plazmid dönüşümü olmayan L. reuteri kolonileri. Koloniler opak veya yarı saydam ve umbonat veya düz görünür; her zaman lobat, yuvarlak ve kuru görünürler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Raporlayıcı protein ölçümü
Vahşi tip L. reuteri DSM20016 muhabir protein ekspresyonu ve büyümesi koloniler arasında farklılık gösterir (bkz. Şekil 3A), sistem aktivitesi üzerinde doğru çıkarımları zorlaştırır. Doğru şekilde dönüştürülmüş vahşi tip L. reuteri DSM20016 seçmek ve tedavi etmek mümkündür; Yeniden dönüşüm, daha fazla dönüşüm verimliliği sağlayan mutasyonlarla suşlara yol açabilir. Bu yöntemle geliştirilen bir suş, muhabir protein ekspresyonu açısından çok daha kararlı görünüyordu (bkz. Şekil 3B). Bu tür mutasyonların, ayarlanmış protein ekspresyonu gerektiren çalışmaları yapmadan önce, plazmid kürleme ve yeniden dönüşüm yoluyla aranması tavsiye edilir.

Figure 3
Şekil 3: Transforme L. reuteri için büyüme, muhabir floresansı ve koloni PCR sonuçları. Her iki deney de 80 nM'de pTRKH3_mCherry2 plazmid kullanıyor. (A,B) Üç alt grafiğin her birindeki her sütun, aynı koloninin OD değerini, floresan değerini (Ör: 589 nm; Em: 610 nm) ve PCR sonucu (katı blok gözlenen doğru bandı gösterir). (A) L. reuteri'den DSM20016 dönüşümü seçilen tüm koloniler (kontrol dönüşümü = sıfır koloni). Koloniler, 100 kazançta ölçüm yapmadan önce 24 saat boyunca filtrelenmiş MRS suyunda inkübe edildi. (B) Daha yüksek transformasyon verimlilikleri, daha tutarlı muhabir protein üretimi ve daha düşük PCR inhibisyonu (kontrol dönüşümü = sıfır koloni) için seçilen L. reuteri DSM20016 suşundan seçilen toplam 88 koloni. Koloniler, 200 kazanımda ölçüm yapmadan önce filtrelenmiş MRS suyunda 24 saat boyunca inkübe edildi. Kontroller mavi, C = dönüştürülmemiş DSM20016 hücresi kontrolü, M = filtrelenmiş MRS suyu yalnızca ortam kontrolü ve hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Koloni PCR
Koloni PCR'si, doğru dönüşümü çıkarmanın tek yolu olarak kullanılmamalıdır, çünkü numuneler seyreltildiğinde ve soğutulduğunda bile güvenilmez olabilirler (bkz. Şekil 4). Dönüşümlere dahil edilen plazmidsiz kontrol sıfır koloni sergiliyorsa, tüm kolonilerin antibiyotik direnci taşıyan plazmidlere sahip olduğu anlamına gelir. Bununla birlikte, koloni PCR'si gerekiyorsa, burada belirtilen optimize edilmiş koşullar başarıyı büyük ölçüde artırabilir.

Figure 4
Şekil 4: Transforme L. reuteri'nin koloni PCR'si. (A) L. reuteri DSM20016 kolonileri pozitif PCR bantları açısından tarandı; altı tanesi elde edildi ve taze otoklavlanmış MRS suyuna aşılandı. Aşılamadan sonra çeşitli zaman noktalarında alınan 5 μL'lik örnekler, belirtilen seyreltme seviyelerinde tekrar PCR'ye tabi tutuldu. Her seferinde / seyreltme kutusundaki renkler PCR geri kazanımının başarısını gösterir: yeşil = gözlenen doğru bant; kırmızı = bant gözlenmedi. (B) Sabit bir 100x seyreltme için elde edilen sonuçlar, hazırlama sıcaklığının değiştirilmesinin farklı PCR başarı oranlarına yol açtığını göstermektedir: numuneler hemen buz ve PCR-ed (% 89.77) üzerinde hazırlanmış, oda sıcaklığında hazırlanmıştır ve hemen PCR-ed (% 75) veya RT'de hazırlandıktan sonra PCR'den önce 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilmiştir (% 27.27). (C) (1) RT koşulundan sekiz pozitif 100x seyreltme örneği (R1-8). (2) RT'de 48 saat bekletildikten sonra, örnekler ikinci kez PCR-ed edildi ve ~ 1.1 kb'de bantların bulunmadığını gösterdi; pozitif ve negatif kontroller (+/-) C'deki en sağdaki şeritlerdir (2). Kullanılan merdiven 1 kb artı Malzeme Tablosunda listelenen DNA merdiveniydi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

L. reuteri mini hazırlık
L. reuteri için mini hazırlık sınırlıdır ve sadece alternatif bir plazmid transformasyon doğrulama yöntemi olarak tasarlanmıştır. Önceki bir yayın, bazı suşların mutazolizin22 tarafından daha etkili bir şekilde lize edildiğini belirtmiştir; dual lizozim-mutanolizin etkisinin L. reuteri DSM20016 için en etkili olduğu bulunmuştur. Mini prep elüatını bir agaroz jelinden geçirmek, gözlemlenebilir bantlardan ziyade bir yayma ile sonuçlanır. Bununla birlikte, sonraki PCR, beklenen bant boyutlarını üretmelidir (bkz. Şekil 5).

Figure 5
Şekil 5: PCR ve mini-prep ürünlerinin agaroz jel elektroforezi. Şekil 4A'daki aynı altı koloni, bu makalede belirtilen protokol kullanılarak mini olarak hazırlanmıştır. (Alt satır) Mini hazırlık elüatı bir leke gösterir. (Üst sıra) Elüant DNA şablonu olarak kullanılarak PCR yapıldıktan sonra, net pozitif bantlar gözlenir. Kullanılan merdiven 1 kb artı Malzeme Tablosunda listelenen DNA merdiveniydi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: L. reuteri DSM20016'nin pNZ123 plazmid ile dönüşüm verimlilikleri. Dönüşümler pNZ123 (pSH71 yuvarlanan daire orijinli) ile gerçekleştirilir ve eksojen kurucu muhabir proteini taşımaz. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Anaerobik odalar için CAD dosyaları. Sayfa 1: Temel çizim; Sayfa 2: Uzun duvar çizimi; Sayfa 3: Küçük duvar çizimi; Sayfa 4: Üst çizim; Sayfa 5: Kapak çizimi; Sayfa 6: Dudak çizimini kilitleyin; Sayfa 7: Kelepçe çubuğu çizimi; Sayfa 8: Kelepçe plakası çizimi; Sayfa 9: Montaja genel bakış; Sayfa 10: Numaralı parçalara genel bakış. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L. reuteri DSM20016'nin dönüşümü için en kritik adım, dönüşümler kaplandıktan sonra anaerobik büyüme koşullarının oluşturulmasıdır; Aerobik koşullarda kazanılan koloniler sadece çok nadirdir ve MRS suyunda aşılandığında genellikle büyüyemez. Koloni büyümesi olasılığını en üst düzeye çıkarmak için tüm geri kazanım hacminin kaplanması da uygulanmalıdır. Bu iki kritik adımda bile, dönüşüm verimliliği hala deneyler üzerinde bir sınırlamadır, çünkü beklenen koloniler dönüşümler sırasında plaka başına bir veya iki kadar düşük olabilir (bkz. Şekil 1).

Ticari gıda kapları başlangıçta kullanılmış ve tutarlıO2 dışlaması için yetersiz bulunmuştur. Üniversitenin makine atölyesi tarafından tasarlanan anaerobik odalar için CAD dosyaları Ek Dosya 1'de bulunabilir. Bu kutular zaman zaman doğramalardaki küçük boşluklardan hava sızmasına neden olabileceğinden, ilk kullanımdan önce herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için suyla (mühürsüz) doldurulması önerilir; sonraki kontroller genellikle gerekli değildir. Bu kutular, basınçlandırma için test edilmedikleri içinO2 ayırma sistemleri yerineO2 değiştirme sistemlerine sahip olmalıdır.

Medya sorunları ortaya çıkabilir; otoklavlanmış MRS suyu seçicidir, ancak düşük floresan okumalarının ölçümünü engelleyen yüksek oranda otofloresan özelliklere sahiptir. Filtre sterilize MRS suyu kullanmak için yapılan değişiklik bu sorunu iyileştirir, ancak daha az seçicidir. L. reuteri , ortamın pH'ını 24 saat sonra yaklaşık pH 4'e düşürür (bkz. Şekil 6), bu nedenle ortamın aside duyarlı GFP23'ü tespit etmek için tamponlama yapması gerekir. Bu protokolü, bu sorunu önlemek için bunun yerine daha aside dayanıklı mCherry2 kullanacak şekilde değiştirdik.

Figure 6
Şekil 6: MRS suyundaki L. reuteri'nin zaman içindeki pH'ı. L. reuteri DSM20016 zamanla pH'ı düşürür (kesikli çizgi); pKa değeri, raporlayıcı protein floresansının asitlik nedeniyle maksimum değerin% 50'si olacağı pH'ı gösterir (yatay çizgiler). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4.3, mCherry2 pKa = 3.3. Her muhabir proteini, giderek asidik L. reuteri (dikey çizgiler) içinde üretildiğinde asit hassasiyetleri nedeniyle farklı zaman noktalarında maksimum floresanlığın% 50'sine düşürülmüş muhabir etkinliğine sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

L. reuteri · DSM20016, koloni PCR çabalarını inhibe ediyor ve bu prosedürün yararlılığını ciddi şekilde sınırlıyor gibi görünmektedir. Adım 4.3'ten sonra 37 ° C'de 30 dakika kadar kısa bir süre PCR başarısızlık oranını artırabilirken, RT'de 48 saat tam PCR arızasına neden olabilir (bkz. Şekil 4B, C). Numuneleri seyreltmek ve numuneleri her zaman buz üzerinde tutmak için yapılan modifikasyon, koloni PCR başarısını arttırmak için kritik öneme sahiptir.

L. reuteri DSM20016'nin iç fonksiyonları hakkında çok şey bilinmemektedir. Elektroporasyon sırasında plazmid eklenmemiş, sıfır koloni gösteren transformasyon kontrol plakaları, plazmid durumunda bulunan herhangi bir koloninin plazmid'e sahip olduğu anlamına gelmelidir. Bununla birlikte, sonraki koloni PCR'sinin, modifikasyonlarla bile plazmid alımını güvenilir bir şekilde doğrulamadığı gösterilmiştir. Bunun nedeni, PCR DNA fragmanlarını parçalayan kısıtlama endonükleazları olabilir. Endonükleazlara diğer Lactobacillaceae türlerinde rastlanmış ve dam-/dcm-E.coli 19,20 kullanılarak aşılmıştır. L. reuteri · DSM20016, hesaplamalı analiz 24 ile ek açıklamalı birkaç varsayılan kısıtlama-modifikasyon enzimine sahiptir. DSM20016'nin transformasyon verimlilikleri, kısıtlama modifikasyonu (RM) enzim tanıma bölgeleri karakterize edilebilir ve önlenebilirse, potansiyel olarak daha da artabilir. Daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Bu makalede belirtilen modifiye elektroporasyon yöntemi, daha önce Ahrne ve ark. tarafından L. reuteri DSM20016 için tanımlanan bir yönteme daha az karmaşık, daha modern bir alternatif sunmaktadır.25. Bu yazıda Ahrne ve ark. tarafından plazmid alımı için dam-/dcm- metilasyon gereklilikleri ile ilgili olarak yapılan ve doğrulanmamış önemli hükümler araştırılmaktadır. Bu makalede belirtilen dönüşüm yöntemi, Ahrne ve ark. tarafından açıkça aktarılmayan, kaplamadan sonra kritik anaerobik büyüme gereksinimini de vurgulamaktadır.

Burada belirtilen bazı yöntemler ve yaklaşımlar, diğer Lactobacillaceae ailesi manipülasyon girişimlerine yardımcı olmak için gelecekteki uygulamalarda kullanılabilir, özellikle: dönüşüm kontrol plakalarının dahil edilmesi, aside dirençli muhabir mCherry2'nin kullanımı, koloni PCR sıcaklık gereksinimleri ve mini hazırlık mutanolizin dahil edilmesi. Bununla birlikte, bazıları diğer suşlarda en iyi şekilde çalışmak için hala modifikasyonlara ihtiyaç duyabilir.

L. reuteri · DSM20016, sadece jenerik bir omurgalı kommensal olarak (hayvan yemlerinde katkı maddesi olarak potansiyel kullanımları olan) değil, aynı zamanda insan bağırsak ortamıyla içsel olarak ilişkili çok az sayıda Lactobacillaceae-familya suşundan biri olarak konumu nedeniyle klinik ve tarımsal öneme sahiptir8. Bu mikrobun etkili bir şekilde manipüle edilmesi, onu GI kanalında yeni tedavilerin gelecekte sunulması ve enflamatuar durumların invaziv olmayan izlenmesi için bir şasi olarak açacaktır. Bu makalede, bu yöntemler açıkça harmanlanmış ve özellikle model olmayan L. reuteri suşu DSM20016 için modifikasyonlarla toplu olarak gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

L. reuteri ATCC PTA 6475 ile çalışma konusundaki rehberliği burada açıklanan yöntemler için bir temel oluşturan Prof. J.P. van Pijkeren (Wisconsin-Madison Üniversitesi) tarafından sağlanan değerli tavsiyeleri çok takdir ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder NEB N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes Thomas Scientific 1145J12
Agarose  BioShop AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) Beckman Allegra  N/A No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet Thermo Scientific OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system VWR 58017-984
Centrifuge tubes (50 mL) FroggaBio TB50-500
DNA gel x6 loading dye NEB B7024S
Electroporation cuvette Fisherbrand FB101
Erythromycin Millipore Sigma E5389-5G
Gel electroporation bath/dock VWR 76314-748
Glycerol  BioShop GLY001
Limosilactobacillus reuteri Leibniz Institute DSMZ DSM20016 Strain designation F275
Lysozyme BioShop LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) FroggaBio LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen) Qiagen 27106 slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated) Thermo Scientific CM0359B
Mutanolysin Millipore Sigma M9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma 1064691000
P100 Pipette Eppendorf 3123000047
P1000 Pipette Eppendorf 3123000063
P2.5 Pipette Eppendorf 3123000012
P20 Pipette Eppendorf 3123000039
P200 Pipette Eppendorf 3123000055
PCR tubes FroggaBio STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge Genlantis E200100
Petri dishes VWR 25384-088
PTC-150 Thermal Cycler MJ Research N/A No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified) Addgene 27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer Thermo Scientific 840-281700
Storage microplate Fisher Scientific 14-222-225
Sucrose BioShop SUC507
TAE Buffer 50x Thermo Scientific B49
Vortex VWR 58816-121 No longer in production
VWR 1500E incubator VWR N/A No longer in production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Tags

Biyomühendislik Sayı 196
<em>Limosilactobacillus reuteri</em> DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duggan, A., McMillen, D. Methods for … More

Duggan, A., McMillen, D. Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016. J. Vis. Exp. (196), e65463, doi:10.3791/65463 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter